Полипептиды на колонке

Ввиду того, что различия в растворимостях полипептидов очень невелики, для выделения индивидуальных пептидов и.з смесей требуются специальные методы. К ним относятся фракционный диализ, распределительная хроматография (например, на колонке из бумажного порошка или листе бумаги), адсорбционная хроматография, ионнообменная хроматография, электрофорез и противоточное распределение по Крэйгу (т. е. распределение между двумя ограниченно смешивающимися жидкостями). Для характеристики выделенных пептидов и доказательства их однородности применяют противоточное распределение, количественный анализ аминокислотного состава и определение концевых групп полипептидной цепи. [c.383]

При работе с новым видом сорбента или с новой партией следует упаковать сначала короткую колонку (10—12 см) при относительно невысоком давлении (20—25 МПа). При хорошем результате можно попытаться упаковать более длинную (200—250 мм) колонку при высоком давлении (40—60 МПа). Если эффективность увеличится примерно вдвое одновременно с увеличением сопротивления потоку в два раза, значит сорбент прочен, его можно использовать при таких параметрах набивки. Если сопротивление потоку возрастет в 2,5—6 раз, это значит, что сорбент непрочен и разрушается, образующаяся пыль резко увеличивает сопротивление колонки, нужно снижать давление при набивке. Особую осторожность следует проявлять при выборе давления для набивки силикагелей с широкими порами (более 10 нм) и с большим объемом пор, которые находят все более широкое применение в эксклюзионной хроматографии полимеров и в анализе биологических объектов — белков, полипептидов и др. [c.118]

Смолы, удерживающие ионы, обратили на себя большее внимание со стороны химиков-производственников, чем химиков-аналитиков. На примере [16] отделения аминокислот и полипептидов от хлорида натрия видны возможности использования этих смол в аналитической лаборатории. Навеску желатины частично гидролизуют кипячением в течение 2 ч в растворе хлорида натрия и соляной кислоты. После нейтрализации кислоты раствором гидроокиси натрия 5 мл исследуемого раствора, содержащего 50 мг гидролизованного продукта и 5 ммолей хлорида натрия, пропускают через колонку размером 41 см х 1,02 см , заполненную АО 11-А-8. Происходит количественное отделение продукта гидролиза (С =1,06) от хлорида натрия (С =2,2). [c.273]

Рис. 12.29. Аналитическое разделение белков и полипептидов методом дискретного электрофореза в колонках с полиакриламидным гелем.

Условия нанесения образца па ОФ-колонку существенно влияют на результаты фракционирования. При выделении пептидов для структурных исследований практикуется нанесение образцов в растворах, содержащих мочевину или Gu-H l. Это помогает растворить образцы, предотвращает агрегацию молекул, способствует адсорбции образца на носителе. Адсорбция образца, позволяющая нанести вещество ровным слоем и создать оптимальные условия для взаимодействий между подвижной фазой и растворенным веществом, является одним из важнейших условий успешного фракционирования полипептидов. При больших объемах наносимого образца повышается эффективность последующих хроматографических разделений. [c.213]

Белев и соавторы для определения молекулярных масс денатурированных белков методом гель-фильтрацип использовали сефакрил S-200 Superfine . Колонку размером 1,6 х ЮО см калибровали четырьмя полипептидами с известным числом аминокислотных остатков N) — от 71 (токсин) до 579 (БСА). Элюцию вели 6 М водным раствором гуанидинхлорида (pH 5) со скоростью 3 мл/см -ч. Для точности объем элюента определяли по весу. График селектив- [c.153]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Б. Выбор размеров колонки. Для фракционирования 100 мг белка или полипептида при использовании КМ-целлюлозы, имеющей емкость 0,7—0,8 мэкв/г, требуется колонка 1,5 х 35 см. Препаративное разделение 1,0 г белка можно проводить на колонке 3,5x45 см- [c.212]

Природный токсин стрихнин (рис. 9.21) оказался полезным пнструментом для выделения и биохимической характеристики глицинового рецептора. Его [Ш] производное имеет сродство, достаточно высокое для того, чтобы его можно было использовать в тестах связывания рецепторного белка (7 0=11,3 нМ), а иммобилизация стрихнина на аффинной колонке позволила Бецу и сотр. очистить рецептор, солюбилизированный тритоном, Б 1000 раз за одну стадию. Более того, будучи фоточувствитель-ным соединением, стрихнин оказался и без химической модификации удобной фотоаффинной меткой. УФ-облучение комплекса стрихнина и рецептора приводит к ковалентному мечению только одного полипептида (М 48 ООО). [c.295]

Специфической особенностью полипептидного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи образование новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгации цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и, побочных продуктов после каждого химического превращения. Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле попеременно добавляют очередной синтон и реагент для удаления концевой защитной группы, остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. В течение всего процесса полипептид остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый пОлипептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку синтон (мономер) — растворитель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизированного полипептидного синтеза. Так, уже упоминавшийся синтез протеазы ВИЧ-1 провели на автоматическом пептидном синтезаторе <АррИе(1 Biosystem> и потребовалось около двух-10- 291 [c.291]

Пористые материалы широко используются для фракционирования смесей по молекулярному весу компонентов. Примером тому служит ультрафильтрация — продавливание раствора через мембрану, способную пропускать лишь молекулы небольших размеров и препятствующую фильтрации макромолекул. Аналогичный принцип был использован при электроосмотической миграции веществ через гели [18]. Противоположное явление — прохождение молекул больших размеров и удерживание молекул меньших размеров ( обратные сита ) — наблюдалось при фильтрации растворов электролитов через колонку, содержащую ионообменную смолу. Это явление основано на способности ионов малых размеров проникать в сетчатую структуру ионита и сорбироваться там в то время, когда ионы больших размеров проходят через колонку без задержки. Применение сильносшитых малопористых смол позволяет отделять ионы металлов от органических оснований. На несколько более набухающих смолах осуществимо разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных полипептидов, на сильнонабухающих ионообменных смолах достигается разделение белков по молекулярным весам [19]. [c.201]

С высоким сродством к электронам устраняет необходимость калибровки при детектировании и сводит к минимуму очистку образцов перед их хроматографическим определением, что особенно важно при анализе природных продуктов. ]У1етиловые эфиры ДНФ-производных были использованы для идентификации аминокислот, образующихся при гидролизе полипептида грамицидина А [58] (рис. 10). Аланин, валин, глицин, лейций и изолейцин определялись количественно с точностью до 2 % при хроматографическом разделении на двухметровой колонке с силиконовой жидкой фазой ЗЕ-ЗО. Наиболее полное разделение некоторых нейтральных алифатических и дикарбоновых аминокислот в виде фенилтиоги-дантоинов и метиловых эфиров ДНФ-производных получено при анализе на колонке с фторированным силиконовым полимером РР-1 и низким содержанием стационарной жидкой фазы [59]. [c.268]

Для одной колонки в небольшой пробирке смешивают с гелем 5 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего (например, натриевая соль бромфенолового синего. Serva, Гейдельберг) в 0,01 М фосфатном буферном растворе с pH 7,0, одну каплю глицерина и 5 мкл меркаптоэтанола и добавляют 1— 20 мкг полипептида, инкубированного при 100 °С в восстановительной среде (как указано выше). Общий объем доводят до 50 или до 150 мкл буферным раствором образца (0,01 М фосфат, доведенный с помощью NaOH до pH 7,2 и содержащий 0,1% меркаптоэтанола и 0,1% SDS). Раствор из пастеровской пипетки вводят в верхнюю часть колонки с полиакриламидным гелем, находящейся в приборе. [c.345]

Хроматография производилась путем градиентной элюции, осуществляемой с помощью 3-камерного смесителя с последовательно соединенными цилиндрическими сосудами равного диаметра. Из них первый, снабженный мешалко , заполняли 4,3 л буферного раствора pH 3,1, а второй и третий — равными количествами растворов с pH 5,0. Элюирующий раствор прокачивали через колонку со скоростью 120 мл час при давлении не выше 2,1 атм. Во время работы слой смолы сокращается примерно на /з, в результате чего гидростатическое сопротивление колонки растет, и для поддержания давления на прежнем уровне следует уменьшать скорость прокачивания элюента. Собирают фракции по 10 мл. После 1000 фракций буфер заменяют на 2 и. КаОН и с его помощью элюируют наиболее прочно сорбируемые полипептиды. По окончании хроматографии смолу удаляют из колонки и регенерируют. [c.171]

Параллельно с исследованиями Эллиотта были проведены работы по выделению и очистке брадикинина, образующегося из бычьей плазмы при действии змеиного яда. С этой целью Прадо и сотр. [1764], а также Андраде и сотр. [54] использовали хроматографию на колонке с окисью алюминия и целлюлозой, а Андраде и Роша э Сильва [55] — ионообменную хроматографию на колонке с амберлитом ЩС-50 (ХЕ-64). Наибольшего успеха достигли Хамберг и сотр. [921, 926, 927], применявшие хроматографию на колонке с амберлитом ШС-50 (pH 5), препаративный электрофорез и хроматографию на бумаге. Аминокислотный анализ выделенного таким образом чистого полипептида показал, что последний содержит те же аминокислоты и в таких же соотношениях, что и трипсиновый брадикинин. Тщательное сравнение фармакологических свойств показало, что оба брадикинина, образующиеся при гидролизе белков как змеиным ядом, так и трипсином, идентичны синтетическому бради-кинину. Сообщение о выделении брадикинина из продуктов инкубации бычьей плазмы со змеиным ядом было опубликовано также Зубером и Жаком [2680]. [c.106]

В работе [54] описано разделение гидролизата полипептидов на колонке с ультрасфер-0В5. Аминокислоты предварительно превращали в фенилтиогидантоиновые производные, которые в элюате обнаруживали по поглощению при 254 нм. Из представленной на рис. 2.3 типичной хроматограммы видно, что все 25 компонентов смеси хорошо разделяются за 32 мин. [c.45]

В случае ацетатов целлюлозы не оправдало себя также и применение хроматографической адсорбции [904]. Однако с ее помощью удалось разделить на индивидуальные фракции с постоянными свойствами основные полипептиды, получающиеся при разделении белковых веществ [905—907]. Способность к поглощению определяется содержанием амин-ного азота. Разделение на фракции с различными свойствами удалось для амилозы и амилопектина при хроматографии на окиси алюминия [908]. Далее можно расфракциоиировать нитраты целлюлозы с различным содержанием азота, используя крахмал в качестве сорбента [909]. Фракции отличаются по молекулярному весу, но не по содержанию азота. Полиэфиры можно фракционировать на колонках, заполненных мочевиной [910]. [c.129]

Бах И Феллиг [52] и Бах [53] не согласились с выводом о том, что неизвестные метаболиты 1 и 3 представляют собой белковые комплексы 2,4-Д. Так же как и Яворски и Баттс [47], они нашли, что через несколько дней после обработки основная часть 2,4-Д превращается в биологически неактивный комплекс, который хроматографируется на бумаге медленнее, чем 2,4-Д [52, 54]. При кислотном гидролизе этого комплекса образуется вещество с близким к R 2,4-Д. Дальнейшие исследования [53, 55] показали, что этот комплекс — главный меченый компонент фракции экстрактов фасоли, растворимых в воде и нерастворимых в эфире, — состоит из нескольких меченых метаболитов, которые были разделены на колонке с древесным углем [55]. Сложный состав подтверждают также результаты хроматографии на бумаге на хроматограммах проявилось по крайней мере шесть главных компонентов [53]. При гидролизе каждого из этих шести компонентов получался ряд аминокислот и два меченых соединения, растворимых в эфире и идентичных двум главным компонентам растворимой в эфире фракции экстрактов фасоли. Среди продуктов гидролиза определены 10 аминокислот. Бах [53] считает, что нерастворимые в эфире меченые продукты метаболизма 2,4-Д не являются полипептидами или белками, как это предположили Баттс и Фанг [51], так как их поведение при ионообменной хроматографии, хроматографии на бумаге и экстракции органическими растворителями противоречит этому предположению. По мнению Баха, истинные метаболиты были все еще загрязнены относительно большими количествами связанных аминокислот, например амидами, образованными аминокислотами с различными продуктами обмена веществ в растении. По этой причине могла отсутствовать прямая корреляция между аминокислотами, которые идентифицируются после гидролиза различных меченых фракций, и аминокислотами, которые, как полагают, связаны с мечеными кислотами, образующимися из [c.20]

В результате расщепления белка или полипептида, каким бы методом оно ни осуществлялось, всегда образуется смесь пептидов. В среднем наиболее короткие пептиды получают при химотрипсиновом гидролизе, а наиболее длинные — при обработке бромистым цианом (так как содержание метионина в большинстве белков очень мало по сравнению с суммарным содержанием крупных гидрофобных аминокислот). При фракционировании смесей пептидов наилучшие результаты дает метод ионообменной хроматографии на колонках. Если для разделения используют смолу дауэкс I или другую, сходную смолу основного характера, а для элюции — ниридин-ацетатный буфер с постепенно понижающимся значением pH (8—3), то первыми с колонки выходят основные пептиды наиболее кислые выходят последними (фиг. 12). Обратный порядок элюции имеет место при [c.72]

Кун и сотр. [33] И Монтрейл и Маллэ [34] впервые обнаружили глико-протеины в женском молозиве. Гот и сотр. [35] выделили из женского молозива недиализуемую гликонолипентидную фракцию, которая содержала 22% полипептида. Анализ углеводной части показал, что она содержит 43% гексоз, 15% гексозаминов, 9% 6-дезоксигексоз и 10% сиаловой кислоты (считая на сухой вес гликоиротеина). При фракционировании препарата методом хроматографии на колонках можно получить 5 подфракций. [c.265]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Таким образом, нанося иа колонку образец в большом объеме буфера, содержащего мочевину и ацетат, можно значительно ускорить процесс концентрирования и разделения образцов благодаря адсорбции полипептидов на ОФ-сорбентах. Пептиды отделяют от мочевины на патронах Sep-Pak [31] или на миниколонках [14] Sep-Pak использовали и для концентрирования образца перед ВЭЖХ [1]. [c.211]

ОФ Носители используют для предварительной очистки и концентрирования полипептидов. Описано применение мини-колонок, заполненных Partisil-10 ODS (10 мкм, размер пор 5,5— [c.213]

Способность к набуханию. Для определения степени пабухаемости смолы измеряют высоту слоя смолы (в небольшой плоскодонной пробирке) до и через 1 ч после добавления раствор11теля [27]. Отношение объемов набухшей и сухой смолы VslVd) должно составлять по крайней мере 3-ь5 для того, чтобы реагенты могли проникать внутрь частиц гидрофобного полимера. После синтеза смол на основе полистирола следует сравнить их способность к набуханию со значениями, представленными в табл. 12.1. Шарики идеального носителя для анализа последовательности должны быть небольшими по размеру, иметь малый разброс по диаметру частиц, что существенно для упаковки хроматографической колонки сохранять постоянный объем набухания и устойчивость ко всем реагентам и растворителям, используемым в процессе определения последовательности. Однако смолы, наиболее пригодные для анализа структуры полипептидов, сильно набухают в пиридине, ДМФА, 1,2-дихлоро-этане, ТФУ. Поскольку эти смолы лишь частично удовлетворяют вышеуказанным идеальным требованиям и изменение их объема в процессе определения структуры ведет к закупорке колонки [c.379]

Смотреть страницы где упоминается термин Полипептиды на колонке: [c.200] [c.201] [c.198] [c.114] [c.272] [c.396] [c.403] [c.171] [c.245] [c.49] [c.125] [c.83] [c.101] [c.173] [c.244] [c.383] [c.565] [c.158] [c.210] [c.211] [c.214] [c.348] [c.399] [c.451]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология