Константа комплекса фермент-ингибитор

Константа ингибирования К, при обратимом ингибировании — это константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор [c.182]

При анализе действия обратимых ингибиторов мы рассмотрели взаимосвязь между величиной /во и рациональной мерой реакционноспособности этих ингибиторов — константой диссоциации комплекса фермент — ингибитор. При этом было установлено, что величина /бо лишь в случае чисто неконкурентных ингибиторов совпадает с Кг- Уже для конкурентных обратимых ингибиторов при переходе от Ьо к Кг необходим учет величин константы Михаэлиса и концентрации субстрата, поскольку в системе устанавливается равновесие между Е, 3 и I (стр. 87). Что касается необратимых ингибиторов, то в этом случае использование /во для оценки их реакционноспособности без учета времени реакции не имеет никаких оснований. [c.113]

При исследовании обратимых ингибиторов определение зависимости константы ингибитора (константы диссоциации комплекса фермент — ингибитор Кд от температуры позволяет рассчитать А/ , АЯ и А5 для взаимодействия ингибитора с ферментом. При этом используются те же уравнения термодинамики, которые применяются для анализа реакции с субстратом. Таким образом, для реакции образования комплекса Е1 [c.135]

Конкурентное ингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определив влияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции от концентрации Субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу-конкурентному или неконкурентному-происходит обратимое ингибирование фермента (дополнение 9-3), весьма удобно преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в линейную форму. Чаще всего для этой цели используют метод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратных координатах, можно определить также значение константы диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Для реакции диссоциации [c.246]

Константа диссоциации комплекса фермент—ингибитор (i ) выражается уравнением [c.232]

В случае фермента химотрипсина в качестве конкурентных ингибиторов часто выступают оптические антиподы асимметрических субстратов. Разница между оптическими изомерами подразумевает взаимодействие между ферментом и субстратом в трех точках, как это изображено схематически на рис. 123, на котором группы Р и р субстрата присоединены к поверхности молекулы фермента группами А и В, а па чувствительную связь К воздействует группа С. В случае оптического антипода субстрата взаимодействующие группы Р и Q точно так же могут быть соединены с группами А и В, однако группа В теперь слишком далеко удалена от воздействующей на нее функциональной группы С. Согласно этой модели, можно было ожидать, что константы диссоциации комплексов фермент-субстрат и фермент-ингибитор почти одинаковы. Поскольку экспериментально доказано, что константы диссоциации многих комплексов фермент-ингибитор соответствуют значениям субстрата, в этом случае можно [c.326]

Уо К [ + PjК ) + конкурентное ингибирование продуктом. (2.379) Здесь — константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор [c.317]

Ингибиторы, структурно аналогичные субстрату, способны связы- аться с субстрат-связывающим центром. В случае истинного конкурент-.ного ингибирования должна иметь место конкуренция между субстратом и ингибитором за связывание с одним и тем же центром, а кроме того, связывание одного из этих лигандов должно исключать связывание другого. Сродство ингибитора к ферменту количественно выражается константой ингибирования Ki, которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором Е1 [c.27]

Поразительная специфичность действия ферментов привела к созданию теории замка и ключа, согласно которой для протекания реакции необходимо точное структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. Проведенные эксперименты убедительно доказали адекватность этой идеи, однако сама теория претерпела существенное изменение. Считается, что если фермент — это замок , а субстрат — ключ , то введение ключа в замок часто индуцирует конформационные изменения в молекуле белка. Имеется множество работ, в которых показано, что фермент укладывается вокруг субстрата, обеспечивая более точное соответствие подгоняемых структур. В пользу этого говорят данные по изменению спектров кругового дихроизма, спектров поглощения в УФ-области и констант седиментации, а также результаты исследования структуры комплексов ферментов с ингибиторами методом рентгеноструктурного анализа. Как мы уже видели ранее (гл. 4, разд. Д, I), идея индуцированного соответствия оказывается весьма плодотворной и при обсуждении взаимодействий субъединиц. [c.42]

Величину К = [Е] 1] / [ЕТ], которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором, называют константой ингибирования. Таким образом, при конкурентном ингибировании увеличивается константа Михаэлиса, а максимальная скорость ферментативной реакции остается неизменной. [c.226]

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

К1—константа равновесия диссоциации комплекса фермент— растворимый ингибитор [c.35]

В последнее время рядом авторов выведены более общие уравнения, связывающие стационарную скорость ферментативной реакции с концентрациями реагирующих веществ и кинетическими константами, характеризующими взаимодействие ингибитора с ферментом и фермент-субстратными комплексами на разных стадиях их превращения [2,3]. [c.90]

Подход к измерению константы продукта может быть двояким. Продукт реакции вводится заранее в систему фермент — субстрат, после чего измеряется зависимость начальной стационарной скорости реакции в ряду концентраций субстрата и продукта. Этот способ фактически ничем не отличается от способа исследования обычных обратимых ингибиторов. Он позволяет выяснить характер ингибирующего действия продукта реакции, т. е. установить, является ли он конкурентным, неконкурентным или смешанным, и измерить константу диссоциации комплекса фермент -г- продукт. [c.99]

Основная задача количественного изучения реакционной способности необратимых ингибиторов (ее иногда называют активностью ингибиторов) по отношению к ферментам — измерение констант скорости реакции ингибиторов со свободным ферментом, комплексом Михаэлиса и продуктами его превращения. В биохимической литературе, особенно в работах, где в центре внимания находится сравнительное исследование антиферментной активности биологически активных веществ (инсектицидов, лекарственных препаратов и т. п.), являющихся часто необратимыми ингибиторами, нередко в качестве меры их ингибирующего действия используют величину концентрации вещества, вызывающую снижение активности фермента на 50% (/во или —lg /во = р/во)- [c.113]

В этом случае значение кажущейся константы скорости ингибирования приближается к величине константы скорости реакции ингибитора с комплексом Михаэлиса и не зависит от дальнейшего увеличения концентрации субстрата. Это естественно, так как при избытке субстрата практически весь фермент находится в форме Е8. [c.122]

ТОГО, если данный комплекс важен при катализе, то константы диссоциации, измеренные при изучении связывания, должны приближаться к константам, определенным при изучении начальной скорости реакции в целом, хотя различие в используемых концентрациях белка может вызвать в некоторых случаях трудности при интерпретации. Необходимые константы могут быть получены из изучения начальной скорости для иона металла Ка) и для лиганда, если он является ингибитором Кг). Однако константы диссоциации комплексов фермент — субстрат и фермент — продукт не так легко получить, пока не сделаны допущения относительно скоростьопределяющей стадии реакции и (или) порядка присоединения субстрата (или отщепления продукта). Следовательно, утверждение о кинетической важности таких комплексов, наиболее интересных с точки зрения изучения механизма действия металлоферментов, связано с большими сложностями. [c.450]

В работе [8] было показано, что а-кетоглутарат является конкурентным ингибитором реакции окисления Ы-метил-Ь-глутама-та, катализируемого Ы-метилглутамат-дегидрогеназой. Определить константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор, исходя из данных табл. 9. [c.89]

Расчеты показали, что холинэстераза имеет в активном центре одну анионную группировку (заряд = —1), а ацетилхолинэстераза — две (заряд = —2). Однако исследованиями Шукудза и Шинода [122] установлено, что действие, например, тетраэтиламмония на оба типа холинэстераз характеризуются близкими кинетическими и термодинамическими константами. Так, значения рК/ для холинэстеразы сыворотки крови и эритроцитов равны 3,88 и 3,91, а теплота диссоциации комплексов фермент-ингибитор—6,0 и 6,5 ккал моль. На основании полученных данных авторы приходят к выводу [c.194]

В этом случае зависимость в координатах Лайнувера—Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся в точке на оси ординат (табл. 2.5). В этом уравнении К1 — константа конкурентного ингибирования, т. е. константа диссоциации комплекса фермент — ингибитор (Е1) которая отражает срод- [c.115]

При рН-скачке под действием импульса света наблюдается уменьшение поглощения комплекса, которое протекает с константой скорости к-х. Концентрации а-химотринсина и профлавина берутся Ю ч-10" М. Концентрация о-нитробензальдегида — 10 М. Измерение изменения поглощения комплекса проводят при 465 нм. Свободный профлавин имеет максимум поглощения 455 нм. Определяют константу скорости распада комплекса фермента с ингибитором. [c.325]

Определение константы скорости инактивации фермента ротено-ном. Выделяют препарат Кейлина—Хартри, Кювету рН-метра (объ-<емом 4,5 мл) заполняют средой измерения активности (п. 2) и добавляют НАДН до конечной концентрации в кювете, равной 1 мМ. В кювету погружают отмытый рН-электрод, через 2—3 мин вносят 50 мкл суспензии Кейлина—Хартри ( — 25 мг/мл) и регистрируют изменение pH в ходе НАДН-оксидазной реакции. По ходу реакции в кювету вносят ротенон (0,1 мкМ) и наблюдают ингибирование ферментативной активности, связанное с образованием каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон. Внося ингибитор в различных концентрациях (0,025 0,05 0,075 0,1 0, 5 мкМ), определяют зависимость скорости инактивации от концентрации ротенона и рассчитывают величину константы второго порядка скорости инактивации фермента ингибитором. [c.441]

Большинство внутриклеточных ферментов обладает олигомерной структурой, и поэтому связывание аллостерических эффекторов приводит к весьма интересным явлениям. Для получения соответствующих математических выражений необходимо ввести по паре констант связывания для ингибитора и активатора, характеризующих сродство к кон-формерам А и В. Поскольку при составлении уравнений материального баланса необходимо учесть все возможные комплексы, получающиеся выражения весьма сложны. Функции насыщения в модели Моно — Уаймена — Шанжё (гл. 4, разд. Д) пмеют довольно простой вид. В соответствии с уравнением (4-53) степень насыщения у для этой модели определяется следующим выражением ,1 [c.36]

Ингибиторы ферментативных каталитических реакций часта подразделяют на обратимо и необратимо действующие. Эта классификация основана на легкости отделения ингибитора от фермента при помощи физического метода типа диализа. Так, например, эзерин описан как обратимый ингибитор, в то время как фюсфор-содержащие соединения подобно диизопропилфосфофториду (ВРР) принадлежат к необратимым ингибиторам холинэстеразы. Однако, поскольку рассматриваются механизмы ингибирования, эта классификация только вносит неопределенность, так как из нее вытекает, что обратимые и необратимые ингибиторы действуют различным образом в действительности оба типа ингибиторов действуют, соединяясь с ферментом с образованием неактивных комплексов, обладающих весьма различными константами диссоциации . Необратимые ингибиторы образуют комплексы с очень малыми константами диссоциации и поэтому удаляются из комплекса путем диализа только очень медленно, тогда как обратимые ингибиторы образуют комплексы с высокими константами диссоциации и поэтому на всех стадиях удаления присутствует избыток несвязанного ингибитора, поддающегося диализу. Однако более полезным оказывается подразделение ингибиторов на конкурентные и неконкурентные (хотя многие ингибиторы обнаруживают смешанное поведение), так как эти ингибиторы действуют различными путями и кинетические уравнения для них разные. При конкурентном торможении ингибитор соединяется с тем же самым [c.121]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

В этой связи особый интерес представляет работа Фрица, Траучолда и Верле [69] по исследованию различных ингибиторов протеаз. Сначала на сефадексе Q-50 определяли молекулярный вес нескольких новых ингибиторов. При хроматографировании на сефадексе G-75 комплекс (1 1) трипсина (мол. вес 24 000) и его ингибитора (мол. вес 6500) элюируется в объеме, соответствующем молекулярному весу 26 ООО (вместо предполагаемого 30 500). Авторы объясняют это тем, что комплекс имеет, вероятно, очень компактную структуру (полагая при этом, что ингибитор частично внедряется в молекулу трипсина). Не связанный ингибитор отделяют от смеси комплекса и протеазы на колонке с сефадексом G-50. Авторы определили отдельные компоненты и таким путем нашли константу диссоциации комплекса в различных условиях. Размывания зон, вызываемого сопутствующей диссоциацией, в данном случае не наблюдалось. Аналогичным образом Ауричио [106] доказал образование комплекса фермент — субстрат. Например, трипсин в присутствии казеина элюируется на G-100 гораздо раньше ( мол. вес 100 000), чем в отсутствие субстрата. В то же время казеин не влияет на движение по колонке других белков. [c.178]

Согласно определению. Кип является наблюдаемой константой диссоцпацин комплекса фермент — иммобилизованный лиганд в присутствии растворимого ингибитора [c.52]

Из уравнения (XXI.17) следует, что присутствие конкурентных ингибиторов не влияет на ит=МЕ ]- Этого результата можно было ожидать, так как ясно, что при достаточно высоких концентрациях субстрата взаимодействие фермента с ингибитором окажется подавленным. Конкурентный ингибитор не изменяет кинетических констант. Его действие сводится к уменьшению концентрации активного фермента, поскольку молекулы фермента, находяшиеся в комплексе с ингибитором, не могут взаимодействовать с субстратом. [c.391]

Экспериментально определяемые константы скорости диссоциации комплексов фермент-продукт (или фермент-ингибитор) составляют 1-Ю с , что на три-четыре юрядка выше необходимых для транспептидации. Таким образсм, обычный комплекс фермент-продукт не может быть тем комплексом, ко горы участвует в реакции переноса фрагмента субстрата на акцептор. [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология