Элюирование в градиенте температуры

Хроматермография получила применение в начальный период развития газовой хроматографии и осуществлялась в самодельных установках в 1951—1960 гг., когда еще почти не было промышленного выпуска газовых хроматографов. Это объясняется главным образом конструктивными трудностями, встретившимися при создании технически совершенной и компактной системы движущегося температурного поля с градиентом температуры. Кроме того, уже в то время начала применяться другая более простая система нагревания хроматографической колонки в процессе элюирования компонентов из нее — нагревание колонки равномерно по всей длине. Эта система получила широкое распространение под названием программирование температуры и в настоящее время осуществляется в большинстве газовых хроматографов промышленного производства. [c.19]

Для оптимизации методик разделения с использованием градиентного элюирования целесообразно сочетать градиент температуры с градиентом другого типа. [c.68]

Элюирование в нисходящем линейном градиенте концентрации (0,56—0,38 М) хлорида натрия в 0,02 М трис—буферном растворе с pH 8 в сочетании с нисходящим градиентом температуры от 80 до 36 °С (2°С/ч). Объем элюента 750 мл. Скорость подачи 36 мл/ч. [c.92]

Программирование температуры колонки быстро теряет всю свою полезность и даже становится вредным, если нагревание колонки не является квазиоднородным. Любое, даже самое незначительное изменение температуры колонки связано с появлением в ней градиента температуры. Если такой градиент намного превышает градиент температуры, связанный с растворением вещества в неподвижной фазе, то разделение двух близких по временам удерживания компонентов смеси ухудшается. Уменьшается также и средняя концентрация разделенных компонентов в подвижной фазе. Улучшается (уменьшается) лишь максимальное время элюирования. [c.196]

Осуществление фракционирования методами последовательного растворения предполагает перевод полимера в соответствующее физическое состояние с последующим экстрагированием фракций с возрастающими молекулярными весами с помощью ряда элюирующих жидкостей, растворяющая способность которых увеличивается. В отличие от методов последовательного осаждения нри фракционировании методами последовательного растворения первой выделяется фракция с минимальным молекулярным весом, а последней — фракция с максимальным молекулярным весом. На практике используются весьма разнообразные экспериментальные приемы. Можно экстрагировать тщательно измельченный полимер или наносить его в виде пленки на тонкую алюминиевую фольгу или на носитель (например, песок) нри экстрагировании в колонке. Можно также проводить избирательное экстрагирование концентрированного раствора (коацерват), содерн ащего значительное количество полимера. Общим для всех этих способов является подготовка полимера в такой форме, которая позволяет осуществить быстрое экстрагирование элюентом. Необходимо удерживать полимер в процессе фракционирования неподвижным, так чтобы экстрагирование осуществлялось при минимальных механических воздействиях на образец. Ниже будут подробно рассмотрены различные методы экстрагирования. Следует отметить, что в литературе проводится различие между методами экстрагирования полимера из колонки. Если полимер экстрагируется при постоянной температуре, то процесс называют последовательным растворением или фракционированием методом элюирования. Если же нри фракционировании применяется градиент температуры как один, так и совместно с градиентом концентрации растворителя, то процесс называют хроматографическим фракционированием. В этой главе будет рассмотрен метод последовательного растворения и одновременно проведено сравнение с методом хроматографического фракционирования, поскольку различия между этими методами заключаются не столько в их природе, сколько в названиях. [c.62]

Наиболее полное освещение всех имеющихся в настоящее время методов фракционирования полимеров приведено в недавно опубликованных трех обзорных статьях [7—9], посвященных этому вопросу. Из пятнадцати методов, описанных в статье Холла [7], в данной главе рассматриваются только два элюирование на колонке и элюирование на колонке в условиях градиента температуры. Оба эти метода относятся к методам фракционирования полимера из раствора. Первый представляет собой однократную экстракцию, в то время как второй сочетает в себе многократную экстракцию и осаждение, происходящие по всей длине колонки. Оба метода оказались чрезвычайно удобны особенно для фракционирования полиолефинов вследствие возможности их автоматизации. В этой главе в основном рассматриваются результаты, полученные при фракционировании полиолефинов. Однако указаны также некоторые данные по фракционированию других полимеров или приведены ссылки на эти данные. Кроме того, в главу включен раздел, в котором описывается метод разделения полимеров по структуре. [c.361]

Бэкер и Уильямс [14] впервые использовали метод элюирования полимера в градиенте температуры. Теоретически метод представляет собой многократное осаждение и экстракцию полимера. Хотя они назвали этот процесс хроматографической кристаллизацией, однако термин хроматографическое осаждение , по-видимому, более предпочтителен [15], так как на самом деле никакой кристаллизации полимера не происходит. [c.362]

Описаны многочисленные колоночные и хроматографические методы фракционирования (элюирование в градиенте температуры и растворителя, прямая экстракция, селективное осаждение с последующим элюированием, адсорбционная и гелевая хроматография и т. д.), позволяющие осуществить разделение не только по молекулярным весам, но также по степени разветвленности макромолекулы, химическому составу и структуре. При применении таких методов, которые могут быть частично автоматизированы, можно проводить [c.418]

На этой диаграмме А, В и С — три различных элюента. Их можно смешивать в любой пропорции, получая смесь, элюирующая способность которой меняется в результате изменения концентрации, ионной силы, pH, полярности и т. д. Это основной принцип градиентного элюирования. В смесительном узле осуществляется контроль за концентрацией (или другими перечисленными выше характеристиками) подвижной жидкой фазы, поступающей в колонку. Регулятор давления обеспечивает создание высокого давления на входе в колонку или снижение давления на выходе из нее. Благодаря контролю за температурой работа колонки ведется в изотермическом режиме или в режиме запрограммированного изменения температуры, предусматривающего изменение температуры колонки во времени или создание различного типа температурных градиентов вдоль колонки. [c.61]

Удельный удерживаемый объем. соответствует объему газа нри 0° С, необходимому для элюирования половины вещества из колонки, содержащей один грамм жидкой фазы и не имеющей градиента давления или свободного объема газа. Во всех случаях температура колонки, к которой применима приводимая величина Уг, должна быть точно указана. [c.93]

В основе разделения нуклеиновых кислот на гидроксиапатите лежит взаимодействие между отрицательно заряженными фосфатными группами полинуклеотида и положительно заряженными ионами кальция в кристаллах сорбента [60]. Следовательно, элюирование нуклеиновых кислот с гидроксиапатита можно проводить либо в градиенте концентрации фосфат-иона, либо увеличением температуры колонки при постоянном значении pH и концентрации солей в элюенте [61]. При ступенчатом элюировании иногда наблюдается появление артефактов (рис. 38.3), вероятно, из-за неправильно подобранных колонок или вследствие нарушения оптимального соотношения ДНК — сорбент [62]. [c.72]

ДНК можно иммобилизовать на целлюлозе и использовать в качестве сорбента для выделения комплементарных ей нитей ДНК и РНК [116]. Адсорбцию в этом случае проводят в условиях, способствующих ренатурации ДНК. Элюирование ведут в убывающем градиенте ионной силы и при повышении температуры колонки. [c.80]

Градиентное элюирование в жидкостной хроматографии играет такую же роль, что и программирование температуры в газовой хроматографии. Основное назначение обоих способов — получение хорошего разделения за возможно более короткое время, при этом форма (и ширина) пиков практически одинакова на всем протяжении разделения при правильном выборе градиента. Состав растворителя и форму градиента подбирают в соответствии с поставленной задачей и составом разделяемого образца. [c.40]

Иногда перед адсорбцией на специфическом сорбенте бывает необходимо освободиться от белков-примесей путем предварительного фракционирования. Если изменить условия адсорбции, такие, как pH, ионную силу, темшературу, скорость потока и диэлектрическую проницаемость, можно избирательно исключить некоторые ферменты. Более того, для предотвращения адсорбции некоторых из них можно добавить в раствор ингибитор или другие лиганды. Используя носитель с порами малого размера, можно исключить белки с высокой молекулярной массой. Повысить избирательность можно также, применяя специфическое элюирование. Специфические ингибиторы или субстраты могут быть применены для избирательного элюирования индивидуальных ферментов. В гл. 10 приведены примеры разделения смесей ферментов на сорбентах с групповой специфичностью для выделения индивидуальных веществ применялись градиенты pH, ионной силы или температуры. [c.107]

Прп.менение линейного градиента температуры для разделения смеси дрожжевой алгокольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексоки-назы и лактатдегидрогеназы аффинной хроматографией на №-(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозе [15] показано на рис. 10.7. Интересно, что глицерокипаза и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, предсказываемом на основе их наблюдаемых энергий адсорбции с высоким выходом (70—90%), в то время как лактатдегидрогеназа требует ударного элюирования 5 мМ [c.268]

Шнайдер [41[ провел критическое рассмотрение различных параметров, играющих важную роль как в методе градиентного элюирования, так и в методе хроматографии. Данные, получаемые обоими методами, весьма сходны между собой, за исключением того факта (обнаруженного при последующих сравнительных исследованиях на полистироле), что метод Бейкера — 13ильям-са позволяет получить более высокомолекулярную фракцию в конце фракционирования. Отмеченное сходство результатов фракционирования методами хроматографии и градиентного элюирования весьма удивительно, если исходить из положения, что градиентное элюирование представляет собой одностадийный процесс, а хроматографическое фракционирование — многостадийный процесс, так как в этом случае при перемещении через колонку фракция подвергается многократным последовательным осаждениям и растворениям под влиянием градиента температуры и градиента концентрации растворителя. Очевидно, избирательное осаждение, обычно применяемое при фракционировании методом градиентного элюирования, но, как правило, не используемое при хроматографическом фракционировании, играет значительную роль и может оказаться одной из причин близости результатов, полученных обоими методами. [c.82]

Выше было отмечено, что имеется большое количество противоречивых литературных данных о влиянии температурного градиента (если оно вообще имеется) на эффективность фракционирования хроматографическим методом. Одни авторы считают, что наличие температурного градиента в действительности ухудшает эффективность фракционирования, другие же утверждают, что градиент температуры важен для достижения условий эффективного фракционирования. В этом разделе будет предпринята попытка объективного рассмотрения соответствующих работ и выводов теории и проведено сравнение метода хроматографического фракционирования с другими методами. Рассмотрение ограничим случаем температурного градиента, в гл. 3 рассмотрена теория фракциоиирования методом элюирования в отсутствие градиента температуры. Существуют также другие модификации метода, например ступенчатый градиент температуры в отсутствие градиента концентрации растворителя [36]. В последующем разделе все альтернативные теоретические модели рассматриваться не будут. [c.100]

На рис. 4-8 для сравнения представлены кривые фракционирования полиэтилена при наличии градиента температуры и без него [18]. Нетрудно видеть, что при наличии температурного градиента разрешение по фракциям оказалось значительно лучшим (и особенно в высокомолекулярной части образца) по сравнению с элюированием в отсутствие температурного градиента. Правда, общность этого вывода ограничена, так как изотермическое фракционирование проводили при 133°, т. е. при температуре, промежуточной между максимальной (152°) и минимальной (100°) температурами колонки. Обычно разрешение при фракционировании путем экстрагирования улучшается при понижении температуры. Следовательно, вполне возможно, что при 100° изотермическое фракционирование проходило бы столь же удовлетворительно, как и при наличии температурпого градиента. [c.105]

В работе [23] сравнивали методы скоростной седиментации в ультрацентрифуге, ГПХ (использовали стандартный прибор и методику фирмы Waters ) и два варианта хроматографического фракционирования с градиентом температур по колонке и элюирование без градиента температур. Объектом исследования были образцы [c.19]

Сравнение этого метода фракционирования с другими затруднено, так как некоторые из них не совсем надежны. Сопоставление результатов различных методов фракционирования для полиэтилена высокой плотности было проведено Гийе с сотр. [39], а также Девисом и Тобиасом [44], фракционировавшими полипропилен тремя способами (фракционирование на колонке, фракционное осаждение и фракционное растворение). Как показал Холл [7], аналогичные результаты получаются и при фракционировании полистирола низкого молекулярного веса методами осаждения, экстракции из пленок по Фуксу и элюирования в градиенте температуры. [c.370]

Методика элюирования также основана на принципе частичного растворения, изложенном выше. По этой методике полимер помещают на стекловате в верхней части колонки, заполненной силикагелем или алюмогелем, как показано на рис. 13.2. Полимер последовательно элюируют смесью растворитель-осадитель постепенно возрастающей растворяющей способности. Фракция наименьшей молекулярной массы элюируется первой, наибольшей - последней. Эффективность метода возрастает при поддержании градиента температуры в колонке. В верхней части колонки температура несколько выше, чем в нижней. Градиент температуры позволяет проводить серии растворений и осаждений каждой молекулярной фракции на различных уровнях колонки, что повышает эффективность фракдао-нирования. [c.298]

В работе [11] показано, что изменение температуры можно использовать с целью элюирования ферментов с аффинных адсорбентов. На рис. 9 приведены результаты разделения дрожжевой алкогольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексокиназы и лактатдегидрогеназы на иммобилизованном 5 -АМР с использованием линейного градиента температуры. Уместно заметить, что глицерокиназа и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, соответствующем их кажущимся энергиям адсорбции с почти количественным выходом (70—90%), в то время как для элюирования лактатдегидрогеназы даже при [c.117]

Рис. 9. Разделение различных ферментов на К -(б-аминогексил)-5 -АМР-се-фарозе с использованием увеличивающегося градиента температуры. J — гексокиназа 2 — глицерокиназа 3 — дрожжевая алкогольдегидрогеназа 4 — лактатдегидрогеназа Н4. Стрелка указывает элюирование пульсирующей дозой 5 мМ NADH [И]. (Воспроизведено с разрешения.)

Таким образом, изменение температуры в сочетании с другими приемами, такими, как уменьшение концентрации лиганда, пульсирующее введение NADH или использование градиентов ионной силы, можно применять при элюировании жестко связанных ферментов. Кроме того, градиенты температуры могут служить очень чувствительными методами элюирования слабо связанных ферментов. Добавим, что элюированные ферменты, не содержащие десорбирующих агентов (например, солей или незначительных количеств нуклеотида), можно непосредственно использовать при кинетических исследованиях. [c.117]

Хроматограф Du Pont, колонка 4,6 250 мм, Zorbax ODS, 5 мкм, подвижная фаза - градиент от 20 до 40 % МеОН в 1,5 % АсОН за 60 мип, температура колонки 45 С, скорость элюирования 1 мл/мип. УФ-детектор 275 им (А) и 375 им (Б). [c.141]

Более эффективным элюирующим агентом, например для разделения смеси V — ТЬ — Ей — 8гп, является лактат. Элюирование обычно выполняется при повышенной температуре и градиенте концентрации или pH. Очень хорошие результаты получены при элюировании смесью 0,4 М молочная кислота — 0,002 М ЭДТА [14, 15]. [c.197]

При элюировании в градиенте концентрации буфера и при изменении концентрации детергента в элюенте на объем капли влияет изменение плотности и поверхностного натяжения элюата. При необходимости в этом случае следует вводить определенную поправку. Некоторые модели коллекторов снабжены микропереключателем, подающим электрический импульс при достижении заданного числа фракций. Этот сигнал используют для смены элюента или изменения температуры в колонке. В случае необходимости такое устройство можно изготовить в лаборатории. Переключатель устанавливают на корпусе коллектора под фотоячейкой для отсчета капель. Он включается при помощи штырька, закрепленного на соответствующей пробирке. [c.312]

Температура 50 °С скорость подачи 20 мл/ч объем фракций 2,2 мл. Элюирование проводят в линейном градиенте буферных растворов 0.1 М пиридинформиат. pH 3,1—2,0 М [c.406]

Колонка 2X30 см. Элюирование в линейном градиенте концентрации (0—0,48 М) хлорида калия в 0,005 М трис—НС1 буферном растворе с pH 7,5, содержащем 7 М мочевину. Скорость подачи 60 мл/ч. Объем фракций 10 мл. Температура 55 °С. Образец 3050 OEj раствора, апиримидиновой ДНК в исходном буфере, содержащем 7 М мочевину. Номер фракции соответствует числу нуклеотидных звеньев в олигонуклеотиде. [c.92]

Колонка (1,3X10 см) со стеклянными шариками диаметром 0,2 мм промыта азотной кислотой н основной средой Игла. Нанесено 7,5 10 клеток, суспендированных в I мл основной среды Игла, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота, pH 7,1—7,2. Температура 37 °С. Элюирование проводят в градиенте концентрации ЭДТА на фоне основной среды Игла-ь20% сыворотки крупного рогатого скота. [c.319]

Преимуществом УФ-детекторов является высокий отклик на большинство представляющих интерес материалов. Многие органические соединения, представляющие практический интерес в биологии, медицине и в промышленном органическом синтезе, содержат ароматические группировки, поглошаюшие в УФ-области. Хотя УФ-детекторы не являются универсальными по отклику, они очень селективны по отношению ко многим важным веществам. Кроме того, поскольку многие элюенты не поглощают в УФ-области (по крайней мере, в значительно широком диапазоне), УФ-детекторы отличаются высокой чувствительностью в хроматографии с градиентным элюированием например, могут быть эффективно использованы градиенты с пентаном, метиленхлоридом и ааетонитрилом. УФ-спектры практически не зависят от температуры, образцы в детекторе не разрушаются, а при сканировании по всему диапазону длин волн часто становится возможной идентификация элюируемых пиков по спектру. Таким образом, УФ-цетектор имеет существенные преимущества перец рефрактометром и детектором по теплоте адсорбции. Кроме того, сконструированы и эффективно используются /21/ детекторы с малым мертвым объемом ячеек ( < 10 мкл) и короткими коммуникациями, соединяющими детектор с колонкой. [c.220]

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

Рис. 5.13. Влияние температуры на связываемость р алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы 2) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе [2]. Проводился диализ экстракта фермента (0,5 мл), содержащего 81 Е фосфофруктокиназы, 20 Е или 18,7 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ К-фосфатиого буферного раствора (pH 6,8) затем раствор пропускался через колонку с замещенной АМР—сефарозой. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте концентрации (0—1 моль/л) КС1 (общий объем элюата 40 мл) в 10 мМ К-фосфатном буфере скорость потока 0,4 мл/мин.

Хроматермография. Большим достижением в области развития хроматографических методов анализа явилось создание хроматер-мографии, основанной на использовании подвижного температурного поля [60, 245]. Существуют различные виды хроматермо графин, отличающиеся направлениями движения температурной волны и температурного градиента. В стационарной хроматермографии направление волны совпадает с направлением потока газа-носителя, а градиент имеет обратное направление. Рассмотрим этот процесс более подробно. Пусть в колонке с сорбентом движется со скоростью а поток газа-носителя, а вдоль колонки со скоростью W перемещается печь, создающая температурный градиент (рис. 11,64). Если в процессе элюирования какой-либо компонент попадает в область низких температур, то скорость его движения уменьшается и через -некоторое время его нагоняет область высокой температуры, созда- [c.150]

Режим анализа. Колонку уравновешивают пятью объемами стартового буфера (0,1 М пиридинацетатный буфер pH 3,5) при температуре 50 °С, которая поддерживается в ходе всего анализа. Вначале элюирование ведут помощью линейного градиента концентрации и pH пиридинацетатного буфера — от 0,1 М пиридина и pH 3,5 до 2,0 М пиридина и pH 5,0. Такой градиент получают, помещая по 259 г стартового буфера (0,1 М, pH 3,5) и конечного буфера (2,0 М, pH 5,0) в два сообщающихся у дна сосуда-смесителя с одинаковым внутренним диаметром. Это устройство аналогично простому градиентному устройству, изображенному на рис. 6Ь в работе Блока и Линга [157]. Отводящую линию из первого сосуда смесителя соединяют через кран с насосом. Рекомендуется использовать трехходовой кран, для того чтобы в систему можно было включить третий буфер. [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология