Аминокислота концевая, анализ

С-Концевой анализ можно провести с помощью фермента карбоксипептидазы, который специфически отщепляет С-конце-вой остаток от белка. Эту аминокислоту затем можно идентифицировать. Далее процесс повторяют на оставшемся белке и определяют следующий остаток и т. д. до определения всей последовательности. [c.268]

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Важнейшим этапом в выяснении структуры полипептидов и белков является определение последовательности аминокислот. Не считая применения масс-спектрометрии для решения этой проблемы [14] (см. кн. I гл. 5), основным методом определения последовательности аминокислот является анализ концевых групп он состоит в определении аминных и карбоксильных концевых групп. Для решения этой задачи были разработаны различные химические и ферментативные методы. [c.402]

Динитрофторбензол (86 X = Р) из-за его высокой реакционной способности часто используют для связывания ЫНг-группы концевой аминокислоты при анализе концевых групп белка. Присоединившуюся при этом 2,4-динитрофенильную группу очень трудно отщепить она сохраняется даже при последующем гидролизе белка на составляющие его аминокислоты. [c.191]

РИС. 17.6. Выходы ФТГ-производных аминокислот при анализе N-концевой последовательности б нмоль, 500 и 70 пмоль ангиотензина II (последовательность Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Обработка результатов, как указано в подписи к рис. 17.5. [c.474]

В то время как главные достижения в структурном анализе белка обязаны методу N-концевого отщепления аминокислот по Эдману, а применение автоматических секвенаторов позволило определить протяженные (40—70 остатков) последовательности аминокислот, структурный анализ белков с С-конца до сих пор находится в неудовлетворительном состоянии. Несмотря на бесспорную необходимость решения этой проблемы и большие усилия в этом направлении, ощутимых успехов пока не достигнуто. [c.481]

Надежные методы С-концевого анализа необходимы не только для определения ограниченных последовательностей аминокислот отдельных пептидов. Для широкого применения быстрых методов определения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, все чаще и сильнее ощущается потребность в знании как N-, так и С-концевых последовательностей соответствующих белков. Такие данные необходимы для правильного расположения инициирующего кодона и счи- [c.481]

По данным N-концевого анализа белков можно в какой-то степени судить о гомогенности препарата. При условии что N-концевая аминокислота не ацетилирована или не заблокирована каким-либо иным способом, идентификация N-концевой аминокислоты только одного типа без малейших следов других аминокислот служит хорошим указанием на присутствие в препарате одного-единственного белка. Однако такой вывод должен быть подкреплен данными о том, что в препарате нет примесных белков с блокированными N-концами или с N-концевой аминокислотой, идентичной N-концевой аминокислоте основного компонента. [c.331]

АНАЛИЗ ПОЛИПЕПТИДОВ. Полипептиды, как и прочие амиды, можно гидролизовать водными растворами кислот или щелочей. После полного гидролиза полипептида можно при помощи аминокислотного анализатора установить его качественный и количественный аминокислотный состав, но не точную последовательность аминокислот. Если перед гидролизом обработать полипептид реактивом Сэнгера, то можно будет затем идентифицировать его N-концевую аминокислоту, так как она даст устойчивое окрашенное производное анилина, которое не разрушается при гидролизе. [c.402]

Другой подход к Ы-концевому анализу, развитый Эдманом, включает реакцию с. фенилизотиоцианатом СеНвКСЗ. Продуктом реакции является тиомочевина (II), которая легко гидролизуется до идентифицируемого фенилтиогидантоина (III) в условиях, при которых остальная часть белка не гидролизуется (рис. 12.11). Весь процесс можно повторить на оставшемся белке и получить последовательность аминокислот. Этот процесс можно автоматизировать, причем тиогидантоин идентифицируется газохроматографически (гл. 3), а оставшийся белок после очистки и осаждения вновь возвращается в цикл. [c.269]

Эта последовательность была подтверждена тем, что в окисленном окситоцине только один цистеиновый остаток имел свободную аминогруппу (определено динитрофенилированием). В данной последовательности присутствуют все восемь аминокислот, обнаруживаемых в исходном окситоцине. Таким образом, остатки тирозина и изолейцина соединены друг с другом, образуя циклический пентапептид, — заключение, лодтверждаемое тем обстоятельством, что окисление бромом расщепляет связь тир—изл. Это предположение было также подтверждено концевым анализом по Эдману. Окисленный окситоцин обрабатывали ло Эдману и после удаления К-колцевой аминокислоты гидролизовали и определяли аминокислотный состав. Четырехкратное повторение такого расщепления привело к следующим результатам сначала отщеплялась цистеиновая кислота, затем тирозин, изолейцин [c.681]

После аминокислотного анализа пептидов часто проводят их концево анализ, что в случае ди- итрипептидов дает возможность сразу определить последовательность аминокислот. Для изучения аминокислотной последовательности часто пользуются методом Эдмана — ступен чатым расщепление.м пептида с его аминного конца с помощью фенилизотиоцианата (фиг. 7). Этот метод применим и для негидролизованных вирусных белков, если К-конец у них свободен. В настоящее время в продаже появились автоматические секвенаторы аминокислот, работающие на том же принципе. [c.73]

Цитоплазма, окружающая органеллы нервных клеток, состоит главным образом из воды, белков и неорганических солей (рис. 6.1). К белкам относятся как структурные макромолекулы и высокомолекулярные ферменты, так и более низкомолекулярные вещества типа полипептидов, пептидов и различных аминокислот. Концевые группы многих подобных молекул диссоциируют в водной среде цитоплазмы, и благодаря этому молекулы приобретают электрический заряд, т. е. превращаются в ионы. Содержание этих органических ионов в гигантском аксоне кальмара можно определить путем простого выдавливания цитоплазмы с ее последующим анализом. Подобный анализ показал, что главным органическим ионом нервных клеток является изетионат. Поскольку суммарный заряд этого иона отрицателен, он представляет собой органический анион (А ). Полагают, что в других типах нервных клеток содержатся глутамат, аспартат и органические фосфаты. Все подобные молекулы несут отрицательный суммарный заряд, т. е. являются анионами. [c.129]

Японский химик Акабори (1952) предложил способ определения С-концевого (карбоксильного) остатка аминокислоты. Пептид или бе-ЛО К нагревают 10 ч с безводным гидразином при 105 °С. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, превращаются в соответствующие гидразиды, которые отделяют от С-концевой аминокислоты в виде бензилиденовых производных. Применение метода иллюстрируется на примере анализа трипептида [c.691]

Недавно сообщалось о новых возможностях проведения С-концевого анализа на нерастворимых носителях. Показано, что сложноэфирную связь можно циклизовать в С-концевой алкоксазол при помощи сильных дегидратирующих агентов [83]. Последующая обработка спиртом в кислой среде дает сложный эфир аминокислоты. Существует другая, отличная от этого подхода схема анализа последовательности с использова нием нескольких новых синтетических реагентов [68]. Оба этих подхода, существующие пока только в виде лабораторных разработок они интересны для творчески мыслящего химика тем, что открывают новые пути к большой цели. [c.455]

В этой статье сделан обзор методик целенаправленного выделения С-концевых пептидов, которые затем можно изучать обычными методами N- и С-концевого а 1ализа последовательности и(или) методом определения только одной С-концевой аминокислоты. В то время как методы преимущественного выделения С-концевых пептидов и идентификации С-концевых остатков развиты достаточно хорошо, методы прямого анализа С-концевой последовательности аминокислот практически вообще отсутствуют и в настоящее время не существует методик, обеспечивающих высокие постадийные выходы, определение протяженных последовательностей и сравнимых по эффективности с результатами N-концевого анализа по Эдману. [c.482]

Для восстановления С-концевых аминокислот ди- и трипеп-тидов использовали коммерчески доступный дигидробис(2-мето-ксиэтокси) алюминат натрия [75]. Метод позволяет исключить предварительную этерификацию карбоксильных групп. Аминоспирты идентифицировали бумажной хроматографией. До сих пор неизвестно о применении этого способа восстановления для определения С-концевых аминокислот белков. Сообщалось, что NaBH4 в водном растворе (но не в органическом растворителе) селективно и почти количественно восстанавливает этерифици-рованные С-концевые аминокислоты в соответствующие спирты [32]. При работе с лизоцимом, инсулином быка, конканавалином А были получены ожидаемые производные, при этом не была обнаружено побочных процессов. Этот подход может быть доведен до практической методики С-концевого анализа белков, хотя дальнейшее развитие событий во многом зависит от степени надежности аналитического определения аминоспиртов, получающихся из всех обычных аминокислот. [c.497]

РИС. 18.7. Реакции, происходящие при С-концевом анализе с образованием альдегида. 0-Пивалоилгидроксил-амин количественно реагирует с С-концевой аминокислотой, активированной карбодиимидом, образуя гид-роксамат. Ионизация связи N—Н гидроксамата инициирует перегруппировку Лоссеня с последующим превращением С-концевой аминокислоты в альдегид [61]. [c.498]

В основе этого нового метода С-концевого анализа лежит пре-враиденне С-концевой аминокислоты в имидоэфир, который в кислых условиях легко расщепляется спиртами [68]. Циклические имидоэфиры образуются в ходе внутримолекулярной дегидратации, происходящей при образовании либо оксазолинона (замыканием С- концевой карбоксильной группы на последнюю пептидную связь), либо оксазола (замыкание сложноэфирной С-концевой группы на последнюю пептидную связь). [c.499]

Для успешного проведения реакции путь с образованием оксазола является предпочтительным, так как последний в условиях кислотного алкоголиза количественно расщепляется, давая сложный эфир С-концевой аминокислоты. Расщепление оксазолинонов спиртами в кислых условиях дает свободную С-концевую аминокислоту, но главным побочным продуктом является нерасщепленный сложный эфир пептида (рис. 18.8). Метод можно использовать для идентификации С-концевых остатков в настоящее время предпринимаются попытки разработать на этой основе методику последовательного С-концевого анализа. [c.499]

PPI . 18.8. Реакции, происходящие при С-концевом анализе с алкоголизом оксазолинона или оксазола. Катализируемый кислотой алкоголиз может проходить по двум направлениям, что приводит к образованию нерас-щепляемого сложного эфира пептида и С-концевой аминокислоты. Катализируемый кислотой алкоголиз соответ ствующсго оксазола не имеет этого недостатка и приводит к получению сложного эфира С-концевой аминокислоты [68], [c.500]

Эти данные были использованы для ступенчатого последовательного гидролиза и анализа пептидов с N-конца, что сравнимо с действием аминонептидазы. Для большинства аминокислот выход реакции гидролиза составляет 30—50%. Для иовышения выхода предложен другой подход с использованием твердофазного носителя. В щелочном буфере при 60°С только N-концевой остаток остается связанным с твердофазным носителем, а остальные ненрореагировавшие вещества могут быть отмыты и использованы вновь [230]. [c.358]

Эта реакция не пригодна для отщепления С-концевых остатков пролина, так как они не образуют тиогидантоин, остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, которые образуют циклические ангидриды, а не тиогидантоины (аспарагин и глутамин, наоборот, дают тиогидантоины [301]), а также остатков серина, треонина, цистина, аргинина и лизина [19, 301], которые неустойчивы при циклизации или регенерации аминокислоты из тиогидантоинового производного. Таким образом, этот метод находит весьма ограниченное применение для прямого определения строения пептидов и белков. Для определения С-концевого остатка по разности [107] реакция может оказаться более полезной, но ее все же нельзя использовать для определения аспарагиновой и глутаминовой кислот и пролина. Однако путем микробиологического анализа [107], специфичного для остатков /-аминокислот, эти аминокислоты могут быть определены по потере оптической активности на 50% вследствие рацемизации в том случае, когда они являются С-концевыми. [c.247]

N-Koнцe вoй лизин дает а,е- бис-динитрофенильиое производное лизин, расположенный в середине цепи или на С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди- и трипептидов анализом концевых групп. Если в гидролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [c.690]

Дю Виньо и сотрудники основывались главным образом не на анализе концевых аминокислот, а на идентификации компонентов большого числа низших пептидов. Они исследовали также реакцию окисленного окситоцина с бромной водой, в результате которой обра- [c.695]

При анализе n-n и с-с использованы следущие параметры длАНа концевой области -спирали равна 4-м, Э-структуры - 3-м аминокислотам. [c.117]

Анализ информативных характеристик, отобранных для разделения различных ВС бежов, показывает, что как для а-спиралел. так и для -структур их - и с-конци сформированы аминокислотами со специфическими свойствами, отличными от внутренних участков этих структур. Это свидетельствует в пользу того, что V- и с-концевые участки играет важную самостоятельную роль при юрмировании а-спиралей и э-структур. Поэтому предполагается, 1то определенная конформация фрагмента белка (т.е. локализация 1-спиралей или Э-структур) определяется совместным действием грех элементов -концевого, внутреннего и с-концевого гчастка. [c.121]

Хотя методами рентгеноструктурного анализа е удается непосредственно определить положение атомов водорода, так как они очень слабо рассеивают рентгеновские лучи, тем не менее расположение атомов соседних молекул близи азота концевой аминогруппы свидетельствует о наличии цвиттерионной структуры у аминокислот и пептидов в кристаллах, т. е. о наличии концевой заряженной грулпы ЫНз+ и соответственно СОО . Как было показано, азот концевой аминогруппы имеет тетраэдрическую конфигурацию. [c.538]

Используя технику клонирования ДНК [599] и анализа нуклеотидных последовательностей [600], Наканнши и сотр. foOl] установили нуклеотидную последовательность мРНК-предшественника. Нумерация аминокислотной последовательности положительная справа от N-концевой аминокислоты АКТГ, в левую сторону отсчет идет со знаком минус. Белок-предшественник содержит 8 пар основных аминокислот и одну двойную пару -Lys-Lys-Arg-Arg. В этих местах происходит ферментативное расщепление белка с образованием различных пептидов. /3-Липотропин образует С-концевую область и, вероятно, отщепляется непосредственно от предшественника. Общая схема ферментативного расщепления и вид фрагментации к настоящему времени еще не установлены. В отличие от известных последовательностей /3-липотропинов свиньи и овцы /3-липотропин теленка содержит между 35 и 36 аминокислотными остатками два дополнительных (-Ala-Glu-) этим объясняются различные длины цепей липотропинов (см. схему). Анализ на ЭВМ аминокислотной последовательности отрицательной части предшественника дал интересный результат между позициями —55 и —44 найдена аминокислотная последовательность -Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-, имеющая большое сходство с а- н /3-МСГ. Так как в области аминокислотной последовательности предшественника от —111 до —105 присутствует еще один участок, имеющий структурное сходство с МСГ-пептидами, предполагается существование серии дупликаций гена, аналогично имеющей место в случае иммуноглобулинов. О [c.242]

Анализы Ы-концевой последовательности аминокислот этих субъединиц указывают на высокую гомологичность полипептидам с кислотными свойствами, с одной стороны, и полипептидам с основными свойствами — с другой это наводит на мысль, что белки каждого из этих семейств происходят от одного общего генетического предка (теория Оно — ОКпо). [c.60]

Больше всего известно об аминокислотной последовательности субъединиц с высокой молекулярной массой, изолированных Филдом и др. [79] (молекулярная масса, определенная с помощью ДДС-Ыа-ПААГ, — 144 ООО, ультрацентрифугированием — 69 600 Да). Действительно, установлена последовательность из 16 аминокислот N-концевой половины цепи она была определена при секвенировании изолированного белка [79]. Кроме того, благодаря клонированию ДНК, кодирующей эту субъединицу, и определению ее нуклеотидной последовательности стало возможным установить последовательность из 101 аминокислоты у СООН-концевой половины цепи [81] (см. табл. 6Б.15). Анализ последовательности N-концевой половины цепи подтверждает предыдущие результаты она не соответствует ни одной из тех последовательностей, которые были предварительно идентифицированы для а-, Р-, 7- и й)-глиадинов или агрегированных глиадинов. Эта аминокислотная последовательность N-концевой половины цепи по составу очень отличается от аминокислотного состава полного белка меньше неполярных аминокислот, глицина, а также глутаминовой кислоты и глутамина. Отмечается также отсутствие серина, тогда как все основные аминокислоты присутствуют. Поэтому такая последовательность не является представительной для первичной структуры всей полипептидной цепи, которая должна содержать зоны, более богатые глицином и бедные глутамином. Наконец, примечательно наличие 2 цистеинов из 5 или 6, которые входят в состав целой молекулы, так как оно с большой вероятностью предопределяет конформацию молекулы, как и возможности образования внутрицепочных дисульфидных мостиков. Опыты с разрывом полипептидной цепи на уровне цистеинов подтвердили, что большинство из них должно располагаться у концов цепи [79]. В самом деле, обнаруживается третий цистеин в положении 13 у С-конца [81]. Эта С-кон- [c.210]

Другой метод определения Ы-концевых групп (разработанный в 1950 г. П. Эдманом в Университете Лунда, Швеция) основан на реакции между аминогруппой и фенилизотиоцианатом, приводящей к образованию замещенной мочевины (ср. разд. 29.14). Гидролиз соляной кислотой в мягких условиях селективно удаляет Ы-концевой остаток в виде фенилтиогидантоина, который затем идентифицируют. Большое преимущество этого метода состоит в том, что он не затрагивает остальной части пептида поэтому анализ можно вновь повторить и идентифицировать при этом следующую концевую группу в укороченном пептиде. В идеале этот метод можно использовать многократно до полного определения всей последовательности звеньев, аминокислота за аминокисло той однако на практике это оказывается неосуществимым. [c.1049]

В 1962 г. М. Перутц и Дж. Кендрью (Кембриджский университет) были удостоены Нобелевской премии по химии за работу по установлению структуры гемоглобина и родственного ему миоглобина — молекулы, способной хранить кислород. На основании данных рентгеноструктурного анализа и зная аминокислотную последовательность (стр. 1050), они определили трехмерную структуру этих очень сложных молекул совершенно точно для миоглобина и почти точно для гемоглобина. Они установили, например, что молекула закручена в а-спираль на протяжении шестнадцати звеньев, начиная с концевого Ы-звена, после чего цепь поворачивает под прямым углом. Исследователи смогли даже сказать, почему она поворачивает в углу находится звено аспарагиновой кислоты, карбоксильная группа которой нарушает водород >ые связи, необходимые для продолжения спирали, что и приводит к изменению формы цепи. Четыре сложенные цепи гемоглобина образуют вместе сфероидную молекулу с размерами 64 А х 55 А х 50 А. Четыре плоские группы гема, каждая из которых содержит атом железа, способный связывать молекулу кислорода, укладываются в отдельных карманах в этой сфере. Когда переносится кислород, то цепи слегка смещаются, в результате чего эти карманы становятся немного меньше по размеру Перутц описал гемоглобин как дышащую молекулу . Эти карманы оторочены углеводородными остатками аминокислот подобное неполярное окружение предотвращает перенос электронов между кислоредом-и-ионом железа и допускает комплексеобразование, необходимое для переноса кислорода. [c.1061]

Короткие последовательности с Л/-конца белков часто идентифицируют, используя ферментативную деградацию. Промышленность производит несколько аминопептидаз, отличающихся специфичностью. Лейцинаминопептидаза из почек свиньи, как следует из ее названия, гидролизует преимущественно лейцин и сходные аминокислоты с гидрофобными боковыми группами. Несмотря на то, что скорости расщепления, Л/-концевых аминокислот лежат в широких пределах, гидролиз желательно продолжать до конца, за исключением аминокислоты, предшествующей пролину. Вследствие столь широкого изменения скоростей расщепления следует соблюдать осторожность при интерпретации результатов анализа деградации, катализируемой этим ферментом. Чрезвычайно важно отбирать пробы для анализа в течение деградации. Например, при анализе белка с Л/-концевой последовательностью А1а-Ьеи-Ьеи. .. на ранних стадиях деградации выход аланина превышает выход лизина, однако при большом времени гидролиза соотношение меняется на обратное [24]. Другой фермент, выделенный из почек свиньи, ами-нопептидаза М, гораздо менее специфичен и, по-видимому, более пригоден для расщепления белков. [c.271]

Обработка продукта реакции кислотой приводит к циклизации и освобождению фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты, природу которого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокислоту полипептид подвергают дальнейшему анализу. [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология