Агароза с антителами

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Иммунологическая количественная оценка компонентов после гель-фильтрации возможна главным образом при осуществлении несколько модифицированного метода Манчини [58]. В этом случае после гель-фильтрации проводят иммунодиффузию в геле агарозы, содержащем антитела. Существенным моментом в этой методике является создание надежного контакта геля агарозы с гелем сефадекса при сохранении полученной картины разделения. Это удается осуществить, осторожно помещая 1,5%-ный гель агарозы размером 10-10 см на слой сефадекса. По-видимому, этот метод найдет применение при количественном анализе белков, способных к образованию полимеров. На рис. 8 приведен пример количественного анализа высокомолекулярного секреторного JgA в присутствии мономера JgA [59]. [c.272]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ АГАРОЗЫ, СОДЕРЖАЩЕМ АНТИТЕЛА [14] [c.154]

Принцип метода. Анализ включает две стадии а) электрофорез исследуемого белка в геле агарозы и б) повторный электрофорез полученных фракций в геле, содержащем антитела, перпендикулярно к направлению первого разделения. Полоску геля, содержащего фракции исследуемого белка, полученные на первой стадии, помещают на пластинку геля агарозы, содержащего [c.154]

Фиг. 33. Анализ белков с помощью электрофореза в геле агарозы, содержащем антитела (объяснения см. в тексте).

Помимо очистки ряда ферментов, их ингибиторов или субстратов, которые можно попеременно фиксировать на матрице, аффинная хроматография позволяет выделять антитела и антигены, белки, осуществляющие транспорт гормонов и связывание витаминов. К аффинной хроматографии близко примыкает метод выделения ЗН-содержащих белков на ртутьорганических производных агарозы. Явление фиксации антител на производных агарозы открывает широкие возможности. В отличие от [c.453]

Хилл [17] осуществил элюирование антител с иммуносорбентов с помощью смесей диоксана со слабыми органическими кислотами. Использование сшитой агарозы для приготовления иммобилизованного группового вещества крови А позволило Кристиансену [23] применить для элюирования хаотропные ионы, а именно роданид, трихлорацетат и трифторацетат. Эффективность хаотроп- [c.271]

Полисомы Антитело к специфическому белку Агароза 349 [c.294]

Вильямсон и Аллисон [13] сделали попытку усовершенствовать стадию иммунопреципитации с помощью метода Лорелла [63], заключающегося в проведении электрофореза антигена в гелях агарозы, включающих антитела. Согласно предложенной методике, белки после разделения переносят на полоску фильтровальной бумаги, которую затем помещают на слой агарозы с антителами, и проводят электрофорез. Таким путем в сыворотке мыши удалось обнаружить до 20 компонентов [13, 64 В другом варианте удаляют лишний сефадекс по Хансону [14 а затем осторожно переносят весь гель агарозы с антителами на полоску сефадекса. По такой методике выполнен анализ молекулярновесового распределения а-липопротеина нормальной сыворотки [65], приведенный на рис. 9. [c.275]

Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [c.275]

Другой тип двумерного разделения с применением изоэлектрической фокусировки — это метод, в котором используется иммунодиффузия. В этом методе разделение проводят изоэлектрической фокусировкой на полиакриламидном геле, а затем фрагмент геля вводят в агарозу, содержащую антисыворотку. После этого проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому разделению. Белки перемещаются в агарозу, и в ней появляются зоны миграции антигенов-антител [419]. [c.177]

В модифицированном методе [873] оба этапа электрофореза проводят на стеклянных пластинках размером 8ХЮ см. Для антигенов вырезают четыре круглые лунки. На первом этапе электрофореза, осуществляемом при напряжении 10—15 В/см, применяют охлаждение. После завершения электрофореза по краям пластинки удаляют слой геля шириной 10 мм, а остальной гель разрезают на четыре полоски, параллельно направлению электрофореза. Тонким лезвием бритвы каждую полоску переносят на стеклянную пластинку такого же размера, как и первая (рис. 90,5). Полоску геля помещают на край пластинки, а ее свободную поверхность заливают агарозой, содержащей антитела. После того, как второй гель застынет, проводят электрофорез во втором направлении чри низком напряжении (2— 2,5 В/см) в течение 18—22 ч. [c.256]

НОГО конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] с антителами к ХМТ приводит к полному предотвращению образования комплексов между ХМТ— -галактозидазой и ГА-агарозой. Столь полного ингибирования связывания конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] с ГА-агарозой не наблюдалось в случае конъюгатов с молярными соотношениями ХМТ и -галактозидазы 4 1 или менее (рис. 16-4). Эти результаты указывают на необходимость подбора оптимального молярного соотношения -галактозидазы и ХМТ в конъюгатах для проведения эффективного определения методом ИФАПЗ. Снижение уровня фона путем очистки конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] на колонке с ГА-агарозой и высокая эффективность ингибирования связывания [ХМТ— -галактозидаза] с ГА-агарозой антителами к ХМТ [c.261]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

