Ренатурация белков

Фиг. 42. Схема, иллюстрирующая денатурацию и ренатурацию белка. Полипептидная цепь нативного белка, свернутая и скрепленная внутримолекулярными дисульфид-ными мостиками, развертывается в результате восстановительного разрушения этих мостиков в 8 М мочевине с добавлением -меркаптоэтанола. После удаления мочевины и меркаптоэтанола происходит

Денатурация и ренатурация белков [c.139]

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением [c.47]

Наличие такого соответствия следует непосредственно из опытов по ренатурации белков (Анфинсен). В ряде случаев удалось наблюдать восстановление нативной структуры и функциональ- [c.108]

Биохнмич. эффекты высоких Д. При Д в неск. сотен МПа происходит денатурация белков, при этом меняются их антигенные св-ва, снижается активность токсинов. Особенно чувствительны к Д. процессы образования связей белок-лиганд и белок-белок. Так, для белков характерно значив уменьшение скорости ассоциации с повышением Д. (AV положительны и могут исчисляться сотнями см /моль). Денатурирующее влияние Д. зависит от природы белка, т-ры и pH среды. Напр., овальбумин необратимо коагулирует при 800 МПа, тогда как р-ры альбумина не претерпевают изменений даже при 1,9 ГПа. Д. может препятствовать тепловой денатурации белка и даже вызывать ренатурацию белка, де- [c.621]

Дальнейшее развитие теории требует уточнения количественных оценок и рассмотрения кинетики самоорганизации. Экспериментальный подход к проблеме состоит в изучении кинетики ренатурации белков при постоянных внешних условиях. Сведения о термодинамически устойчивых стадиях ренатурации при изменяющихся внешних условиях можно получить с помощью ядерного магнитного резонанса (см. 5.10). [c.254]

Важной является проблема обратимости денатурации, т. е. возможность вновь получить белок с исходной пространственной структурой и биологическими свойствами. Такой процесс называется ренатурацией. Впервые полную ренатурацию белка удалось осуществить на примере рибонуклеазы (К. Аифинсен, 1961). [c.105]

Конформации с величинами (У сщ = О и 6,2 ккал/моль, а также некоторые другие представляют интерес в связи с результатами, полученными Крейтоном [7] при исследовании процесса укладки денатурированной белковой цепи и локализации у метастабильных промежуточных продуктов дисульфидных связей. На разных стадиях окисления восстановленного белка Крейтон обнаружил продукты с S-S-мостиками между ys и ys , ys и ys , ys и ys . В конформации с энергией 6,2 ккал/моль ос-татю ys и ys оказываются сближенными. Соответствующая конформация у фрагмента Arg - ys была глобальной (см. табл. IV.8), а структура, близкая к экспериментальной, проигрывала ей 2,8 ккал/моль. У свободного фрагмента Arg -Arg последняя оказалась уже на 3,1 ккал/моль более предпочтительной, а у фрагмента Arg -Tyr - на 4,1 ккал/моль. Поэтому можно полагать, что метастабильное конформационное состояние молекулы БПТИ с дисульфидным мостиком ys - ys характерно для ранней стадии ренатурации белка. Глобальная и близкие ей низкоэнергетические структуры могут при удлинении цепи привести к сближенности остатков ys и ys , ys и ys . В связи с этим обстоятельством низкоэнергетические структуры разных типов, энергии которых отмечены в табл. IV.9 звездочками, оставлены для дальнейшего анализа. [c.444]

При рассмотрении механизма ренатурации БПТИ состояние белковой цепи на пути от статистического клубка к нативной конформации оценивалось, следуя Крейтону [7], по дисульфидным связям (см. рис. IV. 17), Считалось, что чем больше их число и чем ближе они подходят к системе дисульфидных связей конечной структуры, тем дальше продвинулся процесс сборки. При экспериментальном изучении ренатурации белков альтернативного, столь же надежного способа идентификации структуры промежуточных метастабильных состояний практически нет. Действительно, дисульфидная связь является удобным критерием. Она указывает на сближенность определенных участков белковой цепи на этапах свертывания, надежно характеризует как исходное, полностью денатурированное состояние, так и конечную, нативную трехмерную структуру. И тем не менее способ идентификации промежуточных состояний только по дисульфидным связям не может пролить свет на многие важные детали механизма ренатурации и ответить на поставленные вопросы. Возникновение этих связей является следствием, а не причиной самоорганизации белковой цепи. [c.480]

Эксперименты по ренатурации белков показали, что в аминокислотной последовательности заключена полная структурная информация 177]. Поэтому между всеми уровнями имеется взаимосвязь, так что элементы более низких уровней определяют элементы более высоких уровней. [c.82]

В процессе ренатурации белка одним из определяющих параметров является его концентрация, поскольку необходимо, чтобы внутримолекулярные взаимодействия преобладали над межмолекулярными. Это особенно существенно в том случае, когда нативный активный белок содержит внутримолекулярные дисульфидные связи. Когда дисульфидные связи в нерастворимых белковых включениях оказываются разрушенными при использовании тиоловых реагентов или образовании производных — 5-сульфонатов, восстановление правильных дисульфидных связей достигается применением смесей восстановленных и окисленных тиоловых реагентов, таких, как глутатион. Должны быть выбраны оптимальные концентрации и соотношение вое- [c.120]

Проблема связи между первичной структурой полипептидной цепи и пространственным строением глобулы — одна из важнейших в физике белка. Биологически функциональна нативная пространственная структура макромолекулы, а генетически кодируется первичная структура. Если бы эта связь была неоднозначной, то пришлось бы пересмотреть основные положения молекулярной биологии. Приведенные выше факты, относящиеся к ренатурации белков, дают экспериментальное обоснование наличию такой связи, следующему из общетеоретических соображений (ср. 9.7). [c.249]

Фиг. 53. Ренатурация белка ВТМ и образование палочек. Изображены самопроизвольное восстановление специфической формы белковой молекулы из хаотического клубка (т. е. из денатурированного состояния) и агрегация таких молекул в тримеры с последующим обр [c.218]

Эти опыты показывают, что программа самосборки белка закодирована в его первичной структуре. По всей вероятности, важное значение при ренатурации белка имеет образование ядер , т. е. небольших участков упорядоченной вторичной структуры (стадия нуклеации). За этим сравнительно медленным процессом следует быстрое сворачивание цепи в нативную структуру. На первых этапах ренатурации белков, в поддержании нативной конформации которых участвуют дисульфидные мостики, образуются промежуточные производные с правильными и неправильными дисульфидными связями. В ряде случаев удавалось останавливать процесс ренатурации на определенных стадиях и выделять такие частично свернутые формы. Поскольку в целом сборка белка является достаточно быстрым процессом, можно сделать вывод о том, что природа не перебирает все возможные комбинации в очередности замыкания дисульфидных мостиков (при 4 S—S-связях их 105, а при 5 — уже 945), а сворачивание полипептидной цепи идет по ограниченному числу направлений и приводит к конформации, характеризующейся минимальной свободной энергией. [c.105]

Денатурация н ренатурация белков. До настоящего времени в белкоаой химии сохранился термин неупорядоченная структура или неупорядоченный (статистический) клубок . Так называют любые пространственные формы полипептидной цепи, которые не охватываются каноническими конформациями. Принято говорить о переходах а-спираль — клубок, р-структура -> клубок и т. п. Такого рода рассмотрение постепенно утрачивает свое значение, ибо неупорядоченная структура, если она входит в состав биологически активного белка, должна описываться в точных терминах (углы Ч, 11. X координаты атомов). Однако не канонические формы труднее поддаются характеристике с помощью физико-химических методов, что, по-видимому, и обусловило появление не очень точного термина неупорядоченная структура . [c.103]

Эксперименты по ренатурации белков показывают, что ненаправленная реконструкция дисульфидных мостиков восстановленных белков приводит в большинстве случаев к образованию структур, полностью идентичных структурам тех же белков в той форме, в которой их выделяют из природных источников. Поскольку ненаправленное восстановление третичной структуры должно, по-видимому, давать термодинамически наиболее стабильную конформацию, мы вправе, очевидно, сделать из этих опытов вывод, что нативная конформация есть конформация термодинамически наиболее стабильная. [c.114]

Мы также приводим методику эффективной постановки вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител (табл. 6.8). Исходя из нашего опыта, моноклональные антитела четко делятся на две группы антитела, работающие в таком анализе, и не работающие антитела. Работающие в блот-анали-зе антитела воспроизводимо эффективны, но никакими изменениями условий ренатурации белков нам ни разу не удалось сделать так, чтобы антитела, не работающие в блот-анализе, вдруг заработали. Интересно, что такие неработающие антитела оказываются достаточно эффективными при скрининге колоний (табл. 6.1), позволяя картировать их некоторые эпитопы. [c.197]

Глава 13 РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ [c.383]

Решающим доказательством справедливости предложенного подхода к решению задачи о структурной организации белка явились результаты априорного расчета трехмерной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора и количественное представление свертывания белковой цепи как самопроизвольного, быстрого и безошибочного процесса. Рассчитанная при использовании аминокислотной последовательности и стандартной валентной схемы конформация белка совпала с кристаллической структурой молекулы БПТИ. Точность расчета значений всех двугранных углов вращения ф, у, (О и %, расстояний между атомами С всех остатков и длин реализуемых водородных связей оказалась близкой точности рентгеноструктурного анализа белков высокого разрешения. На основе данных о конформационных возможностях аминокислотной последовательности БПТИ получили свое объяснение все детали ренатурации белка, механизм которой был изучен экспериментально. Тем самым, во-первых, была подтверждена неравновесная термодинамическая модель сборки белка. Во-вторых, была апробирована физическая теория структурной организации белка, вскрывающая природу бифуркационных флуктуаций и утверждающая представление о нативной конформации белковой молекулы как о глобальной по внутренней энергии структуре, плотнейшим образом упакованной и согласованной в отношении всех своих внутриостаточных и межостаточных невалентных взаимодействий. Именно гармония между ближними, средними и дальними взаимодействиями ответственна за резкую энергетическую дифференциацию и выделение из множества возможных структурных вариантов стабильной и уникальной для данной аминокислотной последовательности конформации белка. В-третьих, продемонстрированы реальность фрагментарного метода теоретического конформационного анализа пептидов и белков и удовлетворительное количественное описание с его помощью их пространственных структур применительно к условиям полярной среды. Под- [c.589]

Естественно, что полной обратимости денатурации следует ожидать для белков, не содержащих групп, вступающих в денатурированном состоянии в необратимые реакции (например, окисление 5 — Н-групп) [101]). Так, доказана обратимость денатурации рибонуклеазы [135], такаамилазы А [136] и а-амилазы [136]. В работах Анфинсена и др. [137—140] показано, что можно добиться ренатурации белков и с разорванными дисульфидными связями. Из этих данных следует, что денатурацию действительно можно трактовать как термодинамический конформационный переход и что нативная структура белка отвечает если не глобальному, то относительному минимуму свободной энергии. [c.249]

Ренатурация белков, содержащих дисульфидные мостики (после восстановлсиия дисульфидных связей и развертывания глобулы) [c.114]

При нейтральном или близких к нему значениях pH большинство вирусов диссоциирует лишь при добавлении сильных денатурирующих агентов. Добавлением мочевины или формамида до концентрации 8—10 М при pH 7—8 можно вызвать диссоциацию многих вирусов, а для отделения высвободившегося белка от вирусной РНК часто прибегают к методу осаждения белка сульфатом аммония. Белок ВТМ, выделенный таким способом при 20%-ном насыщении сульфата аммония, нерастворим даже в присутствии дитиотреитола, предотвращающего самоокисление. Денатурированный белок ВТМ успешно ренатурирует при растворении в 8 М растворе мочевины и последующем диализе против 0,02 М фосфата при pH 6 [7]. Под действием мочевины ренатурация белка может произойти даже после его обработки галоидоводородными солями гуанидина (4 М), которые относятся к более сильным денатурирующим агентам. У таких детергентов, как додецилсульфат натрия, наблюдается тенденция слишком прочно связываться с белками, что и является основным недостатком при их использовании для выделения белков. [c.50]

Если к нативному белку ВТМ добавить РНК ВТМ до конечной концентрации 1 мг/мл и 0,05 мг/мл соответственно, то в буферном растворе с pH 7—7,5 (лучп1в всего использовать пирофосфатный буфер конечная концентрация 0,1 М) при 25—37° через несколько часов образуются палочки длиной преимущественно 300 нм. Инфекционность таких растворов оказывается примерно в два раза ниже, чем это можно было бы ожидать, если бы трансформировалась в вирусные частицы (оделась белковой оболочкой) вся РНК [138—140], т. е. выход реконструкции составляет 50%. Более высокий выход получить трудно отчасти потому, что 20—40% свободной РНК ВТМ обычно находится в виде фрагментированных молекул. Выход (в расчете на количество добавленной РНК) можно увеличить, если добавить избыток белка (например, 1 мг/мл белка на 0,01 мг/мл РНК). Когда те же смеси выдерживают при 0°, никаких палочек не образуется, а инфекционность остается на низком уровне ( 0,05%), присущем самой РНК, или падает еще ниже. Ренатурация белка ВТМ и его агрегация в типичную спиральную палочку схематически показаны на фиг. 53 138, 139]. [c.217]

Сложность этой проблемы иллюстрируется данными о том, как происходит сворачивание белка в живой клетке. Именно здесь видно, что реализации рассмотренных выше физических закономерностей сворачивания происходит способом, отличным от такового in vitro. В самом деле, в клетке микроокружение полипептидной цепи включает рибосомальные структуры, ферменты, белки шапероны и другие факторы, отсутствующие в растворе. Векторный характер синтеза пептида от N- к С-концу приводит к тому, что сворачивание начинается уже на рибосоме в процессе трансляции немедленно вслед за появлением последовательности аминокислот. Связь С-конца с рибосомой обеспечивает возможность формирования а-спиралей и влияет на скорость образования третичной структуры (Spirin А., 1986). Формирование нативной структуры белка в клетке происходит намного быстрее, чем ренатурация белков в растворе. Все это приводит к выводу о том, что сворачивание последовательности в живой клетке происходит не из состояния стохастического клубка, как при ренатурации в растворе, а осуществляется еще на рибосоме без выхода цепочки в окружающую рибосому среду, т. е. котрансляционным способом. [c.253]

Прочно укоренилось представление о том, что цистеинсодержащие белки являются наиболее удобными объектами исследования денатурации. Действительно, для белков с дисульфидными связями разработан комплексный экспериментальный подход к изучению структурной самоорганизации полипептидной цепи. Он включает методы, позволяющие прекращать практически мгновенно процесс ренатурации белка в любой момент времени и фиксировать образовавшиеся к этому моменту дисульфидные связи и тиоловые группы, выделять в чистом виде промежуточные продукты на любой стадии ренатурации и определять в каждом продукте число S-S-связей и места их локализации в цепи. [c.380]

Полипептиды в растворе сохраняют способность к агрегации, поскольку у них имеются внутримолекулярные ковалентные связи, такие, как дисульфидные мостики. Если необходимо полностью разрушить эти связи, к солюбилизирующему агенту добавляют восстановители тиоловых групп — дитиотрейтол (ДТТ) или 2-меркаптоэтанол (2-МЭ). Другой метод, который может быть использован для разрушения внутримолекулярных дисульфидных связей, — получение производных в форме 5-сульфона-тов. Такой подход был использован в случае А- и В-цепей инсулина [11] (табл. 4.15). Есть ли необходимость в полном разрушении таких связей, можно определить, только исследуя процесс ренатурации белка и восстановления его активности. Не всегда необходимо полностью разрушать дисульфидные связи между отдельными цепями молекулы при ренатурации белковой молекулы можно создать условия, обеспечивающие тиол-дисульфидный обмен с образованием мономерных молекул, соединенных дисульфидными связями (разд. 4.3.5). [c.118]

Существуют методики, при которых ренатурация белка протекает в две стадии считают, что на первой стадии белки принимают конформацию, близкую к нативной, а на второй — процесс ренатурации завершается полностью. Примером этого служит процесс перевода прохимозина из 8 М мочевины в буферный раствор при pH 10,7 после инкубации значение pH доводится до 8,0 [18]. Другой подход — перевод растворенных белков в раствор с низкой концентрацией мочевины, где происходит частичная ренатурация [30]. [c.120]

Однако исследование кинетики свертывания рибонуклеазы А, проведенное Болдвиным при различной вязкости растворителя, не обнаружило заметного влияния изменения скорости диффузии на скорость ренатурации белка [213]. Если не выходить за рамки эмбрионуклеационной модели, то эти данные можно объяснить свертыванием полипептидной цепи рибонуклеазы по механизму, в котором определяющими скорость процесса являются конформационные изменения эмбрионов перед их коалесценцией. [c.301]

Кинетические аспекты. Трудно представить, что белки могут принимать нативную физиологически активную конформацию, сворачиваясь случайным образом по принципу "проб и ошибок". Даже в условиях in vitro самопроизвольная сборка трехмерной структуры белка, не содержащего дисульфидных мостиков, происходит настолько быстро, что дает основание допустить во много раз большую скорость этого же процесса в условиях in vivo по сравнению со скоростью рибосомального матричного синтеза аминокислотной последовательности. Создание за считанные секунды из развернутой полипептидной цепи трехмерной структуры макромолекулы возможно только при высокой степени кооперативности процесса. Естественно было ожидать, что кинетика этого процесса будет соответствовать такому механизму ренатурации белка, при котором происходящие на каждом участке последовательности события увеличивают вероятность и, следовательно, скорость последующей укладки всех отдельных участков цепи в направлении правильной нативной конформации. Данному условию удовлетворяет самый простой механизм самоорганизации белков, включающий единственный переход между двумя состояниями (N D). Согласно теории этого процесса, которая только что была рассмотрена, никакие другие состояния белковой цепи, кроме N и D, не присутствуют в экспериментально обнаруживаемых количествах в течение всего времени прямой (N -> D) и обратной (N D) реакций. Если развертывание и свертывание белковой цепи действительно следуют двухстадийному процессу, то изучение кинетики и выяснение деталей конкретного механизма денатурации и ренатурации сталкивается с особенно серьезными трудностями. Они вызваны большими скоростями реакции и малыми концентрациями промежуточных состояний, а это требует быстрореагирующей и высокочувствительной экспериментальной техники. Наиболее часто используются спектральные методы (ЯМР, КД, УФ), ферментативный гидролиз, иммунологические методы. Для быстрой остановки процесса применяются методы стоп-флоу. [c.352]

В 1972 г. Д. Сачс и соавт. [114] разработали иммунологический метод, который был использован для изучения процесса ренатурации белков, не содержащих дисульфидных связей. Метод основан на предположении о двухфазном механизме свертывания и идентификации конформационных состояний фрагментов нативной трехмерной структуры белка с помощью специально подобранных антител. Далее выявляются зависимости между константой равновесия предельных состояний (D и N) и константами связывания антител с белковыми фрагментами. Д. Сачс и соавт. [115] применили метод для определения константы равновесия N D стафилококковой нуклеазы, а Дж. Харрел и соавт. [116] и Б. Фурье и соавт. [117] — для изучения конформаций промежуточных состояний миоглобина. О характере получаемой при исследовании иммунохимического метода информации можно судить по результатам рассмотренной в разд. 9.4. работы Л. Чавеца и Г. Шераги [86], применивших его в исследовании ренатурации рибонуклеазы А. [c.385]

Обратимся теперь к методу Фершта, точнее подходу, включающему целый комплекс методов. Своим появлением он обязан становлению в начале 1980-х годов генетической инженерии, сделавшей доступными любые полипептидные последовательности стандартных аминокислот. В результате открылась уникальная возможность получения сколь угодно представительного набора искусственных белковых аналогов, отличающихся от природного объекта числом и местом аминокислотных замен [125, 126]. На основе сайт-направ-ленного мутагенеза был разработан метод экспериментальной оценки энергии невалентных взаимодействий, впервые опробованный при изучении функционирования тирозил-тРНК-синтетазы [127—129]. Выявив в этих работах возможность получать количественные данные о структуре и энергетике боковых цепей при изменении аминокислотной последовательности, Фершт и соавт. [130-132] предприняли попытку использовать метод в исследовании обратимой денатурации белков, причем сразу в двух аспектах. Во-первых, в создании принципиально нового метода изучения механизма свертывания белковой цепи на уровне отдельных аминокислотных остатков. Сайт-специфические мутантные белки служат здесь инструментами — зондами, позволяющими получать тонкую структурную информацию о процессе самоорганизации белка, недоступную другими экспериментальными методами. Во-вторых, в разработке новой стратегии исследования ренатурации белков с помощью обычно используемых методов ЯМР- и КД-спектроскопии, остановленной струи, изотопного обмена и т.д. Существенное изменение ситуации обусловлено появлением у каждого метода вместо одного объекта исследования многочисленной группы его целенаправленно модифицированных аналогов. Расширение материальной базы открыло перспективу для повышения интерпретационных возможностей экспериментальных методов, особенно при их комплексном использовании. Реализация возросших возможностей потребовала совершенствования методологических подходов. [c.386]

Итак, первая попытка построить на уровне отдельных аминокислотных остатков количественную картину всего пути свертывания белковой цепи не достигла желаемой цели. Декларированный Ферштом и сотрудниками порядок ренатурации барназы не является очевидным следствием беспристрастного анализа, а представляется одним из множества правдоподобных вариантов феноменологического описания процесса. Для такого заключения имеется ряд причин как субъективного, так и объективного характера. Прежде всего, невозможно было дать однозначную трактовку всем этапам свертывания белка из-за ограниченного при решении столь сложной задачи набора структурных параметров ф. В самом деле, для описания поведения цепи из ПО аминокислотных остатков авторы ничего не знали о более чем 80% остатков и располагали количественной информацией только о четырех остатках в состоянии I и семи остатках, куда вошли предшествующие четыре, в состоянии TS. Из 33 изученных мутантов лишь у четырех значения параметра ф заметно отличаются от фхх. Поэтому трудно говорить определенно о динамике ренатурации белка на участке I TS. Метод не фиксирует происходящие здесь события. Очевидно, при таком соотношении числа известных и неизвестных может быть написано много сюжетов укладки барназы. [c.405]

Классические исследования, свидетельствующие о возможности восстановления физиологически активной конформации белковой молекулы, были проведены еще в первые десятилетия XX в. Л. Миха-элисом, М. Ансоном, А. Мирским, Г. Нейратом, Ф. Гауровицем, Л. Полингом и др. [154]. В 1945 г. Ансон постулировал обратимость реакции денатурации—ренатурации белков [155]. [c.408]