Радиоавтографии метод продуктов

Присутствие в органическом соединении небольших количеств радиоактивных побочных продуктов или продуктов распада невозможно установить ни при помощи классических критериев степени химической чистоты [ЮЗ], ни в результате использования обычных химических и физических тестов. Хотя радиоактивные загрязнения составляют небольшую часть общего количества вещества, однако они могут составлять значительную долю общей радиоактивности. Наиболее подходящим способом определения изотопной чистоты соединения является разделение исследуемого препарата при помощи какого-либо хроматографического метода на химически чистые фракции с последующим определением содержания в них радиоактивных изотопов. Наиболее удобным способом является, вообще говоря, бумажная хроматография в сочетании с радиоавтографией [104—107]. Если на рентгеновской пленке обнаруживается только одно пятно, то это указывает на высокую степень изотопной чистоты исследуемого образца. Очевидные преимущества этого метода состоят в чувствительности и экономии вещества, а также в возможности оценки самопроизвольного распада путем сравнения радиоавтографов, полученных в разное время [108—ПО]. [c.30]

Совершенно очевидно, что при изучении метаболических путей с помощью радиоактивной метки необходимо соблюдать определенные условия опыта и учитывать возможные ограничения этого метода. В процессе равновесно и непрерывно действующих метаболических превращений концентрации и количества различных биохимических промежуточных соединений достигают постоянных величин. Пул определенного метаболита достигает постоянного размера, когда между скоростью образования и убыли этого метаболита устанавливается равновесие, т. е. когда в системе устанавливается стационарное состояние. Так осуществляется регуляция метаболических путей у микробов, когда деление клеток протекает с постоянной скоростью при неизменяющейся внешней среде. В этих условиях радиоактивность начнет включаться в первый метаболит, удельная радиоактивность этого метаболита будет повышаться, пока не сравняется с удельной радиоактивностью источника изотопа, вводимого в клетки. Тем временем изотоп начнет включаться в следующий метаболит, и там быстро установится та же удельная радиоактивность, хотя количество включенной радиоактивности, как и в первом случае, будет зависеть от величины пула этого метаболита. Таким образом, определяя радиоактивность, можно выяснить последовательность реакций, но только в том случае, если равновесные концентрации метаболитов остаются постоянными. Ясно также, что в ходе данной последовательности реакций может происходить образование какого-то промежуточного продукта, кинетика образования и распада которого будут таковыми, что его пул будет очень незначительным. Тогда радиоактивность пула может оказаться настолько незначительной, что это соединение будет невозможно идентифицировать на хроматограмме. С другой стороны, не исключено, что меченое соединение, не являющееся членом рассматриваемой последовательности реакций, будет быстро образовываться из какого-нибудь промежуточного соединения. Так, щавелевоуксусная кислота может быть настоящим промежуточным соединением, а при радиоавтографии все-таки будет обнаруживаться аспарагиновая кислота. Этот может произойти в результате быстрого обмена углеродными скелетами между щавелевоуксусной и аспарагиновой кислотами, если пул последней будет значительно выше. Данные о существовании определенного метаболического процесса, полученные с помощью изо- [c.37]

Обработка растений мечеными соединениями и обнаружение меченых соединений на расстоянии от места обработки с помощью жидкостной сцинтилляции и радиоавтографии высоко чувствительны. То, что меченое соединение является действительно взятым соединением или продуктом его превращения, требует дальнейших доказательств, таких, как метод разбавления изотопами [31]. [c.265]

Кук [32] сообщил о получении )-маннозы-1-С по методу II. Продукт был выделен в виде фенилгидразона в условиях, препятствующих образованию глюкозазона [33], а затем регенерирован бензальдегидом. Методы хроматографии на бумаге и радиоавтографии свидетельствуют об однородности полученного продукта. [c.449]