В/см. В ходе электрофореза белковые фракции диффундируют из полоски в гель, содержащий антитела. Мигрируя в нем под действием электрического поля, они образуют преципитационные пики в результате специфической реакции с соответствующими антителами. Контуры преципитационных пиков формируются благодаря электрофоретической миграции антигена, а также постепенному уменьшению его избытка в результате этой миграции в геле агарозы. (Известно, что избыток антигена растворяет иммунные преципитаты, поэтому полосы преципитации образуются только там, где избыток антигена исчезает благодаря электрофоретической миграции.) [c.156]

На стеклянную пластинку обычным способом наносят 1 %-ный гель агарозы, содержащий 2,5%-ную иммунную сыворотку анти-IgG. В затвердевшем геле агарозы вырезают нужное число круглых лунок для исследуемой сыворотки и IgG и заливают в них по несколько капель агарозного раствора. Препараты IgG известной концентрации в соответствующем разведении вносят в несколько лунок в остальные лунки заливают образцы исследуемых сывороток и проводят электрофорез, как описано выше. В зависимости от соотношения концентрации антигена и антител продолжительность электрофореза может варьировать от 2 до 10 ч. Электрофорезг следует закончить, когда прекратится увеличение преципитационных пиков, т. е. когда избыток антигена будет нивелирован электро- [c.156]

Для селективного выделения пептидов можно использовать иммуносорбенты, представляющие собой антитела ковалентно присоединенные к нерастворимому полимеру-иосителю. Среди последних нашли распространение носители на основе производных бром-ацетилцеллюлозы и гелей агарозы с ковалентно присоединенными антителами к 2,4-динитрофенолу, Такие носители применяются для выделения функционально важных пептидных фрагментов, содержащих реакционноспособные аминокислотные остатки после их селективного динитрофенилирования. Разработаны методики присоединения 2,4-дннитрофенильной группы к остаткам цистеина, метионина лизина и триптофана. [c.56]

Показано, что обработка цитохромоксидазы дициклогексил-карбодиимидом (D ) приводит к потере протон-транслоцирую-щей активности, а то аремя как транспорт электронов практически не затрагивается. D в данном случае модифицирует главным образом остатки Glu-90 субъединицы III. Этот район полипептида расположен внутри мембраны и структурно подобен D -связывающему участку протеолипида Н -АТФазы. Потеря протон-транслоцирующей активности происходит под действием антител к 111 субъединице. Препараты цитохромоксидазы. из которых избирательно удалена субъединица 111 (например, с помощью хроматографии комплекса на ДЭАЭ-агарозе), не способны к переносу протонов после реконструкции в липосомы транспорт электронов при этом не нарушается. [c.617]

Стабильность матрицы агарозы можно значительно повысить путем сшивания эпихлоргидрином [34, 56], 2,3-дибромпропанолом [34, 36] или дивинилсульфоном [34, 58] перед активацией бромцианом. Устойчивость в водной среде как в кислой, так и в щелочной областях (pH 3—14) растет с увеличением числа сшивок. Возможность использования хаотропных солей, главным образом для элюирования антител, обсуждается в разд. 10.2. Благодаря сшиванию гели приобретают большую устойчивость в органических растворителях, таких, как спирт, диметилформамид, тетра-гидрофуран, ацетон, днметилсульфоксид, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан и дихлорэтан — пиридин (1 1). [c.188]

Антитела к лизергииовой кислоте Агароза с длинной цепью гидразид- 730 [c.291]

Носителями в данном случае чаще всего служат ацетат целлюлозы [26] и гели агарозы [4]. Разрешающая способность таких систем очень низка из-за чрезмерного диффузионного размывания зон. Применение в качестве носителя крахмального или полиакриламидного геля значительно повышает разрешающую способность прежде всего благодаря молекулярно-ситовому эффекту. Иммуноэлектрофорез [56] является одной из разновидностей зонного электрофореза при постоянном значении pH после разделения белки диффундируют навстречу специфическим антителам и их взаимодействие приводит к образованию дуг иммунопреципитации. Полуколичественную оценку каждого антигенного компонента можно выполнить методом электроиммунодиффузии [57]. После разделения методом зонного электрофореза антигенные белки электрофоретически мигрируют в направлении, перпендикулярном прежнему пути, в гель, содержащий равномерно распределенные антитела. Высота образующихся пиков преципитации является мерой относительной концентрации белков в смеси. [c.120]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Сочетание электрофореза с двойной иммунодиффузией впервые описали в 1953 г. Грабар и Уильямс [460]. С тех пор было опубликовано большое число подробных обзоров, посвященных иммуноэлектрофорезу [80, 237, 261, 459, 952]. Исходный метод [460] обычно называют макрометодом (рис. 82), так как в нем применяют относительно большую стеклянную пластинку (13Х Х18 см), покрытую слоем геля толщиной 2—4 мм. В геле вырезают поперечную канавку и заполняют ее образцом, смешанным с расплавленной при 45 °С агарозой. После завершения электрофореза в геле вырезают продольные канавки (параллельные направлению миграции) и заполняют их раствором преципитирующих антител, специфических по отношению к [c.236]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

Электроиммуноанализ проводится следующим образом. Готовят 0,8—1,5%-ный золь агарозы в соответствующем буфере. После охлаждения золя до 45—55 °С его смешивают с антисывороткой или с выделенными антителами и формируют слой геля толщиной 1 — 1,5 мм. С этой целью теплый золь агарозы выливают на стеклянную пластинку, установленную строго горизонтально, или заливают агарозу в форму, образованную двумя стеклянными пластинками и U-образной рамкой. Рамку оставляют между стеклами до завершения электрофореза, но ее можно удалить и залить освободившееся пространство агарозой. Как правило, требуется сравнительно небольшое количество антисыворотки, но оно, естественно, зависит от ее титра. Для количественного анализа наиболее удобны пики преципитации высотой 20—30 мм. Работать следует с самым большим разведением антисыворотки, при котором еще возможно образование видимого преципитата. Разведение антигена должно быть подобрано соответствующим образом. Если исследуют антигены с мол. массой более 200000, то в этом случае особенно важно разбавлять реагенты до такой степени, чтобы происходила лишь слабая преципитация, поскольку крупные комплексы таких антигенов с антителами могут забивать поры в геле, что [c.248]

Лунки диаметром 3—4 мм вырезают в геле ближе к его катодному концу. Делают это с помощью пластмассового трафарета и металлической трубки с достаточно острыми краями. Простое приспособление такого типа описал Вееке [1384]. Лунки должны быть расположены на расстоянии не менее 6 мм друг от друга и 1—1,5 см от краев геля (во избежание краевых эффектов). Чаще всего используют 20—80 мМ вероналовые буферы с pH 8,6. При таком значении pH средняя подвижность антител в гелях агарозы близка к нулю. Электрофорез можно проводить либо при относительно высоком напряжении (8—10 В/см) в течение 2—4 ч (быстрый ракетный электрофорез, при котором необходимо эффективное охлаждение), либо при низком напряжении (2 В/см) более длительное время (удобно проводить электрофорез в течение ночи). [c.249]

Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Йохансон и йертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю. [c.255]

Стефан и Фрам [12S5] описали метод перекрестного иммуноэлектрофореза на пластинках размером 5X5 см. При электрофорезе в первом направлении в круглые лунки, вырезанные в-геле, вносят три параллельных образца. После электрофореза гель разрезают и полоску с электрофореграммой одной из крайних проб оставляют на пластинке, а две другие полоски переносят во влажную камеру и сохраняют в качестве резерва. На освободившуюся поверхность пластинки наливают золь агарозы, содержащий антитела, и проводят электрофорез во втором направлении, перпендикулярном первому. Авторы использовали стандартную кам еру для имм-уноэлектрофореза. Вееке [1385] описал аналогичный вариант данного м)етода. Электрофорез в первом направлении проводят на пластинках размером 10Х Х10 см. На каждой пластинке делают по восемь канавок (IX Х(3 мм) для образцов. После первого разделения полоски (1X5 ем) переносят на пластикки размеров 5X5 см для элект- [c.258]

В 1966 г. появились первые сообщения об использовании при электрофорезе крахмального геля в первом направлении и агарозного — во втором [725, 744]. Фагерхол и Лорелл [356] описали сочетание диск-электрофореза в крахмальном геле с электрофорезом в агарозном геле, содержащем антитела к антитрипсину, причем они обнаружили 12 хорошо разделившихся фенотипических вариантов (см. рис. 106). Крахмальный гель разрезали в горизонтальном направлении и из нижнего слоя (толщиной 2 мм) вырезали полоски шириной 2 мм, которые помещали в канавки, сделанные в геле, содержащем антитела. Пространство между краями крахмального и агарозного гелей заполняли жидкой агарозой, нагретой до 45 С. [c.260]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология