Денатурирующее действие ПАВ

Действительно, глобулярные белки денатурируются, т. е. переходят в неупорядоченное клубкообрааное состояние, под действием слабополярных органических растворителей, образующих водородные свяаи хуже, чем вода. Действие этих растворителей определяется контактами с неполярными аминокислотными остатками белка и, тем самым, нарушением гидрофобных взаимодействий. Денатурирующее действие спиртов на белки возрастает с увеличением размеров алифатического радикала. Сильное денатурирующее действие мочевины также объясняется ослаблением гидрофобных взаимодействий. [c.107]

Огромное количество работ по очистке и фракционированию ферментов выполнено с применением сульфата аммония, который чрезвычайно эффективен в качестве осаждающего агента и в первую очередь вследствие своей хорошей растворимости, которая к тому же мало изменяется нри снижении температуры. Соль не только не оказывает денатурирующего действия на ферментные белки, но, наоборот, стабилизирует большинство из них. Поэтому при ее использовании нет надобности вести фракционирование системы при низкой температуре. Даже самые чистые препараты сульфата аммония имеют слабокислую реакцию и во всех случаях при использовании его необходим тщательный контроль pH в растворах. Обычно для того чтобы не увеличивать объемов при высаливаниях, вводят сухую соль или пользуются наиболее концентрированными, насыщенными растворами ее. Характеризуя концентрацию сульфата аммония при осаждении ферментных белков, ее часто выражают десятичной дробью, считая полное насыщение за 1,00. Иногда ту же величину показывают [c.147]

Рис. 3.12. Денатурирующее действие органических растворителей на белки.

Сложным механизмом денатурирующего действия, включающим как непосредственное воздействие на систему водородных связей, так и блокирование полярных группировок, обладают такие органические вещества, как трихлоруксусная кислота и так называемые алкалоидные осадители (пикриновая кислота, таннин и т. п.). [c.185]

Способность к денатурации. Все внешние факторы, которые приводят к ослаблению или нарушению водородных связей или стэкинг-взаимодействий, вызывают денатурацию нуклеиновых кислот. При этом происходит нарушение вторичной и третичной структуры нуклеиновых кислот, но сохраняется первичная структура молекул (рис. 8.13). Факторы, вызывающие денатурацию нуклеиновых кислот, абсолютно те же, что и факторы, приводящие к денатурации белков, но интенсивность денатурирующего действия конкретного фактора в случае нуклеиновых кислот может быть иной. При денатурации ДНК ее двойная спираль полностью или частично разделяется (раскручивается) на составляющие цепи. [c.282]

На рис. 9.19 [105] представлены изменения показателя диспергируемости белков соевого концентрата при pH 6,5 в зависимости от концентрации спирта. Во всех указанных случаях водные растворы спирта снижают этот показатель. Наиболее сильное денатурирующее действие оказывают водно-спиртовые растворы средних концентраций так, при содержании в смеси 60 % метанола и 40 % этанола и изопропанола показатель диспергируемости белков минимален (28—30), тогда как в воде он равен 90 и близок к этой величине при очень высоких и очень низких концентрациях спирта в растворах. [c.397]

Энтропийный фактор. Процесс свертывания не нарушит второе начало термодинамики, если неизбежное при образовании высокоорганизованной структуры уменьшение энтропии белковой цепи будет компенсироваться одновременным увеличением энтропии водной фазы и уменьшением энтальпии системы. Реализация того и другого связана с эффектом так называемых гидрофобных взаимодействий, возникающих при контактах молекул воды с атомными группами неполярных органических молекул. Энтропийная природа этих взаимодействий была обоснована У. Козманом [46], который показал, что на каждую неполярную алифатическую боковую цепь, покидающую водное окружение, энтропия возрастает на -30 ккал/моль град, а свободная энергия понижается на 5-10 ккал/моль. У большинства белков число остатков, склонных к гидрофобным взаимодействиям, превышает 50% всего аминокислотного состава. Поэтому энтропийный эффект, ведущий к экранизации гидрофобных атомных групп от молекул воды, играет существенную ориентационную роль в свертывании белковой цепи. Об этом, в частности, свидетельствует сильное денатурирующее действие, оказываемое на структуру белка слабо полярными органическими растворителями, мочевиной, производными гуанидина и другими соединениями. [c.95]

Изменения в серологической специфичности белков при денатурации также свидетельствуют о нарушении их специфической структуры. Денатурированный яичный альбумин гораздо хуже реагирует со специфическим антителом, и количество образуемого им соединения составляет лишь 1—2% того количества, которое образуется нативным яичным альбумином [154, 159]. Тот факт, что сложное специфическое расположение пептидных цепей меняется при денатурации, сам по себе не вызывает удивления. Почти каждый физический или химический агент способен менять лабильную структуру нативных белков. Денатурирующее действие минеральных кислот и едких щелочей может быть объяснено их влиянием на ионные группы белков. Минеральные кислоты превращают отрицательную группу —СОб в группу [c.150]

Почти все вещества, оказывающие денатурирующее действие на белки, способны образовывать водородные или ионные связи. Примером могут служить мочевина и гидрохлорид гуанидина Часто их денатурирующее действие носит обратимый характер, при диализе первоначальная структура белка восстанавливается Это воздействие связано с дезорганизацией спиральных и складчатых структур вследствие ослабления водородных и гидрофобных внутримолекулярных связей в белках [c.156]

Денатурирующие агенты делятся на химические и физические. К последним относится прежде всего температурное воздействие, в частности замораживание или нагревание, а также давление, ультразвуковое воздействие, облучение и др. Химические агенты — это органические растворители (ацетон, хлороформ, спирт), концентрированные кислоты, щелочи, ионы тяжелых металлов. В лабораторной практике в качестве денатурирующих агентов чаще всего используют мочевину или гуанидинхлорид, легко разрывающие водородные и гидрофобные связи, при помощи которых формируется третичная структура белка. Максимальное денатурирующее действие оба реагента прояв- [c.53]

Ферменты, устойчивые к денатурирующему действию органических растворителей, фракционируют с помощью распределительной хроматографии и противоточного распределения. [c.200]

Если белок солюбилизирован и установлено, что его целостность не нарушена, можно провести фракционирование, подобное описанному в следующих главах. В большинстве случаев это не представляет особой проблемы. Необходимо сохранить активность фермента это зависит от выбора подходящего детергента. Неионные детергенты, такие, как тритон Х-100, очень мягки по своему действию, и большинство белков, как связанных с мембранами, так и свободных, выдерживают концентрации тритона Х-100 до 1—3% (вес/ об.) Напротив, некоторые анионные детергенты (например, додецилсульфат) обладают наряду с солюбилизирующими свойствами очень сильным денатурирующим действием. Они, по-видимому, не найдут широкого применения при выделении ферментов. [c.54]

Электрофорез в производственных условиях до сих пор не привился причиной этого, возможно, является сравнительно невысокая производительность существующих приборов и трудность обработки больших количеств материала. Фракционирование с помощью ионов тяжелых металлов сравнительно опасная операция, вследствие сильного денатурирующего действия подобных солей, и поэтому — трудности, сложности, опасности их применения в заводских условиях. Диализ, хотя и довольно часто используется, как правило, вызывает нарекания, является неудобной и нежелательной операцией в большинстве производств, где он введен. Все же существуют недавно предложенные конструкции автоматических проточных диализационных приборов, специально разработанных для промышленности. Процесс в них [c.156]

Некоторые органические растворители проявляют более сильное денатурирующее действие, чем другие. Давно установлено, что спирты с длинной цепью обладают более высокой денатурирующей способностью по сравнению с короткоцепочечными спиртами. Примеры этого приведены в разд. 3.5. Хотя этанол и используется в стандартных методах фракционирования белков плазмы [30], необходимо отметить, что эти белки (лишь немногие из них относятся к ферментам) составляют группу, характеризующуюся необычной стабильностью и переносящую условия, в которых денатурируют более чувствительные белки. Ацетон обладает менее денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при низкой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. [c.76]

Хотя многие детергенты оказывают на белки сильное денатурирующее действие, некоторые детергенты разрушают митохондриальныё-мембраны с сохранением ферментативной активности. Наиболее пред почтительным среди них является дигитонин (рис. 12-18), вызываЮ1Ц1й№ разрушение наружной мембраны. Остающиеся фрагменты внутренней мембраны сохраняют способность к окислительному фосфорилированию. Последующее фракционирование субмитохондриальных частиц, проводится с помощью химической обработки. Одна из таких процедур дает набор комплексов , катализирующих реакции четырех разных, частей цепи переноса электронов [69]. Реакции, катализируемые комплексами I, II, III и IV, указаны в уравнении (10-10). [c.399]

Глобулярные белки денатурируются (см. 4.8) под действием слабополярных органических растворителей, образующих водородные связи с большим трудом, чем вода. Действие таких растворителей определяется контактами с гидрофобными группами эти контакты нарушают гидрофобные взаимодействия. Денатурирующее действие спиртов на белки возрастает с увеличением размеров алифатического радикала [85, 86]. Сильное денатурирующее действие мочевины также объясняется ее способностью ослаблять гидрофобные взаимодействия. Концепция гидрофобных взаимодействий как важнейшего фактора, определяющего пространственную структуру белка, была подробно обоснована Кауцманном [87]. [c.223]

Нельзя согласиться, чтобы все перечисленные агенты действовали в одинаковом направлении и приводили к тождественным результатам. Можно считать, что все они действуют коагулирующе путем дегидратации и все, кроме спирта, ацетона и таннина, снимают с протеинового золя электрический заряд. Отметим здесь некоторые особенности действия, присущие вышеперечисленным агентам денатурации. По исследованиям Леба действие анионов и катионов обусловливается зарядом протеина в кислую сторону от изоэлектрической точки при положительном заряде протеина происходит присоединение к нему аниона. В щелочную сторону от изоэлектрической точки при отрицательном заряде протеина присоединяется катион. Таким образом рассматривая денатурирующее действие солей тяжелых металлов, надо всегда иметь в виду заряд раствора протеина, в зависимости от которого происходит присоединение к протеину или катиона или аниона. Процесс протекает следующим образом при прибавлении соли тяжелого металла к раствору отрицательно заряженного протеина происходит коагуляция с поглощением катиона. Заряд протеина нейтрализуется или даже возникает противоположный заряд,-—происходит коагуляция. Дальнейшее прибавление соли тяжелого металла ведет к растворению коагулированного протеина и одновременно с этим последний перезаряжается,-—он получает положительный заряд- Следующее прибавление соли поведет к новой коагуляции протеина, при которой будет поглощаться анион соли- Изоэлектрический протеин не соединяется ни с катионами, ни с анионами 4 Следовательно. протеин, приведенный в изо-электрическое состояние, легко может быть отмыт от сопровождающих его примесей. Несмотря на мнение Леба, что присоединение [c.28]

Низкие концентрации ПАВ увеличивали степень спиральности топо- и парамионизина, повышали температуру тепловой денатурации на 10—15°, способствовали повышению устойчивости белков к перевариванию трипсином [152]. Подобные результаты получены в работе Витвицкого [153]. Повышение термостабиль-ности комплексов миоглобина с ПАВ обнаружено в работе [154], причем эффект сильнее выражен для ja, С14 и С , чем для g и g. Увеличение конформационной стабильности трипсина при взаимодействии с фосфолипидами показано в работе [155]. Мосолов и Афанасьев [156], инкубируя трипсин при 37 С в фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем жирную кислоту, наблюдали при одних значениях концентрации денатурирующее действие жирных кислот, а при других — защитное действие. [c.28]

Химические основы денатурирующего действия изучены недостаточно хорошо, хотя этой проблеме посвящено большое число исс,педований. Активные денатурирующие агенты имеют следующую общую структуру [c.116]

Общие положения. Если растворы ДНК, имеющие исходное значение pH, близкое к нейтральному, и содержащие противоионы с умеренной ионной силой, подвергнуть действию некоторых факторов, то молекулы ДНК претерпевают ряд структурных (конформационных) изменений, иногда обратимых, а иногда необратимых. Такими факторами могут служить повышение температуры, добавление гидроксильных или водородных ионов, удаление противоионов или прибавление различных органических реагентов (спиртов, гликолей, амидов, алифатических и гетероциклических аминов, замещенных производных мочевины, фенолов, сульфоксидов и т. д.), а также некоторых анионов ( I3 O2, NS , С10 ). Конформационные изменения ДНК по аналогии со сходными процессами в белковой химии (см. гл. IV) были названы денатурацией, а факторы и агенты, вызывающие этот процесс,— денатурирующими факторами или агентами. Любая из гидродинамических или оптических характеристик макромолекулы (s , [т]], Rq, h, [а] и т. д.) может быть использована для того, чтобы качественно оценить процесс денатурации. Если же необходимо различать только два состояния — нативное и денатурированное — то, пользуясь тем или иным показателем, можно исследовать процесс также и количественно. Агенты, относящиеся к различным классам, часто являются как бы взаимно комплементарными по своему денатурирующему действию. Так, например, при добавлении некоторых денатурирующих агентов температура, при которой наступает денатурация, понижается аналогичным образом влияет и уменьшение ионной силы при повышенной температуре концентрация денатурирующего агента, необходимая для получения желательной степени денатурации, оказывается более [c.148]

Этим можно объяснить известный эффект тепловой денатурации белков. Клотц (1958) считает, что повыщение температуры вызывает нарушение структуры или плавление гидро-тактоидов. Денатурирующее действие на белки некоторых химических веществ, таких, например, как мочевина, можно объяснить их способностью разрушать решетки гидратов и уменьшать стабилизирующее действие, обусловленное взаимодействием неполярных групп. [c.185]

Можно отметить и другие случаи денатурации белков денатурация вамораживанием, при сильном гвстряхивании, при применении высоких давлений (яичный альбумин и казеин под давлением 7000 атмосфер денатурируются), действием ультразвука, лучей Рентгена и т. д. Все указанное говорит о большом разнообразии факторов, вызывающих денатурацию белков. [c.377]

Кстати, многие из такого рода веществ, обладая денатурирующим действием на белки (например, иолифенолы), не могут находиться в растворенном виде в протоплазме клетки. Они, по-видимому, содержатся либо в клеточных стенках, либо, подобно флавонам, в вакуолях. Возможно, что аналогично катехинаминам, содержащимся в вакуолях животной клетки [29], защитные вещества способны изливаться из последних в межклеточное пространство, где их концентрация окажется очень высокой. Можно поэтому допустить, что некроз клеток начинается при смешивании с цитоплазмой биологически активных веществ, которые до того были от нее пространственно отделены в виде вакуоли. [c.19]

Часто приводимым примером осаждения белка органическим растворителем, но на этот раз не смешивающимся с водой, является денатурация гемоглобина хлороформом (ср. [7] и, например [36]). Очистка ферментов эритроцитов осложняется тем, что более 90% общего белка эритроцитов составляет гемоглобин. Встряхивание гемолизата со смесью этанол — хлороформ приводит к полной денатурации гемоглобина. Незначительное количество хлороформа смешивается с водной фазой и оказывает сильное специфическое денатурирующее действие на молекулы гемоглобина. Таким образом, первой стадией выделения эритроцитарного фермента часто служит обработка гемолизата хлороформом, что приводит к удалению основного загрязняющего белка — гемоглобина. [c.90]

Следует обратить внимание на денатурирующее действие поверхностей, пленок и, особенно, пен. На поверхности водного раствора или на поверхности раздела белки стремятся образовать пленку из денатурированных молекул. Если пленки денатурированного белка постоянно снимать с поверхности, то денатурация будет продолжаться с образованием новых пленок [20]. В том случае, когда образуется пена, денатурация принимает весьма существенные размеры и при работе с разбавленными растворами может охватить значительную часть всего белка. Исходя из этого рекомендуется применять концентрированные растворы, чтобы избежать возникновения больших поверхностей белковых растворов и, особенно, пенообразования. Время от времени полезно добавлять антипенообразователи, что, однако, не всегда устраняет поверхностную денатурацию [21]. [c.10]

Биохимический механизм раздражающего действия поверхностноактивных веществ еще недостаточно изучен, но, по-видимому, он неодинаков у разных поверхностноактивных веществ. Часто говорят об обезжиривании, или удалении кожного сала и жиров из кожи, как о причине раздражающего действия. Этот эффект, несомненно, является одной из причин раздражающего действия, так как в результате обезжиривания кожа оказывается менее защищенной [48], чем нормальная кожа, а для восстановления первоначального покрова (накопление липоидов) требуется значительное время. Однако простое обезжиривание не дает полного объяснения всей картины. Действительно, моющее вещество легко адсорбируется на коже и вполне вероятно, что оно оказывает дубящее-действие на эпидермис [49]. Повышенное набухание изолированного эпидермиса при действии различных поверхностноактивных веществ и влияние обезжиривания на водный баланс кожи также могут быть причинами раздражения [50]. Недавно было выдвинуто предположение о денатурирующем действии поверхностноактивных веществ на белки эпидермиса. Доказательством служит то обстоятельство, что после воздействия на кожу этих веществ титрованием обнаруживается большее количество сульфгидриль-ных групп, чем до применения поверхностноактивных веществ 51]. Этот эффект связывают с раздражающим действием. [c.274]

О денатурирующем действии на белки водорастворимых поверхностноактивных сульфатов и сульфонатов говорилось в предыдущей главе. Эти свойства используются также для диспергирования кератина [90] и других белков, а также при получении солей рибонуклеиновой кислоты в этом процессе в качестве денатурирующего агента применяется додецилсульфат 41атрия [91]. [c.499]

Детергенты вызывают набухание и разворачивание белковых структур путем разрушения гидрофобных взаимодействий в молекуле. Их гидрофобные неполярные хвосты проникают во внутренние области глобул, вызывая перестройку структуры Подобный процесс происходит, например, при денатурации пепсина хлоридом триметилдодециламмония Денатурирующее действие органических растворителей, в частности этанола, связано с уменьшением энергии гидрофобных взаимодействий в присутствии менее полярного окружения, чем вода. Гидрофобные боковые радикалы тем менее охотно взаимодействуют друг с другом, чем больше их сродство к молекулам растворителя. Этот эффект приводит [c.156]

Было исследовано действие спиртов на глицеральдегидфос-фатдегидрогеназу дрожжей (неопубликованные данные). Выяснилось, что чем длиннее алифатическая цепь использованного спирта, тем более сильным денатурирующим действием он обладает (рис. 3.17). Концентрация нормального спирта, необходимого для достижения 50%-ной денатурации за время 30-минутной инкубации при 30 X, снижается в 2 раза при удлинении цепи спирта на одну метиленовую группу. Так, процентная концентрация метанола, этанола, пропан-1-ола, бутан-1-ола, пентан-1-ола, необходимая для денатурации, равна соответственно 34, 17, 8,5, 4,2 и 2,2. Ряд не был продолжен далее из-за того, что спирты с более длинной цепью плохо смешиваются с водой. Спирты с разветвленной цепью обладают меньшим денатурирующим действием (и лучше смешиваются с водой), откуда следует, что важной характеристикой денатурирующих свойств спирта является длина его алифатической цепи. Ацетон дает результаты, сходные с результатами, полученными при обработке этанолом. Итак, чтобы избежать денатурации при осаждении органическими растворителями, лучше использовать метанол. [c.90]

Формы фитохрома различаются также и по своим физико-химическим свойствам. Так, форма Рузо более чувствительна к денатурирующему действию мочевины и р-хлормеркурибензоата, а форма Реео быстрее реагирует с альдегидами — формальдегидом и глютаральдегидом. [c.178]

Часть углеводородных групп в молекуле белка, которые могут осуществлять гидрофобные взаимодействия, велика. К ним относятся боковые цепи остатков валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, триптофана, пролина и аланина. У большинства белков эти остатки составляют 35—45% всего аминокислотного состава. В гидрофобных взаимодействиях могут участвовать и углеводородные фрагменты полярных боковых цепей. У. Козман предполагает, что пептидных водородных связей вполне достаточно для стабилизации нативной конформации белка. О большой роли гидрофобных взаимодействий свидетельствует сильный денатурирующий эффект слабополярных растворителей, в частности спиртов. Действие таких растворителей определяется контактами с углеводородными группами, которые нарушают гидрофобные взаимодействия. Денатурирующее действие спиртов на белки возрастает с увеличением размеров алифатического радикала. Сильный денатурирующий эффект мочевины и гуанидиновых солей также объясняется их способностью ослаблять гидрофобные взаимодействия. В то же время известно, что электролиты, как правило, являются слабыми денатурирующими агентами. Это, по-видимому, связано с тем, что солевые связи в белке не вносят существенного вклада в стабилизацию нативной конформации. [c.240]

Как следует из материала, рассмотренного в данном разделе, для того чтобы объяснить механизмы реакций живых организмов на давление в биохимических терминах, необходимо рассмотреть его действие на процессы химического равновесия и скорости реакций. Наиболее яркими примерами действия давления на процессы равновесия может служить вызываемая им диссо-цпация специфических полимерных агрегатов, таких, как микротрубочки или ферменты, построенные из нескольких субъединиц. Важную роль в природных условиях может также играть денатурирующее действие давлення на белки, особенно если другие параметры окружающей среды, такие, как температура, pH или ионная сила, отличаются от оптимальных. Как показало изучение выделенных белков, они могут подвергаться денатурации под давлением значительно ниже одного килобара. Влияние давления на большинство процессов катаболизма или биосинтеза в клетках проявляется прежде всего в том, что под действием этого фактора меняются скорости реакций. В большинстве случаев они замедляются, если давление составляет 300 или более атмосфер. Однако многие другие реакции при повышении давления ускоряются. Из-за различной, чувствительности к давлению огромного множества внутриклеточных реакций в условиях повышенного давления могут происходить существенные нарушения в метаболической регуляторной системе клеток. [c.144]

Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при. температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0 С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру. При температуре выше -ЫО°С становится заметным денатурирующее действие органического растворителя. Денатурация связана с изменением молекулярных гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру белка. Отсутствие денатурации при низкой температуре обусловлено малой вероятностью того, что молекулы органического растворителя проникают во внутренние участки белковой глобулы и дестабилизируют ее. При более высоких температурах небольшие молекулы органических веществ проникают в поверхностные трещины , образующиеся спонтанно в результате естественной подвижности структуры, и связываются за счет гидрофобных взаимодействий с внутриглобулярными остатками, такими, как Leu, Пе, Туг, Phe, Val и т.д. (рис. 3.12). С повышением температуры внутренние гидрофобные взаимодействия в белковой молекуле усиливаются и начинают играть относительно более важную роль в поддержании целостности молекулы. Все это ведет к автокаталитической денатурации. [c.76]