Белки ковалентным связыванием

Синтез полимерных суспензий с заданным комплексом свойств. В процессе работы были получены устойчивые полимерные суспензии с узким распределением частиц по размеру и заданной поверхностной концентрацией функциональных групп. Иммобилизацию белков на латексе проводили двумя способами - физической сорбцией белка или ковалентным связыванием макромолекулы с поверхностью активированного латекса. Первый способ использовали для иммобилизации антител к наркотикам и конъюгированных антигенов К-ОВА и Г-ОВА на поверхность латекса, не [c.201]

Иммобилизованные ферменты могут быть использованы в качестве иммуносорбентов для выделения из антисыворотки специфических антител на эти ферменты. Эффективность адсорбции антител, количество адсорбированных антител и условия их элюции зависят от свойств иммуносорбента от количества связанного с матрицей белка-антигена, прочности связи антиген—носитель, конформации антигена и числа вовлеченных в ковалентное связывание субъединиц антигенов-олигомеров. [c.304]

Более стабильные ХМЭ получают с помощью реагентов, функциональные группы которых способны к образованию ковалентных связей с материалом электрода. Чаще всего используют кислородсодержащие соединения с окси-, гидрокси- или карбокси-группами, хотя возможно закрепление и других групп. В частности, для ковалентного связывания ферментов используют амино-, имидазольные и тиоловые группы боковых цепей аминокислот белка. Большим преимуществом ковалентного связывания является отсутствие утечки модификатора с поверхности электрода. При этом формируется устойчивый слой, который не разрушается при повторном использовании ХМЭ. Разнообразие методов связывания позволяет не затрагивать электроактивные функциональные группы. Тем не менее всегда необходимо специально изучать активность модификатора в растворе и в иммобилизованном состоянии. [c.481]

В составе клеточной стенки грамположительных эубактерий в небольших количествах также найдены полисахариды, белки и липиды. Для полисахаридов и липидов показана возможность ковалентного связывания с макромолекулами клеточной стенки в отличие от белков, которые (у тех видов, где имеются) формируют на ее внешней поверхности отдельный слой. [c.32]

Хотя существует много методов ковалентного связывания лиганда с полимерным носителем, наибольшее распространение получил метод, основанный на активации носителя бромцианом 28]. Активированный носитель, например агароза или полиакриламид, вступает в реакцию с аминогруппами лиганда. Часто, чтобы облегчить комплексообразование с большими молекулами или малыми лигандными группами, между носителем и лигандом встраивают углеводородную цепь длиной до 10 атомов углерода [29—30]. При выборе лиганда следует учитывать его сродство к выделяемому белку, способ связывания, концентрацию лиганда, тип изотермы сорбции и влияние температуры. [c.110]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых УФ-излучением, является образование пиримидиновых димеров в результате ковалентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже УФ вызывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных поперечных сшивок и поперечных сшивок между ДНК и белком. Ионизирующие излучения всех видов вызывают главным образом одноцепочечные разрывы в ДНК разрывов, поражающих обе цепи, обычно на порядок меньш.е. Различные химические мутагены индуцируют образование внутрицепочечных и межцепочечных поперечных сшивок и одноцепочечные разрывы ДНК. [c.129]

Почти все методы иммобилизации хемилюминесцентных меток включают следующие три основные стадии 1) химическую активацию хемилюминесцентного маркера 2) химическую модификацию белка или гаптена 3) ковалентное связывание с помощью бифункционального реагента. [c.139]

На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно иеск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами н матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит, хим, модификации молекул фермента низкомол, в-вамн или р-римыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств, затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат, влияния матрицы между ией и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов-спейсер (наз. также вставкой или ножкой ). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств, микроокружение. [c.215]

Чтобы наверняка в самом начале удалить все соединения низкой молекулярной массы, включающие сульфгидрильные группы и восстанавливающие агенты, рекомендуется пропустить образец в исходном буфере через гель с небольшими порами, позволяющий перехватить эти соединения. Реакцию соединения этих гелей с серосодержащими соединениями посредством ковалентного связывания можно легко контролировать, так как она характеризуется образованием 2-тиопиридона, обнаруживаемого при длине волны 343 нм. В случае, когда исследуемые белки имеют дисульфидные мостики, необходимо их химически восстановить (например, с помощью 2-меркаптоэтанола) и активировать (2,2-дипиридилдисульфидом). [c.84]

Хотя описан ряд методов селективного расщепления определенных пептидных связей белковой цепи на такие фрагменты, которые можно анализировать по методу Эдмана, щирокое использование нащли всего несколько из них. Наиболее популярным методом является использование бромциана для расщепления пептидных связей по остаткам метионина схема (22) . Остаток метионина превращается в гомосерин и его лактон, которые становятся С-концевыми остатками всех фрагментов, за исключением С-концевого фрагмента исходного белка. Так как Met встречается относительно редко, фрагменты, получающиеся после подобного расщепления, довольно крупны, но с помощью современных вариантов анализа по Эдману можно проводить анализ их последовательности. Более того, лактон гомосерина на С-конце является подходящим участком для ковалентного связывания таких фрагментов с нерастворимым носителем при твердофазном секвентном анализе см. схему (17) . [c.273]

В гелях, которые содержат активные сложноэфирные группы для прямого ковалентного связывания (например, активированная СН-сефароза, аффигель 10 или оксиалкилметакрилатные гели с п-нитрофенильной сложноэфирной группой), непрореагировавшие группы удаляют путем обработки 0,1 М трис-буфером (pH 8) через 1 ч в геле практически не остается групп, способных связывать белки или пептиды. Для носителей, которые содержат альдегидные группы в качестве активных связывающих групп, после связывания преимущественно используется восстановление борогидридом натрия. При этом происходит и восстановление остающихся альдегидных групп, стабилизация связей между белком и нерастворимой матрицей. [c.218]

Антисывороткн, ковалентно связанные с агарозой, целлюлозой и сефадексом, в системах радиоиммуноанализа белков и гаптенов исследовались Болтоном н Хантером [135], Показано, что ковалентное связывание с нерастворимой матрицей е оказывает неблагоприятного влияния на антисыворотку. Ухудшение чувствительности анализа обусловлено в большинстве случаев иространствен-ными затруднениями для высокомолекулярных антигенов. Богданов и Страш [131] указали на возможные ошибки радиоиммуно-анализа, возникающие из-за большого объема атома радиоактивного иода. [c.381]

Поступление, распределение и выведение из организма. В организме образуются активные метаболиты, ковалентно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами и SH-группами белков. Уровень rSH не оказывает влияния на ковалентное связывание метаболитов (Bolt et al.). При ингаляции крысам Б. в концентрациях от 100 до 6600 млн в выдыхаемом воздухе определялся ацетон — метаболит Б. (Filser et al.). [c.599]

При исследовании производных гемоглобина лошади оптическая асимметричная единичная ячейка пространственной группы симметрии С2 содержит пару о- и Р-субъединиц. Следовательно, можно оценить только среднее изменение ориентации для обоих гемовых групп. К тому же дезоксигемоглобин, представленный на рис. 11, модифицирован бифункциональным реагентом — бис- (N-малеимидиметиловым) эфиром. Ковалентное связывание этого реагента Р-субъединицами препятствует изменению четвертичной структуры, происходящему в немодифицированном дезоксигемоглобине [126]. Только в этом случае можно прямо сравнить поляризационные свойства Соре координационных производных гемоглобина со свойствами некоординированного белка в кристаллическом состоянии. Более подробно этот вопрос рассмотрен в работе [135]. [c.55]

Таким образом, в образовании истинных фермент-субстратных комплексов могут участвовать силы молекулярного взаимодействия практически всех типов, характерных для белков, за исключением, быть может, ковалентного связывания. Следует также отметить, что при связывании некоторых кофакторов резко увеличивается способность фермента к связыванию субстрата например, при координировании или хелатированни иона металла может создаваться мощный катионный центр. [c.60]

Используя для образования ковалентных сшивок соединения с различной длиной молекулы, можно определить близость расположения двух данных белков. Суть метода состоит в следующем нативные субчастицы обрабатывают реагентами, образующими ковалентные сшивки, с последующим анализом белков, вошедших в состав конгломератов. (Однако возможности этого метода ограничены анализом белков.) Ковалентные сшивки белков с рРНК позволяют определить места их связывания с нуклеиновой кислотой. Другие методы, с помощью которых были получены сравнимые результаты о местоположении белков,-это использование нейтронного рассеивания субчастиц, в которых определенные белки дейтерированы, и измерение энергии переноса между флуоресцентно меченными парами рибосомных белков. [c.107]

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образна Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспенифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя [c.177]

С помощью методики радиоактивного мечения установлено, что при введении химических канцерогенов животным (или при обработке ими клеток в культуре) происходит ковалентное связывание этих соединений или их метаболитов с клеточными макромолекулами (ДНК, РНК или белками). Исследована химическая природа продуктов, образующихся в результате взаимодействия некоторых конечных канцерогенов с их внутриклеточными мище-нями. Наибольший интерес вызывают комплексы, образованные с ДНК. Было показано, что канцерогены реагируют с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, а также с фосфодиэфирными группами ДНК. Наиболее часто мишенью служит гуанин, при этом канцерогены присоединяются к N-2, N-3, N-7, 0-6 и 0-8 — атомам этого основания. [c.355]

Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате создания иммобилизованных ферментов. Дж. Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизованная), сохраняет каталитическую активность. В 20—30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были продолжены, однако исследования этого периода представляли главным образом академический интерес и не преследовали практических целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили первый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Принципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. И. Груб-хофером и Д. Шлейтом, впервые применившими метод ковалентного связывания. [c.6]

Способ иммобилизации влияет на иммунный ответ организма. Ковалентное связывание с полисахаридами, полиэтиленгликолем во многих случаях приводит к снижению иммуногенности препарата, поскольку матрица носителя не допускает контакта с рецептором. С другой стороны, связывание с носителями-полиэлектролитами неоднократно приводило к повыщению иммуно генности препарата. Применение полиакриловой кислоты, поли-винилпиридина и его производных, полимеров на основе О-глутаминовой кислоты и О-лизина в качестве носителей позволило получить препараты, дающие высокий иммунный ответ. На это могут быть разные причины. Возможно, полиэлектролиты образуют прочные комплексы с белком нековалентного типа, которые медленно высвобождают активное начало (белок без какой-либо химической модификации) с более или менее постоянной скоростью или полиэлектролит в комплексе с белком может удерживаться в районе рецептора, высвобождая белок-антиген. Сейчас трудно дать объяснение этому явлению. Но, с другой стороны, полиэлектролитные комплексы могут быть основой создания вакцин нового типа, позволяющих повысить иммунный ответ в организме животных и способствующих выработке антител к любым антигенам (Р. В. Петров, В. А. Кабанов, 1982). [c.127]

В публикациях, посвященных исследованию свободных жирных кислот и их производных, используются различные названия химических и биологических соединений этих веществ и их свободных форм. Это приводит к разночтениям и неоднозначной трактовке результатов. Наиболее уязвим термин свободные жирные кислоты (СЖК) . Свободные означает не эстерифицированные . Но часто его употребляют в смысле не связанные с белком . Эстерифицированные ЖК, однако, уже не являются собственно ЖК — это эфиры, а не жирные кислоты. Но для этой группы соединений иногда необоснованно применяется термин связанные жирные кислоты , это создает путаницу, так как физико-химический анализ указывает на возможность ковалентного связывания жирных кислот с белковыми или фосфолипидными молекулами. Особенно активно связывает жирные кислоты с помощью гидрофобных взаимодействий альбумин. [c.14]

Принцип ТФ-анализа аминокислотной последовательности заключается в ковалентном связывании пептида с нерастворимым носителем и последующим отщеплении (при помощи ФИТЦ) аминокислот от пептида, связанного с носителем. Разработан набор методов присоединения пептидов и белков к носителям, применяемым в виде шариков (производные полистирола или стекла, содержащие различные функциональные группы [33]). Носитель с ковалентно присоединенным пептидом (пептидил-носитель) можно упаковать в колонку и тщательно промыть реагентами и растворителями, используемыми в процессе анализа (при этом в отличие от ЖФ-метода нет опасности вымывания образца). После проведения полного цикла отщепления анилинотиазолинон АТЗ-аминокислоты вымывают из колонки, а пептид, укороченный на одну аминокислоту, остается присоединенным к носителю и доступным для проведения следующего цикла реакций. [c.375]

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, 8Н-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модифика ция ие должна затрагивать функдиональных групп активного [c.57]

Известно большое количество методов для получения конъюгатов с лЧоминолом. Часть методов вк яючает стадию образования активных альдегидных групп при окислении углеводных остатков и гаптенов перйодатом натрия. Активные альдегидные группы на молекуле белка реагируют с ароматической аминогруппой с обр-а-зованием основания Шиффа. Для ковалентного связывания люминола с модифицированными белками и гаптенами используют также глутаровый альдегид и карбодимиды. [c.139]

Твердофазные иммунореагенты вначале использовали для выделения антигенов и аитител. Впоследствии иммобилизованные антитела применили для радиоиммуноанализа белков [1, 2] и гаптенов [3,4 ], где с их помощью удалось упростить разделение свободного и связанного с антителами определяемого вещества. Реагенты (антитела или антигены) связывали с носителем или ковалентно, или с помощью пассивной адсорбции. Ковалентное связывание требует проведения химических реакций и тщательной очистки готового продукта. Связывание путем пассивной адсорбции занимает много времени, а полученные таким способом реагенты сложно ис- [c.52]

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителе.м производят по возможности в мягких условиях, чт )бы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления иммуносорбеита крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины. [c.242]

При использовании веществ с мол. массой менее 5—10 кДа необходимо их ковалентное связывание с белком-носителем. В ответ на иммунизацию образуются антитела и к детерми- [c.34]

Это вещество вызывает клонико-тонические судороги у экспериментальных животных через несколько часов после введения. При этом его токсичность не имеет существенных видовых различий, мало зависит от пути введения и сопоставима с таковой для /Х и зарина. Так ЛД50 при внутримышечном введении у крыс для УХ составляет 0,0096, зарина 0,095, норборнана 0,1 мг/кт при внутривенном введении собакам эти величины составляют соответственно 0,006, 0,012 и 0,045 мг/кг, при внутримышечном вве/).ении кошкам - 0,0038, 0,014 и 0,069 мг/кг. Длительность развития судорожного синдрома вплоть до его финальной стадии, в отличие от других конвульсантов-блокаторов хлор-ионных каналов, для норборнана, вероятно, обусловлена особенностями его неконкурентного и необратимого, возможно, ковалентного связывания с белками ионофора ГАМК-рецепторного комплекса [А.И. Головко, [c.19]

Для приготовления антигенных иммуносорбентов используют два способа. В первом из них достаточно концентрированный раствор антигена превращают в пространственную сетку, сшивая молекулы белка между собой глютаровым альдегидом или другим бифункциональным агентом. Второй способ состоит в ковалентном связывании антигена с гидрофильной водонерастворимой полимерной матрицей типа полиакриламида, агарозы или сефадекса. [c.110]