Далапон адсорбируется, перемещается и накапливается в растениях главным образом в виде исходного химического соединения [18, 31—34, 39—42]. В наиболее тщательных исследованиях метаболизма далапона растениями применяли радиоавтографию, экстракцию и разделение, прямые измерения активности с помощью счетчиков и различные методы хроматографии на бумаге для анализа гербицида и возможных продуктов его метаболизма. [c.208]

Рис. 4-66. Семейство меченных но 5 -концу фрагментов ДНК. полученных в результате рестрикции по определенному нуклеотиду (в данном случае основание А) Анализируемая цепь ДНК - продукт денатурации двухцепочечной молекулы, вьщеленной с помощью метода, описанного на рис. 4-65, Б. Эт> цепь подвергли мягкой химической обработке, удаляющей из цепи некоторое количество одного из четырех нуклеотидов при этом большинство таких нуклеотидов остаются в цепи. Поскольку только фрагменты, указанные на рисунке слева, содержат 5 -конец и Р-фосфатную группу на ней, именно эти фрагменты регистрируются после радиоавтографии геля. Данная процедура лежит в основе химического метода

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полиакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице I. Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательностн олигонуклеотидов в таблице 12. Это следует нз анализа относительных подвижностей продуктов самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке С, следующий по подвижности н длине — в колонке Т, далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида. [c.321]

О-глюкозы-Сб" над никелем Ренея. Как установлено методами хроматографии на бумаге и радиоавтографии, полученный продукт не содержит радиоактивных примесей. [c.509]

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3 "-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [c.103]

Вещество, оказавшееся однородным после применения различных методов хроматографического разделения, можно рассматривать как хроматографически чистое . На рис. 44 приведен радиоавтограф тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Фирма-изготовитель указала, что чистота каждой такой кислоты была подтверждена методом газовой хроматографии. Рис. 44 показывает, однако, что ати продажные препараты, все без исключения, представляют собой смеси. Почти все загрязнения — промежуточные продукты синтеза этих кислот — более полярны, чем сами жирные кислоты. Они, по-видимому, застревают в газохроматографической колонке и не регистрируются в элюате. [c.181]

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии. [c.316]

После испытания на скольжение снимали радиоавтограф для определения переноса металла. Этот метод определения переноса особенно пригоден, когда более мягкий полусферический образец скользит по более твердому плоскому образцу. Количество и распределение частиц продуктов износа на плоской новерхности определяли с достаточной точностью по вьоывавшим-ся ими потемнениям пленки, поскольку отсутствие царапин на поверхности плоского образца повышало точность радиоавтографа. При опытах выяснилось, что применение мягкого металла нри длительном контакте, сопровождающемся износом, устраняет значительное выкрашивание металла из твердой поверхности. В тех случаях, когда наблюдался значительны неренос металла, отличные четкие радиоавтографы снимали ири краткой экспозиции с помощью мелкозернистых пленок. При малол переносе металла применяли более чувствительную пленку. П.1генки проявляли обычным способом, после чего сравнивали результаты различных опытов. [c.265]

Индивидуальные фенолоаминокислоты обычно выделяются методами бумажной хроматографии [156, 158]. Только два вида растворителей получили широкое применение смеси бутанол — уксусная кислота — вода и алифатические спирты, насыщенные разбавленным аммиаком. Специальные растворы для опрыскивания с целью обнаружения этих кислот (в дополнение к нингид-рину и неэффективному диазотированному амину [159]) приведены в табл. 2. Очень чувствительна реакция со смесью сульфат церия — мышьяковистая кислота предел обнаружения составляет 0,005 мкг [ Ъ9, 160]. Иодированные соединения можно метить а затем обнаруживать методом радиоавтографии [155, 161]. Имеются данные по величинам Rf и окраске следующих веществ продуктов окисления триптофана (производных хинолина) [162, 163, 164], производных индола [165], продуктов окисления тиронина [166] и тирозина (см., например, [13]). [c.64]

Изучение поведения актиноидов и лантаноидов в системе НС1— вода—изопропанол проведено в [477, 478] при хроматографировании на готовых целлюлозных пластинках, анионитах и катионитах. Установлено, что наилучшее разделение актиноидов происходит при ТСХ на анионите путем элюирования 1 N НС1 в 60%-ном изопропаноле. Отделение РЗЭ от актиноидов может быть достигнуто при элюировании водно-органическим 3 JV раствором НС1 на тонком слое катионита. Методом радиоавтографии, которую производили несколько раз через различные промежутки времени, на хроматограмме были обнаружены все возможные дочерние продукты и примеси актинои- [c.136]

Локализация ферментов гистохимически устанавливается либо с иомои(Ью цветных реакций на продукты ферментативных реакций, либо путем 11сиользования т. н. хромогенных субстратов — веществ, в результате ферментативного превращения к-рых образуются окрашенные плохо растворимые соединения. Наряду с применением обычной микроскопии в Г. широко используются электронная, ультрафиолетовая и флуоресцентная микроскопия, радиоавтография (при использовании радиоактивных изотопов для изучения обмена веществ) и др. методы исследования. [c.475]

Н-и-Триазоло[с(1 пиримидин-5, 7(4Н, 6Н)-дион-За-С (и -5-С ) получают из соответствующих азагуанинов 5-амино-1Н-f-триазоло [d] пиримидинола-Т-Ра-С " ] (и -5-С ) по описанному ниже методу Роблина [1]. По данным о спектре поглощения в ультрафиолетовой области, хроматографии на бумаге и радиоавтографии установлено, что продукт однороден. [c.199]

С (примечание 4). Смесь 15,0 г 6, 10-диметилун-декадиен-5, 9-она-2-[Сг ], 10 г 1, 4-дибромбутапа, 2, 3 г магния и кристаллика йода нагревают в атмосфере азота на паровой бане в течение 30 мин. Затем приливают 45 мл абсолютного эфира и кипятят смесь с обратным холодильником в течение ночи, добавляя по кристаллику йода каждые 45 мин. По окончании кипячения реакционную смесь гидролизуют водой и разбавленной соляной кислотой, эфирный экстракт сушат и концентрируют перегонкой. К раствору добавляют 30 мл сухого бензола и 15 мл трехбромистого фосфора и нагревают смесь на паровой бане в течение 12 час. Затем смесь охлаждают, выливают в разбавленную соляную кислоту с ледяной водой, отделяют водный слой и экстрагируют эфиром. Экстракты объединяют, промывают разбавленной щелочью, водой и насыщенным раствором поваренной соли, затем сушат и отгоняют растворители. Остаток кипятят с обратным холодильником в течение 3 час., добавляя 60. чл коллидина. Затем смесь разбавляют водой и экстрагируют четырьмя порциями эфира. Экстракт промывают, сушат и разгоняют, собирая фракцию, кипящую ири 210—212° (1,5 мм рт. ст.) выход 3,1 г (19,7%). Методами хроматографии на бумаге и радиоавтографии установлено, что продукт идентичен сквалену [1], выделенному из гексагидрохлорида, полученного из природного соединения (примечание 5). [c.241]

В качестве аналитических методов при изучении персистентности и степени разложения трифлоралина используют тонкослойную хроматографию, газовую хроматографию и радиохимические методы, в том числе радиоавтографию и методы изотопного разбавления. Исследования проводились с трифлоралином, меченным С в различных положениях [26] в пропильных группах, трифтор-метильной группе и бензольном кольце . Чтобы можно было провести анализ продуктов разложения, в методики вносились необходимые изменения. [c.251]

В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Непременным условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью высоковольтного электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в достаточно широком диапазоне, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность секвениро-ванного участка ДНК. [c.20]

Возвращаясь к порядку нанесения образца ДНК на секвенирующий гель, стоит обратить внимание на последовательность расположения различных типов реакций. Так, при секвенировании ДНК методом химической деградации, его классическим вариантом, в первой дорожке обычно разделяются продукты G-реакции, во второй - G + А, в третьей - С + Т ив четвертой - С. Данная последовательность является палиндромом (GRY ), поэтому в случае необходимости чтения противоположной цепи ДНК можно просто повернуть радиоавтограф вокруг своей вертикальной оси на 180° и таким образом читать комплементарную цепь. Конечно, последовательность комплементарной цепи можно потом легко получить с помощью компьютера, однако на стадии чтения различных субклонов, в случае если их последовательности принадлежат разным цепям, это имеет некоторый смысл. Однако существуют некие правила чтения тех или иных нуклеотидов в связи с их окружением и поэтому такое комплементарное чтение не тех нуклеотидов может привести к увеличению числа ошибок. [c.180]

Задачи, стоящие перед исследователями, требовали определения нуклеотидных последовательностей довольно протяженных фрагментов ДНК, которые не могли быть прочитаны за одно электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. В первые годы секвенирования ДНК предел чтения с радиоавтографа геля редко превышал 250-300 нуклеотидов для одной матрицы. Да и фермент ДНК-полимераза I, ее Кленовский фрагмент, имея низкую процессивность, не мог эффективно строить комплементарную цепь ДНК большой протяженности. Метод химической деградации вкупе со стандартным гель-электрофорезом того времени также не позволял читать более 250-300 нуклеотидов. В связи с этим решение проблемы секвенирования больших вставок, нуклеотидные последовательности которых не могли быть определены в одном эксперименте, заключалось в выработке специальных подходов. С течением времени, благодаря различным новшествам, разрешающая способность методов секвенирования заметно возросла и за счет этого увеличился оптимальный размер вставок до 500 и 1000 пн, позволяющий определить их последовательность в процессе одного электрофоретического разделения. Резко возросли и задачи, предполагающие уже определение нуклеотидных последовательностей еще более крупных фрагментов ДНК или даже целых геномов. Все это привело к разработке большого числа различных стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК, к рассмотрению которых мы и приступаем. [c.234]

Первые успехи в автоматизации секвенирования ДНК, пожалуй, можно связать с полуавтоматическими и автоматическими методами. чтения последовательности нуклеотидов с радиоавтографа секвенирующего геля или даже еще с более ранней автоматической обработкой и анализом последовательности нуклеотидов с помощью компьютеров и специализированных программ. Однако в настоящее время под автоматическим секвенированием ДНК понимается, в первую очередь, электрофоретическое разделение флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК. Другой аспект автоматизации процесса секвенирования ДНК заключается в наработке матриц для их последующего ферментативного секвенирования, а также проведении секвенирующих реакций (как в ферментативном методе, так и в методе химической деградации) с помощью лабораторных биороботов. [c.309]

ИСХОДИТ в случайных сайтах, образуется набор цепей всех возможных длин, начиная с 5 -конца праймера до сайтов, соответствующих положению присоединенного дидезоксинуклеотида (рис. 7.12). Новосинтезированные цепи являются радиоактивно меченными, поскольку в реакции используется по меньщей мере один радиоактивно меченный дезою и-нуклеозидтрифосфат. Часто им является а- -Р-дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть также 8-(а-тио)-дезоксинуклеозид1рифосфат (рис. 7.13). Иногда используется радиоактивно меченный праймер. Продукты четырех реакций подвергают одновременному электрофорезу на отдельных дорожках, как при химическом секвенировании. Последовательность считывают с радиоавтографа, который выглядит так же, как и радиоавтофаф, полученный при использовании химического метода секвенирования (рис. 7.10). [c.326]

Смотреть страницы где упоминается термин Радиоавтографии метод продуктов: [c.78] [c.475] [c.59] [c.116] [c.172] [c.177] [c.373] [c.391] [c.400] [c.585] [c.185] [c.268] [c.256] [c.266] [c.202] [c.143] [c.358] [c.49] [c.21] [c.49] [c.98] [c.114] [c.168] [c.202] [c.223] [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология