Метод двойной метки

Рнс. 7.7 Схема метода двойной метки. Р Р, ...РоР,Р, [c.144]

Возможности этого метода, подобно более общему методу двойной метки, лимитируются трудностью разделения олигонуклеотидов с длиной цели п а п+1. Как показано на рис. 7.9, разделение олигонуклеотидов с 15 и 16 отрицательными зарядами происходит не полностью. Использование более тонких различий, например, в нуклеотидном составе или в последовательности, также может оказаться неэффективным, если вещества очень близки и в этом отношении. [c.147]

Георгиев исследовал механизм ингибирования синтеза РНК гистонами методом двойной радиоактивной метки. АТФ или ГТФ, меченные Р-фосфатом, использовались для определения [c.296]

Описанный метод позволяет проводить измерения соединений с двойной, меткой с такой же точностью, как и соединений, меченных одним радиоизотопом. [c.446]

Для измерения С и других изотопов с более высокой энергией излучения можно применять все три перечисленных метода, и выбор одного из них определяется соображениями, изложенными выше. БХ при работе с двойными метками применяют редко, и в этом случае предпочтительнее пользоваться методом жидкостного сцинтилляционного счета или авторадиографией с выборочной маскировкой. [c.48]

Флюорография пластин ПААГ. Плодотворность использования препаратов, меченных тритием, а также стабильной двойной метки Н/ С заставила разработать методы флюорографии и для пластин ПААГ. Очевидно, что здесь нельзя обойтись опрыскиванием или даже вымачиванием геля в растворе сцинтиллятора. Сцинтиллятор надо принудительно ввести внутрь геля, а для этого в первую очередь следует заменить воду в объеме геля жидкостью, способной растворять ППО. В качестве такой жидкости можно использовать диметилсульфоксид (ДМСО). Важным преимуществом здесь является относительно малая деформация геля при замене воды в нем на ДМСО. Подробная процедура была предложена в 1974 г. Боннером и Ласки. Сейчас ее, по-видимому, уже можно считать устаревшей (см. ниже), но ввиду чрезвычайно широкой распространенности имеет смысл процитировать ее подробно. [c.228]

При многих биохимических анализах обычно требуется определить ничтожные — 10 моля) количества вещества. Химические же методы редко позволяют определять количества меньше 10 моля. Это ограничение было преодолено развитием техники радиоактивных меток и созданием чувствительных детекторов радиоактивности, позволяющих надежно определять многие вещества в количествах 10 моля. Кроме того, использование радиоактивных меток дало толчок для развития плодотворных экспериментальных подходов к решению разнообразных проблем. Такие подходы включают технику двойной метки для одновременного наблюдения за двумя соединениями или для распознавания двух идентичных веществ, синтезируемых в разное время метод импульсной метки, позволяющий наблюдать за соединением после его образования без помех со стороны конкурентно синтезируемого вещества анализ процессов обмена для определения участия в реакциях. [c.95]

Еще не использованы такие возможности методов ЭПР, как изучение различий в релаксации в разных областях спектра [263]. Двойной электронный резонанс может оказаться полезным для определения расстояний между метками [267] (дальнейшие подробности см. в [255, 268, 269, 283, 284]). [c.346]

Если для проведения рецепторных или аналитических исследований необходимы меченые препараты с молярными радиоактивностями существенно более высокими, чем они могут быть получены за счёт гидрирования двойных связей (1,85-2,04 ПБк/моль), твердофазный метод начинает демонстрировать свои несомненные преимущества перед жидкофазным методом. За счёт того, что гидрирование можно вести при нагревании, создаются благоприятные условия для дополнительного включения метки реакцией изотопного обмена (табл. 19.1.22). Кроме того, используя твердофазный метод за счёт изменения селективности процесса, можно увеличить выход искомого продукта, если при гидрировании образуются а-, -изомеры, например, при гидрировании 4,5-двойных связей в производных прогестерона [46. [c.520]

Особо чувствительный метод двойной метки основан на применении меченого ( Н]-дансилхлорида в качестве реагента и меченой [ С]-аминокислоты как внутреннего стандарта. Отношение Н С в дансильном производном зависит от отношения количества добавленной ( 0]-аминокислоты к концентрации немеченой аминокислоты в пробе. Этот метод особенно подходит для идентификации аминокислот в биологическом материале. Его чувствительность лежит в пикомольной области [196]. [c.66]

Dawson и Field [в] усовершенствовали метод двойной метки, использовав два слоя авторадиографической съемной эмульсии. С помош,ью первого слоя регистрировалось преимуш,ественно распределение трития, в то время как второго слоя могли достичь только р-частицы, обладающие более высокой энергией. Слои отделялись друг от друга целлоидином и зерна серебра в одном либо в обоих слоях могли быть окрашены методом дифференциального связывания краски. Применяя метод двойной или однократной метки, авторы нашли, что облучение HeLa клеток в дозе 300 или 500 р увеличивает общее время генерации, не влияя на продолжительность синтеза ДНК в основном удлиняется период Gi. [c.191]

С другой стороны, высокая энергия -частиц, испускаемых С, обеспечивает их прохождение через эмульсию в среднем на 10 мкм, так что увеличение толщины эмульсии, снижая разрешение, увеличивает число образующихся зерен серебра. Это делает возможным применение метода двойной метки, когда ДНК клеток метят Н- и С-тимидином и покрывают двумя слоями эмульсии (Baserga, 1961 Dawson et al., 1962). Нижний слой содержит зерна, засвечиваемые -частицами как от Н, так и от , но только последние могут засвечивать зерна в верхнем слое. Фокусируя объектив микроскопа на тот или иной слой, можно выявить клетки, меченные только С. С помощью этого метода измеряли вступление клеток в фазу S и выход из этой фазы (Lala, 1968). [c.174]

Таким образом, можно обойтись и без дорогостоящего аминокислотного анализатора. Более того, метод двойной метки оказывается более гибким. Например, можно вести анализ только по некоторым интересующим аминокислотам, вырезая нужные пятна. Метод удобно использовать и для анализа белков бактериальной стенки, где присутствие большого количества аминокислот из пептидогликанов понапрасну перегружает аминокислотный анализатор, но не мешает разделению с помощью ТСХ. [c.268]

Наилучшие результаты дает применение Н в виде двойной метки, обычно вместе с (поскольку в этих случаях может быть применена одна система детектирования). Этот метод можно использовать для выяснения тонких деталей механизмов биосинтеза, в особенности его стереохимических аспектов (так как возможен синтез стереоспецифически меченных Н субстратов) [106, 107], а также для проверки интактного включения сложных промежуточных соединений если включение метки из последних происходит косвенным путем, то это обычно приводит к существенному изменению первоначального отношения Н/ С. Метод имеет свои недостатки, но он позволяет устранить многие из отмечавшихся выше неопределенностей. При очень высоких удельных активностях соединений, содержащих Н ( 1 мКи), атомы Н можно обнаружить и определить их положение в молекуле методом ЯМР этот метод использовали при изучении процессов биосинтеза [108], однако применение его ограниченно. [c.472]

Получить у лаборанта 0,1 М раствор КН4С1 и определить в нем pH одним из методов, описанных в работе № 16, по указанию преподавателя. Затем приготовить 0,001 М раствор ЫН4С1. Для этого пипетку на 10 мл ополоснуть полученным у лаборанта 0,1 Л1 раствором, после чего отмерить ею 10 мл этого раствора и внести в колбу вместимостью 1 л. Довести объем раствора до метки на колбе дистиллированной водой, закрыть колбу пробкой и тщательно перемешать раствор, переворачивая колбу несколько раз вверх дном. (При отсутствии мерной колбы на 1 л можно приготовить 0,001 М раствор двойным разбавлением сначала отмеренные 10 мл полученного 0,1 М раствора разбавить в 10 раз в мерной колбе вместимостью 100 мл затем пипетку на 10 мл сполоснуть вновь полученным раствором, отмерить ею 10 мл и вновь разбавить в другой колбе вместимостью 100 мл.) Определить pH приготовленного 0,001 М раствора хлорида аммония тем же методом, каким было сделано первое определение. [c.90]

Более надежный экспериментальный подход для решения этой задачи был предложен Харвудом, назвавшим его метод двойного радиометрического титрования [21, 22]. Этот метод был применен для оценки констант скоростей кислотного гидролиза полиметилмет-акрилата различной микроструктуры. Суть подхода заключается в следующем. Полимер, содержащий радиоактивную метку в каждом мономерном звене и обладающий хотя и однотипными по химическому строению, но с разной скоростью реагирующими группами, подвергается полимераиалогичной реакции, сопровождающейся отщеплением группы, имеющей метку. На промежуточной стадии реакции в силу различной реакционной способности функциональных групп полимер теряет больше быстро реагирующих групп, чем медленно реагирующих. Если обозначить быстро реагирующие звенья Б, медленно реагирующие — М, а уже прореагировавшие, превращенные, звенья — X, то схематически этот процесс можно представить следующим образом [c.40]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Полное удаление карбонильного кислорода нри электровосстановлении хорошо известно (см., например, [23, 407, 408]). Интересно отметить, что на платинированной платине, подвергнутой хотя бы кратковременной анодной поляризации, в серной кислоте единственным продуктом восстановления ацетона является пропан [332, 333]. Электровосстановлепие на свинце в сернокислом диоксановом растворе было использовано для замены карбонильного кислорода на водород или дейтерий в кетостероидах, причем присутствующие в молекулах оксигруппы и двойные связи не затрагиваются. Выходы продуктов достигают 85—97%, и электровосстановление является удобным методом дейтерирования 617, С19 и С20, т. е. тех мест, куда обычными химическими методами ввести метку трудно [409]. [c.52]

В последние годы для изучения реакций обмена радикалами между различными металлоорганическими соединениями широко используется метод ЯМР. Благодаря этому методу стало возможным изучать чрезвычайно быстрые процессы (динамику равновесных состояний), в частности такие процессы, которые вообще едва ли возможно обнаружить другими методами, например гомообмен (обмен радикалами между двумя химически тождественными молекулами, который, в принципе, можно наблюдать при помощи двойной метки). [c.55]

Бишоп с сотр. [42] описал методики точного определения удельной активности жирных кислот. Они основаны на использовании двойной метки и Н. Одна из методик включает анализ метиловых эфиров смеси жирных кислот, меченных тритием, с его повторением после введения С-эфира той кислоты, для которой нужно определить величину удельной активности. Первое разделение проводится на аналитической колонке, а второе — на препаративной. Величину удельной активности тритированного эфира можно рассчитать из соотношения С Н, определенного методом жидкостного сцинтилляционного счета, и из значений площадей пиков в обоих разделениях. Точность результатов, полученных таким методом, зависит от точности определения площадей пиков, которая обычно бывает невелика. [c.235]

Дальнейшим развитием метода спиновой метки является метод двойных парамагнитных меток [38]. Этот метод основан на одновременном использовании спиновых меток различных типов, присоединенных к различным функциональным группам молекулы биополимера. Так, азотокисные радикалы пришиваются по р-93 SH-rpynne гемоглобина, а молекулы красителя, содержащего парамагнитный ион меди, адсорбируются на катионные центры при помощи анионных сульфогрупп. При одновременном использовании этих меток наблюдается заметное уширение линий в спектрах ЭПР азотокисных радикалов вследствие обменного взаимодействия, возникающего при столкновении парамагнитных центров азотокисных и медьсодержащих меток. Это уширение зависит от расстояние между функциональными группами, к которым присоединены метки. Этим методом удалось подтвердить, что в непосредственной близости от р-93 SH-группы гемоглобина (на расстоянии 15А) расположен гистидиновый остаток. [c.358]

Для количественного определения стероидов использовали также андрогены с радиоактивной меткой. Шульце и Венцель [186] сконструировали специальный проточный газовый счетчик с плоской диафрагмой, предназначенный для измерения радиоактивности тонкослойных пластинок. Они продемонстрировали эффективность этого счетчика на стероидах, меченных Щ и " С. Риондель и др. [187] определяли содержание тестостерона в крови человека сцинтилляционным методом с применением сразу двух изотопов. При этом 1,2-Ш-тестостерон выполнял роль индикатора, а S-тиосемикарбазид — реактива. Чтобы удалить из тиосемикарбазона все примеси, его хроматографировали на тонком слое и на бумаге. Фактическое измерение проводили с диацетилпроизводным тиосемикарбазона. Спарагана [188] определял тестостерон в плазме крови методом изотопного разбавления с двойной меткой. Обрабатывая пробу меченным тритием уксусным ангидридом, он получал [c.320]

Г199. Улучшение разрешения при анализе высокочувствительным методом газовой радиохроматографии с двойной меткой. [c.226]

Другую группу бластоцистов инкубировали сначала в течение 4 ч без изотопа, потом на 1 ч добавляли [ 3]-метионин и промывали средой, содержащей 5мМ холодного метионина. Бластоцисты обеих групп смешивали, лизировали и проводили двумерное фракционирование их белков по методу О Фаррелла (см. часть I). Пятна индивидуальных белков локализовали флюорографией, затем по шаблону рентгеновской пленки вырезали из геля, солюбилизировали и для каждого из белков просчитывали двойную метку Н и 8. Отношение 8/ Н служило мерой скорости распада белков. Измерения динамики выведения метки из белков и соответствующие расчеты позволили оценить и абсолютные времена полужизни 60 индивидуальных белков. Они оказались в пределах от 1 до 30 ч. Более половины белков имеют время полужизни меньше 10 ч [Вг1пз1ет е1 а1., [c.264]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Методом авторадиографии была изучена редупликация кольцеобразной двойной спирали ДНК — единственной хромосомы Е. соИ. Включение тритиевой метки идет последовательно от нуклеотида к нуклеотиду. Хромосома редуплицируется, начиная с некоторого локуса [164] (см. также [6]). [c.537]

Очевидно, что после того как происходит гидрогенолиз связи иридий-уг-лерод активированным тритием, образуется препарат с меткой в орто-положе-нии. Действительно, используя эти иридиевые катализаторы, была получена целая серия меченых ароматических соединений с молярной радиоактивностью 0,3-4,5 ПБк/моль [16-20]. К недостаткам этого метода можно отнести то, что исходное вещество должно быть ароматическим соединением со строго определёнными заместителями, быть растворимо в хлористом метилене или хотя бы в ацетоне и тетрагидрофуране, а также то, что двойные, винильные двойные и сопряжённые еноновые связи гидрируются в ходе реакции. [c.492]

Роль стереохимии была понята уже почти столетие назад, но основные успехи в ее развитии достигнуты лишь в последнее десятилетие. Один из методов управления пространственной структурой состоит в том, что к реагенту присоединяют дополнительный молекулярный фрагмент определенной хиральности. Если правильно расположить такую хиральную метку , она будет определять хиральность продуктов реакции, образуюищхся из этого реагента. Затем хиральную метку можно удалить из продукта и снова использовать ее в другом цикле. Этим методом, например, были получены некоторые хиральные пропио-наты, использованные далее в качестве предшественников других биологически активных молекул. Еще более широкие перспективы открывает применение асимметрических (хиральных) катализаторов для управления хиральностью продуктов. Так, асимметрическое восстановление является основной стадией в промышленном синтезе важного лекарственного препарата леводофы, предназначенного для лечения болезни Паркинсона. Более общее назначение имеет асимметрическое эпоксидирование на асимметрических катализаторах. Если атом кислорода при образовании эпоксида способен присоединяться с равной вероятностью к двойной связи с любой стороны, то образуются два эпоксида, один из которых является зеркальным отражением другого. В настоящее время стало возможным получать любой их этих стереоизомеров, применяя недорогой хиральный катализатор, котоый можно использовать многократно. А полученные таким образом оптически чистые эпоксиды могут служить исходными со- [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология