Аминокислота концевая восстановление

Известные в настоящее время методы определения С-концевых остатков менее удовлетворительны. Для этого определения может быть использован фермент карбоксипептидаза (представляющий собой, по существу, группу сходных ферментов). Карбоксипептидаза действует только на свободные а-карбоксильные группы, подобно тому как лейцинаминопептидаза действует на свободные а-аминогруппы. Другой метод, разработанный Акабори, основан на полном гидразинолизе полипептида. Гидразин реагирует с каждой пептидной связью, превращая все аминокислоты (за исключением С-кон-цевой, карбоксил которой не участвует в образовании пептидной связи) в ацилгидразипы. С-концевую аминокислоту отделяют и идентифицируют хроматографически. Значительно реже используется метод, основанный на восстановлении С-концевой карбоксильной группы до спиртовой с помощью подходящих доноров гидрид-иона. При последующем полном гидролизе полипептида образуется аминоспирт, соответствующий С-концевой аминокислоте. Этот аминоспирт может быть выделен и идентифицирован. [c.88]

С-концевые аминокислоты пептидов или белков можно определить при помощи химических или ферментативных методов. Химические методы включают гидразинолиз, селективное введение трития, избирательное восстановление, образование альдегидов, алкоголиз оксазолов в кислой среде, тиоцианатное или цианамидное расщепление. При ферментативном определении используют карбоксипептидазы. Этот подход в последние годы [c.487]

Другой метод определения С-концевой аминокислоты основан на восстановлении концевой карбоксильной группы литийалюминийгидридом. Белок перед восстановлением полезно этерифицировать диазометаном. Полный гидролиз дает легко выделяемый и идентифицируемый амино-спирт, соответствующий С-концевому остатку аминокислоты. [c.369]

П 112. Определение С-концевой аминокислоты белков иосле восстановления [c.784]

С-Концевые (или соседние с ними) аминокислоты пептидов могут быть отщеплены в виде гидантоиновых кислот. В них после превращения в хлорангидриды, восстановления боргидридом пат-жя и гидролиза оба компонента могут быть легко определены 2954] [c.455]

Успешное определение длинных С-концевых последовательностей до сих пор остается недостижимым. Появление усовершенствованных методик тиоцианатного отщепления, новых подходов (цианамидный метод, селективное восстановление, определение аминокислот в виде альдегидов, алкоголиз оксазолов) позволяет надеяться на появление в будущем универсального метода определения протяженных последовательностей. Однако на этом пути предстоит преодолеть много проблем. Люди, взявшиеся в наши дни решать эту задачу, заслуживают восхищения за свое мастерство и мужество, ибо многие до них пытались создать реально работающий метод и потерпели неудачу [67а]. [c.511]

Из величин [ц] восстановленной и невосстановленной форм можно получить информацию о расстоянии между остатками цистеина, связанными 5—З-связью, Было вычислено, что отношение 1г ] для отдельного линейного полимера в конфигурации статистического клубка к величине [ц] для кольцевой структуры составляет 1,6. Следовательно, в примере тубулина, поскольку величина 44,0 соответствует прямой цепи (т. е. нет 5—5-связей), то для кольцевой структуры (т. е. если 3—5-мостик соединяет концевые аминокислоты) это значение должно быть [т]]= = 44,0/1,6-= 27,5. Поскольку наблюдаемая величина составляет [c.374]

Изучение мутаций, сдвигающих рамку считывания, показало, что кодоны состоят из трех нуклеотидов. Использовались мутагены (в частности, профлавин), которые индуцировали делеции или вставки одного или двух оснований. Образующиеся мутанты синтезировали неактивные или укороченные полипептиды, поскольку сдвиг рамки приводит к появлению кодонов, детерминирующих неправильные аминокислоты, или стоп-ко-дона. Рекомбинация между двумя мутантами, один из которых содержит делецию, а другой в этой же или близкой позиции - вставку (например, -1 х -1-1 или -2 X +2), может привести к восстановлению функционального гена, если несколько концевых, находя- [c.131]

Основные научные работы посвящены изучению белков и биохимических окислительных процессов. Разработал оригинальные способы синтеза ряда аминокислот, а также методы асимметрического органического синтеза. Открыл носящие его имя реакции восстановления а-аминокнслот или их эфиров в аминоальдегиды действием амальгамы натрия в спирте в присутствии минеральной кислоты (1931) и реакцию получения ами-носпиртов альдольной конденсацией аминокислот с ароматическими альдегидами и последующим декарбоксилированием (1943). Предложил (1952) способ определения С-концевого остатка аминокислоты нагреванием пептида или белка с гидразином при температуре 105°С (при этом все аминокислоты, кроме С-концевой, превращаются в гидразиды). [c.13]

Следующей задачей при определении строения пептидов является установление характера связи и последовательности аминокислотных остатков в молекуле пептида или белка. Эта задача, трудно выполнимая в настоящее время для белков с большим молекулярным весом, облегчается тем, что в природе встречается значительное число относительно низкомолекулярных соединений, представляющих собою пептиды. Виланд предлагает различать три группы природных пептидов олигопептиды, состоящие из 2—10 аминокис/ют, полипептиды, состоящие из 10—100 аминокислот, и макропептиды, к которым относятся собственно белки. Изучение природных пептидов представляет собой важный этап в подходе к изучению строения белка. Исследование обычно начинают с определения числа цепей, входящих в состав объекта изучения. Для этого пользуются одним из ранее приведенных методов, например диннтрофенилированием, действием азотистой кислогы или аминопептидазы для определения Н-концевой аминокислоты и восстановлением, гидразинолизом или действием карбоксипептидазы для определения С-концевого остатка (см. стр. 510 и далее). [c.514]

Химические методы основаны главным образом на модификации С-концевых аминокислот. После полного гидролизаполипептидной цепи эти производные отделяют от немодифицированных остатков и идентифицируют. К химической группе методов относятся гидразинолиз, отщепление С-концевых аминокислот под действием изотиоцианата аммония и восстановление этерифицированных белков и пептидов алюмогидридом лития. [c.154]

Инграм предложил использовать для определения концевых аминных групп реакцию восстановительного метилирования по Бауману. При действии на пептиды формальдегидом и одновременном восстановлении над палладием образуются N-диметильные производные пептидов, гидролизующиеся до диметиламинокислоты и аминокислот. [c.511]

Установление первичной структуры начинается с определения аминокислотного состава и молекулярной массы выделенного и очищенного белка. Белки, состоящие из нескольких полнпептидных цепей, разделяются с помощью денатурирующих реагентов (концентрированный раствор мочевины или ДСН) на мономеры. Дисульфидные мостики расщепляют восстановлением меркаптоэтанолом. Для предотвращения дисульфидного обмена и окисления образующихся свободных меркаптогрупп их блокируют каким-либо методом, например алкилированием иодуксусной кислотой с образованием 8-карбоксиметильного производного или цианэтилированием акрилонитрилом. После определения Ы- и С-концевых аминокислот полипептидная цепь расщепляется химически или ферментативно (в нескольких вариантах) на меньшие перекрывающиеся фрагменты. Для каждого фрагмента устанавливается аминокислотная последовательность. И наконец, комбинируя отдельные последователькости, приходят к полной последовательности исходной полипептидной цепи. [c.364]

Реакция с безводным гидраанном. Реакция с безводным гидразином является единственным химическим методом определения С-концевых аминокислот, который во многих случаях дает достоверные результаты. Два остальных метода — восстановление гидратами металлов и тиогидантоиновый метоД — дают, как правило, невоспроизводимые и недостоверные результаты. Метод предложен Акабори в 1952 г. Белок нагревают с гидразином (безводным) в запаянной ампуле при 100—120° в течение 8—10 часов. При этом происходит расщепление белка—гидразинолиз, в результате чего все аминокислоты, кроме С-концевой, образуют гидразиды. Обработкой бензальдегидом гидразиды аминокислот переводят в нерастворимые производные, которые удаляют фильтрованием. Свободные же С-концевые аминокислоты определяют хроматографически. [c.72]

С-концевая аминокислота в белках может быть установлена при помощи восстановления карбоксильной группы (например, литийборгидридом), в спиртовую, после чего в продуктах гидролиза обнаруживают С-концевую аминокислоту в виде соответствующего аминоспирта. С-концевую аминокислоту можно определять и ферментативным Бутем, действуя на белок карбоксипептидазой (стр. 334), которая гидролизует полипептидную цепь с карбоксильного конца. [c.41]

С-концевых аминокислот в этих соединениях Продукты реакции восстановления в среде Л/ -этилморфолина гидролизуются кислотой и полученные аминокислоты, а также аминоспирты, образовавшиеся из С-концевых аминокислот, разделяются с помощью бумажной хроматографии [1093, 1094]. Определение аминоспиртов методом бумажной хроматографии с помощью нингидрина как проявителя в смеси со значительно большими количествами различных аминокислот представляет значительные трудности. Однако можно провести разделение обоих компонентов, если продукты гидролиза обработать динитрофторбензолом согласно методу Зангера. При этом образуются Л/ -динитрофенильные производные аминокислот и аминоспиртов. Л/ -динитрофенильные производные аминоспиртов извлекаются из водных растворов щелочей диэтиловым эфиром, тогда как соответствующие производные аминокислот остаются в водной среде [1206, 1611]. [c.454]

Другой побочной реакцией при восстановлении пептидов алюмогидридом лития является восстановление пептидных связей до стадии образования спиртов, которые также выделяются в виде динитрофепильных производных. Поскольку эти спирты образуются не из С-концевых аминокислот, их присутствие мешает точному определению структуры пептидов. [c.454]

Модифицированный метод восстановления с определением С-концевой аминокислоты в форме ДНФ-аминосппртов приводит Ютиш [1]. В этой работе указаны также значения Rj ДНФ-аминоспиртов на бумаге, пропитанной силиконом. Другие системы растворителей, удобные для хроматографирования ДНФ-аминосниртов на необработанной бумаге, приведены в табл. 87. [c.490]

Глобула трансферрина состоит из двух половин N и С, которые различаются наличием концевого атома азота или углерода полипептидной цепи. В свою очередь N- и С-половины разделены на два домена щелью, в которой находится атом железа в состоянии Fe ". Лигандное окружение Ре +(рис. 14.296) одинаково для N- и С-половин глобулы трансферрина. Кроме обозначенных лигандов — аминокислот, — в число лигандов входит Со (Соз ) или Н2О (ОН) . Карбоксианион связывает Fe + с белком и препятствует освобождению из щели в процессе переноса атомов железа в организме. Восстановление железа до Ре +, которое происходит в клетках, ведущих синтез железосодержащих белков, приводит к его освобождению из трансферрина. Считается, что электронная структура Ре + в транс-феррине одинакова для N- и С-половин, однако динамическое поведение может отличаться, поскольку N-половина легче связывает и освобождает атом железа и термодинамически менее стабильна, чем С-половина. Это свойство связано, вероятно, с тем, что С-половина обладает дополнительными связями в районе щели, например дисульфидным мостиком. Поэтому следует ожидать более прочной связи Ре + с белком (решеткой твердого тела) в С-половине и, как следствие, более быстрой релаксации. [c.480]

Для определения С-концевых аминокислот используют также восстановление белка гидридами металлов и обработку изотиоцианатом аммония, в результате которой из С-концевой аминокислоты образуется тио-гидантоин Однако оба метода не свободны от существенных недостатков (побочные реакции, неясный механизм), а потому полученные с их помощью данные нуждаются в дополнительной проверке. [c.76]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

Твердофазный синтез правильнее всего рассматривать как особый случай ступенчатого синтеза пептидов с С-конца (т. е. с карбоксильного конца пептида). Соединение С-концевой аминокислоты с полимером в действительности является замещенным бензиловым эфиром, а химические процессы твердофазного пептидного синтеза по существу такие же, как в случае проведения ступенчатого синтеза бензилового эфира пептида в растворе, за исключением того, что пептиды с полимера невозможно удалить путем восстановления эфира водородом. Другая важная отличительная особенность твердофазного синтеза состоит в том, что для получения однородного продукта необходимо, чтобы все реакции протекали со 100%-ным выходом, так как в ходе синтеза очистка промежуточных веществ не проводится. На практике это означает, что по сравнению с обычным методом необходимо использовать более энергичные реагенты и более длительное время реакции для полного деблокирования аминогруппы, а также брать несколько молей каждой новой активированной аминокислоты для обеспечения полного включения этого аминокислотного остатка в пептидную цепь. При этом неизбежно некоторое увеличение расхода аминокислот, особенно при использовании карбодиимидного метода конденсации, так как в этом случае избыток аминокислоты нельзя регенерировать (активное промежуточное производное аминокислоты переходит в стабильную ацилмоче-вину и теряется как побочный продукт). Однако значительно более высокая скорость работы, достигаемая при твердофазном синтезе, и общие выходы, которые обычно очень высоки, в целом компенсируют этот недостаток. Теоретически в случае использования активированных эфиров на стадии конденсации производные аминокислот можно регенерировать. [c.19]

Все ОПЫТЫ по детальному изучению иммуноглобулинов были проведены с ИгГ, который составляет 90% общего количества иммуноглобулинов в нормальной сыворотке всех исследованных видов. Молекулярный вес ИгГ, определенный разными методами, колеблется от 140 ООО до 190 ООО, а по последним, более точным данным, от 140 ООО до 150 ООО [5, 6]. Предполагали, что определение К-копцевых аминокислот даст возможность подсчитать число полипептидных цепей в молекуле ИгГ, однако при исследовании ИгГ разных видов как по методу Сэнджера, так и по методу Эдмана были получены сильно варьирующие результаты, которые приведены в табл. 3. Из этих данных следует, что если в изученных полипептидах нет блокированных К-концевых аминокислот, можно считать, что белки разных видов содержат различное количество полипептидных цепей. Эдельман [7 показал, что восстановление человеческого ИгГ меркаптоэтанолом в присутствии 6 М мочевины приводит к снижению молекулярного веса примерно на 1/3 по сравнению с исходным. Эдельман и Поулик [8] и другие исследователи [9, 10] обнаружили, что ИгГ лошади, свиньи, кролика и коровы сходны между собой. Из этих данных следует, что ИгГ всех видов сходны но основной структуре и содержат по крайней мере три полипептидные цепи. Разнообразие К-концевых аминокислот, из которых часть содержится в незначительных количествах, свидетельствует о сложности состава всех препаратов ИгГ. [c.101]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Белки, заведомо имеющие неблокированную N-концевую аминокислоту, но не поддающиеся анализу на секвенаторе, ведут себя так по разным причинам. Если в ходе восстановления и алкилирования (в гидрохлориде гуанидина или в мочевине) ие было тщательного контроля pH (>7,0) и ко1щентрации алкилирующего агента, то существует определенная вероятность реакции этого агента с N-концевой аминокислотой. Если это происходит, то белок оказывается блокированным . Эта частная проблема становится бедствием, ибо не существует удобного способа удаления алкилирующей группы. Второе затруднение возникает, если белок нерастворим в одном или нескольких реагентах (растворителях). Мы обнаружили, что чаще всего это относится к квадрольному буферу. Часто, когда в присутствии квадрола было невозможно провести анализ, замена его на ДМАА-буфер позволяла получить отличные результаты. [c.427]

Химическое восстановление С-концевой аминокислоты в соответствующий спирт было первой химической реакцией, использованной для определения С-концевой аминокислоты белков. Например, инсулин нагревали с LiAlH4 в N-этилморфолине при 55 °С в течение 8 ч и определяли полученные аминоспирты методом хроматографии на бумаге [26]. Реакцию восстановления [c.496]

Для восстановления С-концевых аминокислот ди- и трипеп-тидов использовали коммерчески доступный дигидробис(2-мето-ксиэтокси) алюминат натрия [75]. Метод позволяет исключить предварительную этерификацию карбоксильных групп. Аминоспирты идентифицировали бумажной хроматографией. До сих пор неизвестно о применении этого способа восстановления для определения С-концевых аминокислот белков. Сообщалось, что NaBH4 в водном растворе (но не в органическом растворителе) селективно и почти количественно восстанавливает этерифици-рованные С-концевые аминокислоты в соответствующие спирты [32]. При работе с лизоцимом, инсулином быка, конканавалином А были получены ожидаемые производные, при этом не была обнаружено побочных процессов. Этот подход может быть доведен до практической методики С-концевого анализа белков, хотя дальнейшее развитие событий во многом зависит от степени надежности аналитического определения аминоспиртов, получающихся из всех обычных аминокислот. [c.497]

РИС. 18.12. Определение С-концевой последовательности избирательным восстановлением пептида днгидробис-(2-метоксиэтокси) алюминатом натрия (ДАН), превращением ациламиноспирта в пептидил-2-оксазолидон. Мягкий гидролиз последнего дает укороченный пептид и 2-оксазолидон С-концевой аминокислоты [75]. [c.506]

Была сделана попытка применить метод селективного восстановления концевых аминокислот (разд. 18.3.3) для анализа последовательности С-концевых аминокислот [75]. Из пептидил-аминоспирта при помощи карбонилдиимидазола можно получить N-aцил-2-oк aзoлидoн, от которого в мягких условиях (0,3 М кислота, 1—2 ч) отщепляется 2-оксазолидон при этом образуется укороченный пептид с новой С-концевой аминокислотой (рис. 18.12). [c.506]

Смотреть страницы где упоминается термин Аминокислота концевая восстановление: [c.513] [c.185] [c.281] [c.592] [c.619] [c.403] [c.396] [c.432] [c.396] [c.184] [c.184] [c.140] [c.510] [c.117] [c.485] [c.308] [c.29] [c.91] [c.104] [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология