ДНФ-аминокислот элюирование

Количественное определение аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге. Цель работы — определить концентрацию аминокислоты в анализируемом растворе методом колориметрического анализа раствора, полученного при элюировании хроматографического пятна. [c.529]

Разработка автоматических анализаторов аминокислот с применением ионообменников и элюированием буферными растворами с возрастающими значениями pH позволяет в настоящее время работать с приборами, производящими за несколько часов полный количественный анализ любого белка (для навески в 5 мг) с точностью до 1%. [c.509]

Часто целесообразно при разделении комбинировать электрофоретический и хроматографический методы. Для препаративных целей последним лучше проводить электрофорез, чтобы получить более компактные полосы и избежать возможной частичной деструкции некоторых аминокислот из-за кислотного гидролиза после элюирования с бумаги. [c.395]

В работе Гросса [5] описано получение S-этил-1-С -/-гомоци-стеина из йодистого этила-1- и 8-бензил-/-гомоцистеина. Исходное вещество (1,14 г), полученное из метионина через 8-бен-зил- /-гомоцистеин [6] и Ы-ацетил-5-бензил- /-гомоцистеин [7], восстанавливают металлическим натрием в жидком аммиаке, и образовавшийся меркаптид обрабатывают 0,63 г йодистого этила-ЬС Прибор для проведения реакции представляет собой модификацию прибора, о котором идет речь в примечании 2. Вещество, оставшееся после испарения аммиака, растворяют в воде, и полученный раствор подкисляют соляной кислотой до pH 1—2, затем этот раствор пропускают через колонку [8] (высота 2,5 м, диаметр 22 см), наполненную ионообменной смолой дауэкс-50 (степень сшивания 8%) с величиной зерен 200—400 меш. Фракции, содержащие продукт реакции, полученные при элюировании 2,5 н, соляной кислотой, объединяют и испаряют при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и с помощью раствора едкого натра создают среду с pH 6,2. Для очистки вещество сублимируют при температуре 180—200° и давлении 1 мм рт. ст. Выход 0,400 г (60%),[а]д + 23°, концентрация 1% в 2 н. растворе соляной кислоты. Методом бумажной хроматографии в системе бутиловый спирт — вода— уксусная кислота (10 5 2) или в системе третичный амиловый спирт — вода — пиридин (7 6 8) при температуре 22—25° на бумаге ватман № 4 показано, что вещество состоит из свободной аминокислоты и радиохимических примесей RjSi,61 и 0,61 соответственно. [c.218]

В настоящее время создано и испытано около десятка асимметрических силикагелевых сорбентов. Хотя в большинстве сорбентов использованы оптические изомеры пролина и оксипролина, они различаются сродством к различным аминокислотам и порядком их элюирования это связано с тем, что подвижный лиганд фиксируется в комплексе не только координацией карбоксильной и аминогруппой с ионом меди, но и взаимодействием бокового радикала аминокислоты с ближайшим окружением координационного центра, что определяет в конечном итоге порядок удерживания антиподов аминокислот сорбенте. [c.83]

В то время как амины и аминокислоты, несущие положительный заряд, более прочно удерживаются при более высоких значениях pH, для отрицательно заряженных сорбатов справедливо обратное. Систематические исследования, проведенные на серии N-бензоил-о, L-аминокислот, позволили глубже понять механизм взаимодействия сорбата с белком. Влияние изменения свойств подвижной фазы на величины к VI а демонстрирует рис. 7.10. Во-первых, удерживание в значительной степени возрастает с усилением гидрофобного характера аминокислоты (Ser > А1а> Phe). Во-вторых, увеличение суммарного отрицательного заряда белка с увеличением pH вызывает уменьшение к для всех шести соединений (вследствие ионного взаимодействия). Далее, влияние концентрации буфера можно объяснить усилением адсорбции вследствие ионных взаимодействий при низкой ионной силе. Небольшое, но вполне заметное возрастание к для наиболее сильно удерживаемых сорбатов при высоких концентрациях буфера вероятнее всего является результатом усиления гидрофобных взаимодействий. Поскольку ионные (кулоновские) и гидрофобные взаимодействия по-разному подвержены влиянию ионной силы, то оба эффекта приводят к возникновению минимума в адсорбции сорбата (к ) в определенной точке. И наконец, совершенно очевидно влияние органического растворителя-модификатора он всегда приводит к понижению удерживания сорбата и тем сильнее, чем более гидрофобен сорбат. Влияние pH и ионной силы на удерживание незаряженных соединений невелико, но выражено вполне отчетливо. Оно связано исключительно с изменениями в связывающем центре ХНФ. Добавление пропанола-1 вызывает уменьшение удерживания по сравнению с наблюдаемым у заряженных сорбатов, что свидетельствует о преимущественном вкладе в удерживание гидрофобных взаимодействий. Это подтверждает также наблюдаемое очень большое влияние на удерживание длины цепи алканола-1. Высшие спирты являются значительно более эффективными конкурентами за связывающий центр, а потому вызывают более быстрое элюирование сорбата. Возможность регулирования удерживания путем изменения подвижной фазы, которую демонстрирует схема 7.6, говорит о том, что эту особенность данных хроматографических систем можно использовать в целях оптимизации разделения. [c.135]

В последнее время появилась возможность определять аминокислотный состав белков с помощью автоматических аминокислотных анализаторов. Когда в 1948 г. Мур и Стейн [551 в дополнение к классическим методам органической химии, а также манометрическому и бактериологическому анализу ввели ионообменную хроматографию, наступил поворотный момент в развитии химии аминокислот. В основу работы созданных сотрудниками Рокфеллеровского института современных автоматических аминокислотных анализаторов была положена ионообменная хроматография. Принцип работы этих приборов заключается в следующем. Исследуемый белок гидролизуют, затем гидролизат подвергают хроматографии на смоле типа дауэкс 50 х8 в Na-форме. Элюирование производят с помощью непрерывной подачи буферного раствора. Выходящий из колонки элюат попадает в пластмассовую ячейку особой формы, где он смешивается с раствором нингидрина. Подачу нингидрина осуществляет специальный насос, работающий синхронно с насосом, подающим буферный раствор на колонку. Затем смесь элюата с нингидрином проходит через тефлоновый капилляр, который погружен в кипящую баню. В этих условиях в растворах происходит нингидриновое окрашивание, интенсивность которого измеряется в проточной кювете спектрофотометрически. Поглощение света регистрируется самописцем. Применение сферических смол [80] позволило сократить время исследования одного образца примерно в четыре раза, а использование особых ячеек сделало вполне допустимыми для анализа очень малые количества исследуемого вещества — порядка 0,01—0,05 мкмоля [38]. Введение одноколоночной процедуры значительно упрощает метод [9, 29, 43, 60]. С помощью этой методики в одной и той же пробе можно определить кислые, нейтральные и основные аминокислоты, что не только экономит исследуемый материал, но и повышает точность и сокращает время исследования. Работая на стандартном аминокислотном анализаторе и пользуясь некоторыми модификациями известных методов, можно полностью закончить анализ одного вещества в течение 3 ч [91. [c.32]

ГХ ДИ-, три-, и, возможно, многих тетрапептидов, состоящих из аминокислот Ала, Вал, Лей, Иле и Про, не вызывает никаких затруднений. Поскольку у Гли нет боковой цепи, пики соответствующих дипептидов часто имеют хвосты . Это явление, вероятно, вызвано эффектами адсорбции ими же, по-видимому, объясняется неполное элюирование N-ТФА-Гли-Гли-Гли-ОСНз [19]. С Мет были исследованы только дипептиды, ас Фен — также и трипептиды. Хотя, как следует из поведения N-ТФА-Ала-Фен-Фен-ОСНз, трипептиды, состоящие из аминокислот с высоким молекулярным весом, элюируются не всегда, при использовании коротких колонок с малым количеством жидкой фазы можно получить удовлетворительные результаты. [c.348]

Последовательность элюирования аминокислот [c.92]

В качестве иллюстрации применения градиентного элюирования упомянем разделение аминокислот, пептидов и сахаров по [c.560]

В то время промышленное производство ионитов только начиналось. Полагали, что разделение веществ на ионитах должно осуществляться благодаря различию в константах диссоциации. Однако в действительности иониты обладали и адсорбционными свойствами и они оказались наиболее удачными хроматографическими материалами для количественного анализа аминокислот. При этом вместо ранее применявшихся (при хроматографии на крахмале) органических растворителей стало возможным вести элюирование водными буферными растворами это позволило существенно усовершенствовать и ускорить детектирование аминокислот [3]. По сравнению с хроматографией на крахмале в этом случае достигалось более высокое разрешение, пики были острее, а базовая линия более стабильной. Кроме того, разделению аминокислот не мешали неорганические соли, присутствующие в образце. [c.305]

Новый метод анализа аминокислот быстро развивался. Появилась возможность с его помощью приступить к решению ряда сложных, казавшихся неразрешимыми проблем, и прежде всего проблёмы определения первичной структуры белков. Вскоре стало очевидным, что анализ аминокислот в его первоначальном варианте слишком трудоемок и недостаточно эффективен. Ввиду этого был поставлен ряд исследований по механизации трудоемких операций и совершенствованию организации эксперимента. Основной вклад в решение этих задач вновь внесла группа исследователей под руководством Мура и Стайна [4]. Благодаря проведению реакции аминокислот с нингидрином в проточном капиллярном реакторе и измерению интенсивности окраски на регистрирующем проточном фотометре трудоемкая обработка фракции была преобразована в непрерывный процесс. Таким образом, на основе аналитического метода был создан новый прибор — аминокислотный анализатор. Выпуск и дальнейшее усовершенствование этого прибора были предприняты промышленными фирмами. Последующие усилия были направлены на повышение эффективности и чувствительности анализа. Первое время причиной низкой эффективности прибора служила длительность элюирования. Основой для дальнейшей оптимизации процесса послужила теоретическая работа Гамильтона [5], в которой было показано, что повышения эффективности можно достигнуть путем увеличения скорости подачи элюента и уменьшения размеров зерен ионита. В результате многочисленных модификаций ионитов (а эта работа все еще продолжается) удалось более чем в 10 раз сократить время элюирования без снижения разрешения. Сокращение продолжительности анализа [c.306]

Для выбора оптимальных условий разделения аминокислот, входящих в состав белков, Мур и Стейн определяли скорость элюирования отдельных аминокислот в разных условиях [3]. При 20 Зак. № 22 [c.305]

В. Л. Кретович и А. А. Бундель разработали быстрый метод определения аспарагиновой и глютаминовой кислот, который основан на том, что активированный, подкисленный оксид алюминия адсорбирует аспарагиновую, глютаминовую кислоты и цистин. Другие аминокислоты, которые проходят через хроматографическую колонку, этим адсорбентом не задерживаются. Цистин вымывают из колонки дистиллированной водой, насыщенной H2S (цистин при этом восстанавливается в цистеин, а оставшиеся дикарбоновые кислоты последовательно элюируют). Установлено, что глютаминовая кислота, адсорбированная на AI2O3, при элюировании слабым раствором кислоты быстрее передвигается по колонке, чем аспарагиновая. В полученных элюатах определяют азот методом Кьельдаля. [c.23]

ЭТОМ оказалось, что оптимальная скорость элюирования основных аминокислот достигается лишь при использовании более концентрированных буферных растворов. Однако при значительном изменении концентрации и pH буфера наблюдалось увеличение объема набухшего ионита и возрастание гидродинамического сопротивления колонки. Одновременно повышался уровень базовой линии. Кроме того, в этих условиях после каждого опыта приходилось извлекать иониты из колонки, а затем, после их регенерации, вновь набивать колонку. В итоге оказалось удобнее проводить анализ образца на двух колонках. На первой осуществляли анализ кислых и нейтральных аминокислот, а сумму основных аминокислот вытесняли в конце анализа гидроокисью натрия. На второй, более короткой колонке вначале в виде суммарного пика элюировали смесь кислых и нейтральных аминокислот, а затем осуществляли разделение основных аминокислот. После получения более качественных ионитов и усовершенствования метода детектирования был разработан современный одноколоночный аминокислотный анализ. [c.306]

В первь х работах по применению систем ЖХ низкого давления с изократическим элюированием фосфатными и боратными буферами на колонках с БСА, связанным с сефарозой, показали, что хиральное разделение заряженных сорбатов, подобных немодифицированным аминокислотам триптофану, кинуренину [3-(2-амино-бензоил)аланин], и их 5- и 3-оксипроизводным соответственно чрезвычайно сильно зависит от pH подвижной фазы [87]. В дальнейшем [c.132]

Для разделения полиаминов наиболее пригодным ионитом, по-видимому, является биорекс 70 (400 меш). Применение его описано в нескольких статьях [4, 6, 7]. Колонки (7X0,9 см) с этим сорбентом присоединяются к обычному прибору для автоматического анализа аминокислот. Элюирование осуществляют со скоростью 2 мл/мин последовательно несколькими буферными растворами. Первый буферный раствор представляет собой 0,438 М раствор ацетата натрия с pH 7,5. После того как 100 мл первого раствора пройдет через колонку, его немедленно заменяют вторым буферным раствором, представляющим собой 0,5 М раствор ацетата пиридина с pH 4,4. Времена удерживания полиаминов в указанной выше системе опубликованы в работе [8]. Способ Морриса [9] предусматривает внесение небольших изменений в состав буферных растворов. После введения пробы в колонку смолу начинают промывать первым буфером (0,33 М раствором ацетата пиридина с pH 5,7). После того как через колонку пройдет 100 мл первого буфера, промывание продолжают вторым буфером (0,38 М раствор ацетата натрия с pH 4,4) [c.270]

Херинг и Хельман [115] установили, что хелоновые смолы в хелатной форме можно с успехом применять в хроматографическом обмене лигандов для разделения химически подобных комплексообразователей. Авторы использовали N1- и Си-формы монофункциональной саркозиновой смолы для частичного количественного разделения смеси химически подобных аминокислот элюированием водой. [c.31]

Для количественного анализа проводят определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски нли раз иерам пятен хроматограмм, а также путем элюирования аминокислот из отдельных пятен и последующего определения нх классическими количественными методами анализа. [c.299]

Пропуская раствор с разделенными аминокислотами через детекторную систему, можно количественно определить содержание различных аминокислот и нолучить кривые элюирования для данной аминокислотной смеси. Отдельные аминокислоты в смеси неизвестного состава можно идентифицировать, сравнивая их график элюирования с кривыми элюирований различных смесей, аминокислотный состав которых заранее известен. Типичная кривая элюирования представлена на рис. 25-2. [c.389]

Ряд количественных определений разделяемых веществ (аминокислот, сахаров, пуринов, красителей и т. д.) основан на элюировании пятна соответствующего вещества с бумаги с последующим анализом элюата колориметрически, спектрофотометрически и т. д. Иногда элюированное вещество подвергается ряду последующих операций для идентификации или установления его структуры. [c.476]

В табл. 1-10 приведень значения -Ку и Rj протеиногеннЬ1Х аминокислот, полученные при хроматографии на бумаге шляйхер-шюль 2043 Ь в системах бутанол — уксусная кислота — вода (4 1 1) и бутанол — изомасляная кислота — уксусная кислота — вода (5 0,5 0,7 5). Значения Р зультаты трехкратного элюирования. Значения коэффициентов удерживания воспроизводятся, если хроматографирование идет в направлении волокна бумаги. [c.57]

При определении очень малых количеств аминокислот применяют проявление ТХ-пластинки флуорескамином [раствор 10 мг флуорескамина в смеси аиетон/гексан (1 4)] [145]. После элюирования подходящим растворителем наблюдают флуоресценцию при 366 нм. Предел обнаружения метода при проявлении с помощью производного флуорескамина 10 пмоль. [c.58]

Хотя режим элюирования кислот зависит от их кислотности, удерживаемый объем некоторых кислот значительно отличается от величин, ожидаемых на основании их констант диссоциации. Это явление особенно заметно для ароматических кислот, для которых характерно взаимодействие между ароматическим ядром и ароматическим скелетом анионообменных смол (например, для смол на основе сополимеров стирол—дивинилбензол). Чисто физическая адсорбция слабых органических кислот, которая наблюдается на катионообменных смолах, увеличивается с увеличением молекулярной массы кислоты. Монокар-боновые кислоты адсорбируются сильнее, чем дикарбоновые килоты щавелевая кислота и минеральные кислоты практически не сорбируются [5]. Адсорбция увеличивается с увеличением размера частиц ионообменной смолы и с увеличением концентрации сорбируемой кислоты. Десорбция может стать количественной при элюировании колонки водой. Было найдено, что сродство к молекулярной сорбции кислот на катионообменных смолах увеличивается с уменьшением степени поперечной сшивки ионообменной смолы [6]. Аминокислоты сорбируются особенно сильно вследствие взаимодействия между аминогруппой кислоты и сульфогруппой смолы [7]. Сорбция алифатических кислот на ионообменных смолах на основе полистирола выше, чем на таких же катионообменных смолах, при этом одновременно происходит ионообмен и молекулярная сорбция, причем последняя в удерживании может даже преобладать [8]. Молекулярная сорбция на катионообменных смолах в Н+-форме сильнее, чем на катионообменных смолах в других формах вследствие подавления диссоциации обусловленного более [c.153]

В основу работы анализатора положена ионообменная хроматография на полимере полистирольной природы, содержащем сульфогруппы (точнее натриевую соль сульфобензокислоты). Смесь АК наносят в буфере pH 3,3, в результате чего с полимером первыми будут связаны основные АК (арг, ЛИЗ, гис), затем - менее основные и нейтральные аминокислоты и последними будут связываться кислые АК (для чего постепенно сдвигают pH буфера до 6,5-8,0). При элюировании смеси аминокислот буфером, имеющим pH 6,5-8, первыми выходят наименее прочно связанные кислые АК (глу, асп), затем - менее кислые и нейтральные АК и последними элюируются основные аминокислоты. Определение АК в анализаторе основано на нингидри- [c.18]

Рядом авторов [116—129] разработана методика ковалентного связывания аминокислот с силикагелем. Серия подобных силикагелевых сорбентов, содержащих аминокислоты в качестве фиксированных лигандов, изучена Гюбитцем и соавт. [121—123], которые обнаружили, что при образовании комплексов Си(П) и циклических аминокислот наблюдается более высокая энантиоселективность, чем при образовании аналогичных комплексов с алифатическими аминокислотами, и что с фенилаланином в качестве фиксированного леганда порядок элюирования энантиомеров всех изученных аминокислот (т. е. ь-энантиомер перед о-энантиомером) противоположен наблюдаемому с другими исследованными лигандами. [c.146]

Б. Известное количество изучаецрй ДНФ-фракции хроматографируют на бумаге в условиях, необходимых для данного ДНФ-производного. Пробы контрольного препарата, содержащие различное количество вещества, хроматографируют на том же листе бумаги. По окончании хроматографии пятна ДНФ-аминокислот вырезают вместе с контрольными, бумагу измельчают на мелкие кусочки и помещают в пробирки. В каждую пробирку наливают по 5 мл 1 %-ного раствора NaH XDa и в течение 30 мин при периодическом встряхивании в темноте производят элюирование проб. Экстинкцию растворов при 360 нм измеряют в спектрофотометре. Содержание ДНФ-аминокислот в исследуемой фракции определяют по калибровочной кривой, построенной для контрольных образцов. [c.272]

Пятна очерчивают простым карандашом несколько захватив чистое поле фильтровальной бумаги. Очерченные участки вырезают и помещают в градуированные пробирки емкостью 10 мл. Затем в них добавляют 3 мл 0,1%-ного раствора нингидрина в н-бутаноле, насыщенном водой, и кипятят в водяной бане 10 мин для элюирования глютаминовой кислоты. Раствор охлаждают, доводят до 10 мл этиловым спиртом, а затем колориметрируют в фотоэлектроколориметре ФЭК-М. Параллельно проводят контрольный опыт без аминокислот. [c.33]

На рис 7-7 изображена хроматограмма, полученная при градиентном элюировании смеси даисилпроизводных аминокислот, разделение проводилось на колонке, заполненной силикагелем, модифицированным ОДС [9] Предел обнаружения (при отношении сигнал/шум - 2) составлял около 0,1 пмоль [c.166]

Хроматографические колонки. Размеры хроматографических колонок зависят от типа используемого ионита. Обычные иониты, которые принято классифицировать по размерам зерен, или, точнее, по номерам сит (например, амберлит IR-120, 200— 400 меш), характеризуются низкой разрешающей способностью. Поэтому необходимое разрешение достигается лишь на большом столбике сорбента, а следовательно, на более длинных колонках. Для разделения аминокислот используют колонки с внутренним диаметром 0,9 см и длиной 165, 65 и 28 см. Длина термостати-рующего кожуха с внутренним диаметром 2,5 см составляет соответственно 155, 55 и 10 см. Оба конца термостатирующей рубашки снабжены водонепроницаемыми уплотнениями (фитингами), фиксирующими колонку. В случае градиентного элюирования аминокислот на дауксе 50-Х 12 используют колонку аналогичной конструкции длиной 142 см [6]. В нижнюю часть колонки впаян стеклянный пористый фильтр (G3) или же тем или иным способом закреплен диск из пористого тефлона, полиэтилена ИЛИ поливинилхлорида. Узкая вороночка под пористым диском плавно переходит в толстостенный капилляр с внутренним диаметром 1 мм, который оканчивается сферическим шлифом (керн, 8/1 мм). Верхняя часть колонки также заканчивается сферическим шлифом (муфта, 18/9 мм) (рис. 32.1). [c.308]

Обработку фракций проводят в штативах, рассчитанных на 50 пробирок. В каждый штатив помещают также пробирки со стандартными и контрольным растворами. К 2 мл анализируемого раствора автоматической пипеткой добавляют 1 мл нингидринового реагента и тщательно перемешивают. Затем штатив с пробирками помещают на 20 мин в кипящую водяную баню (100°С) и охлаждают в бане с проточной водой в течение 5 мий. Автоматической пипеткой в каждую пробирку вводят по 5 мл 60%-ного этанола и тщательно перемешивают пробирки выдерживают при комнатной температуре 1 ч, в течение которого в результате окисления кислородом воздуха исчезает красная окраска гидридантина. Наконец, определяют оптическую плотность при 570 нм, а фракции, содержащие пролин и оксипролин, анализируют при 440 нм. В качестве контроля (фона) используют среднюю величину оптической плотности, полученную при аналогичной обработке фракций, не содержащих аминокислот. Важно в процессе измерения проводить сравнение с контрольным раствором, содержащим буфер аналогичного состава. При градиентном элюировании наблюдается постепенное увеличение фона вследствие накопления в буфере нингидринположительных примесей. В этом случае в качестве контрольного раствора еле- [c.314]

Калибровочную кривую строят по лейцину (0,05— 0,250 ммоль/мл) при трех разведениях (5, 10 и 15 мл) 60%-ным этанолом. Выход аминокислот рассчитывают по так называемым лейциновым единицам при помощи соответствующих коэффициентов (см. стр. 352). Для ускорения расчетов удобно пользоваться соответствующей таблицей. Содержание нингидринположительных веществ (аминокислот) в каждой фракции наносят на график по оси ординат против номера соответствующей фракции или объема элюата. В результате получают профиль элюирования, или хроматограмму. Объем элюирования (или, что то же самое, удерживаемый объем) каждого вещества, т. е. объем элюата от начала опыта до максимума данного пика, является вопроизводимой величиной и служит характеристикой данного вещества. Площадь пика пропорциональна количеству присутствующей в элюате аминокислоты. [c.315]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология