Глюкозооксидаза ферментный

Непрерывно улучшаются также и сами технологические схемы производства ферментных препаратов. Поверхностное выращивание все более заменяется глубинным. Вводятся новые приемы концентрирования и очистки например, разработана технология сорбции амилазы на силикагеле или модифицированном крахмале, глюкозооксидазы на каолине разрабатываются способы промышленного получения многих ферментов, в частности протеолитических с применением ионообменных смол и т. п. [c.201]

С помощью глюкозооксидазы можно предохранить многие пищевые продукты от окисления с поверхности в связи с этим фермент используют при упаковке сыров, мяса, кофе. Сыр покрывают специальной пленкой, смоченной ферментным раствором, защищая его таким образом от проникновения кислорода, окислительных изменений, в частности от темного окрашивания в верхних слоях. Мясо заворачивают в фольгу, пропитанную реакционной смесью и содержащей глюкозооксидазу,— это помогает сохранению его естественного цвета. [c.276]

Это не единственный пример сочетания двух ферментов в ферментном электроде. Так, в работе [137, с. 69] на платиновый электрод нанесены щелочная фосфатаза и глюкозооксидаза, обеспечивающие селективную реакцию электрода на изменение концент- [c.130]

Есть еще одна область пищевой промышленности, в которой применяются пропионовокислые бактерии получение порошка яичного белка. Остаточные углеводы белка куриных яиц вступают в реакцию с аминокислотами с образованием меланоидинов, отчего порошок темнеет и приобретает неприятный запах. Применение пропионовокислых бактерий позволило удалить углеводы из жидкой белковой массы, последняя обогащается при этом витамином Bi i и некоторыми свободными аминокислотами. Санитарно-бактериологическое состояние нового продукта улучшается, а срок его хранения увеличивается до 1,5 лет (против шести месяцев). Ранее для обессахаривания яичного белка использовали ферментные препараты — глюкозооксидазы и каталазы, но [c.466]

В амперометрических ферментных электродах используют, как правило, окислительно-восстановительные ферменты, относящиеся к классу оксидаз, и катализирующие окисление различных субстратов кислородом. При этом в процессе реакции происходит потребление кислорода, а продуктом является пероксид водорода или вода. К одному из наиболее ценных соединений, анализ которого важен в медицине, микробиологической или пищевой промышленности, относится глюкоза. Ее определение с использованием ферментного электрода основано на реакции окисления глюкозы кислородом или искусственным акцептором электронов, катализируемое глюкозооксидазой. В процессе ферментативной реакции, протекающей в тонкой пленке иммобилизованной глюкозооксидазы, непосредственно контактирующей с электрохимическим детектором, в системе изменяются такие параметры, как pH раствора, концентрация кислорода и пероксида водорода. Причем их изменение происходит в строгом соответствии с определяемой концентрацией глюкозы, что позволяет ее количественно определить по соответствующему калибровочному графику. В соответствии с этим можно выбрать тот или иной способ детекции. Изменение концентрации кислорода регистрируется кислородным электродом, отделенным от исследуемого раствора проницаемой для газов мембраной. Электрохимическая реа Сция происходит при потенциале электрода, соответствующем предельному диффузионному току кислорода. При регистрации пероксида водорода в конструкции электрода отсутствует полупроницаемая мембрана и анализ глюкозы проводят при потенциале электроокисления пероксида водорода. [c.81]

Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— [c.111]

Использование кислородного электрода Кларка для детектирования потери или образования кислорода в ферментативной реакции стало интересным шагом в развитии иммуноферментного анализа. В качестве ферментных меток чаще всего используют глюкозооксидазу и каталазу. [c.58]

Приблизительно 5 процентов взрослого населения развитых стран являются диабетиками. Важную роль в лечении диабета играла и продолжает играть аналитическая химия. С этой целью было разработано бесчисленное множество методов. Однако благодаря специфичности ферментных реакций и чувствительности электрохимических методов в этой области все более популярными становятся глюкозные сенсоры. Схема катализируемого глюкозооксидазой (GOD, ЕС 1.13.4) окисления глюкозы имеет следующий вид [c.259]

Окисление p-D-глюкозы в D - г л ю к о и о-б-л а к-т о н. Эту реакцию катализирует глюкозооксидаза (нотатин, пенициллин В), содержащая ФАД (2 моля на моль фермента) [438]. Молекулярная масса фермента 154 ООО он содержится в плесневых грибах Peni illium notatum и др. [439, 4401. Механизм ферментного окисления изучен с помощью Н , меченной 0 [4411, при этом оказалось, что кислород, выделяющийся при разложении перекиси водорода под действием каталазы, не содержит О, т. е. глюкозооксидаза катализирует перенос водорода от глюкозы в газовой фазе, акцептором водорода служит газообразный кислород. По радикальному механизму в первой ступени реакции (З-Л-глюкопираноза (а) теряет протон и электрон с образованием свободного радикала (б), который, теряя второй электрон, образует оксониевый ион (в). Прототропная реакция между оксониевым ионом и перекисным анионом завершает окисление с образованием D-глюконо-б-лактона (г). [c.563]

На первой стадии глюкоза окисляется растворенным кислородом до -глюконолактона с образованием стехиометрического количества перекиси водорода, которая на второй стадии количественно окисляет о-дианизидин Существует большое количество модификаций метода с фотометрическим определением начальной скорости реакции на второй стадии или по конечной точке реакции, с использованием других субстратов пероксидазы — ферроцианида и других. В ряде модификаций вторая стадия проводится неферментативным способом. Помимо фотометрического широко используется также потенциометрический и амперометрический методы определения глюкозы с помощью глюкозоокси-дазы. Наиболее традиционным является применение кислородного электрода Кларка в сочетании с глюкозооксидазной мембраной. Совместная иммобилизация в мембране глюкозооксидазы и /3-глюкозидазы позволяют определять с помощью ферментного электрода активность целлюлазного комплекса Однако чувствительность ферментных электродов, как правило, ниже, чем у фотометрического метода с использованием глюкозооксидазы. [c.133]

Широкому распространению ферментного метода определения глюкозы на основе глюкозооксидазной-пероксидазной системы способствовали высокая чувствительность и простота определения. Однако данный метод имеет и свои ограничения, такие, как зависимость концентрации растворенного кислорода от состава анализируемого раствора и температуры, стереоспецифичность действия глюкозооксидазы, заключающаяся в ее способности окислять только /3-глюкозу, наличие в составе технических препаратов и культуральных жидкостях примесей, ингибирующих глюкозооксидазу и (или) пероксидазу. [c.133]

Перспективным представляется исследование биоэлектрокатализа гидрогеназами, системами ферментов, окисляющими метан и метанол, глюкозооксидазой, дегидрогеназами различных кислот, альдегидов, спиртов. Для разработки биокатода интересно исследовать ферменты, активирующие молекулярный кислород. Выше продемонстрированы возможности создания катода и анода на основе иммобилизованной лакказы и гидрогеназы. Создание биоэлектрохимических преобразователей энергии, имеющих параметры, приближающиеся к теоретически возможным значениям, сдерживается в настоящее время отсутствием достаточно больших количеств необходимых ферментных препаратов. Эта трудность с развитием инженерной энзимоло-гии будет, безусловно, преодолена. [c.92]

Гюильбо и Любрано [253, 254] сконструировали ферментный электрод на глюкозу, пригодный для ее амнерометрического определения в крови. Этот метод основан на прямом амперометрическом измерении перекиси водорода, выделяющейся при окислении глюкозы в соответствии с уравнением (14.1). Электрод представляет собой платиновый диск, покрытый тонким слоем глюкозооксидазы, химически связанной с полиакриламидом этот слой удерживается на поверхности платины целлофановой пленкой, которая укреплена на корпусе электрода резиновым колечком. После погружения электрода в раствор глюкозы последняя диффундирует в слой геля, где идет реакция (14.1). Образовавшаяся перекись водорода диффундирует из этого слоя к поверхности платины и окисляется на нем. Величина тока пропорциональна концентрации перекиси водорода, а следовательно, и концентрации глюкозы. Электрод ежедневно подвергают предварительной обработке, которая состоит в следующем. Электрод [c.172]

Ферментный электрод, чувствительный к глюкозе, используется для измерений в неперемешиваемых растворах. Основу его составляет иодид-селективный мембранный электрод, на поверхность которого нанесен тонкий слой смеси иммобилизованных глюкозооксидазы и пероксидазы. При погружении такого электрода в раствор глюкозы на его поверхности протекают последовательные реакции (14.1) и (14.3). В результате возникает градиент активности иодида в приэлект-родном слое по отношению к активности в объеме раствора. Наличие градиента концентрации обусловливает диффузию иодида к электроду, и при постоянной концентрации в объеме раствора в системе устанавливается стационарное состояние. [c.174]

Оксидазный тест на глюкозу и галактозу позволяет определять содержание этих веществ в ростовых средах, в нейтрализованных гидролизатах полисахаридов и в ферментных реакционных смесях, например содержа-ние глюкозы при ферментативном гидролизе целлюлозы, ИТ. п. Глюкозооксидаза окисляет только р-О-глюкозу, нО в присутствии мутаротазы (входящей в некоторые имеющиеся в продаже препараты) она позволяет определять и а-В-глюкозу. Для проверки возможного влияния солей и других ингибиторов в каждый неизвестный раствор целесообразно добавлять стандарт без углеводов. [c.298]

Андеркофлер Л. А. Глюкозооксидаза, ее производство, свойства и возможные способы применения//Производство и применение ферментных препаратов в пищевой промышлеииости. М.., 19636. С. 73—85. [c.215]

Рис. 13. Ферментные электроды а — ферментный электрод иа основе стеклянного электрода для измерения pH / — металлический электрод 2 — резиновое кольцо 3 — диализная пленка или другая полупроницаемая мембрана 4 — раствор фермента или слой полимерного геля, содержащего фермент 5 — стеклянная мембрана проницаемая для ионов водорода 6 — приэлек-тродный буферный раствор б — схема электрода для определения глюкозы / — катод 2 — электрод сравнения, находящийся во внутреннем буферном растворе 3 — полупроницаемая полимерная мембрана 4 — слой иммобилизованной глюкозооксидазы

В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент -гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом - глюкозооксидаза. Глюко- [c.84]

В иммуноанализе на основе ферментных каналов используют два фермента, катализирующих последовательные реакции, причем продукт реакции с участием первого фермента служит субстратом для второго (рис. 10-1). Эффективность катализа сопряженных реакций максимальна, когда молекулы обоих ферментов находятся в непосредственной близости на поверхности твердых частиц или в составе молекулярных агрегатов (Mosba h, Mattiason, 1970). В этом случае благодаря высокой локальной концентрации промежуточного продукта второй фермент работает с большим числом оборотов. Мы использовали пару ферментов, составленную из глюкозооксидазы и пероксидазы. [c.131]

Ферментативный иммунохроматографический метод. Добавляют 10—20 мкг образца (буферного раствора, сыворотки или цельной крови) к 1 мл ферментного реагента (приготовленного на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 и содержащего 0,2 моль хлорида натрия 0,2—1,0 мг конъюгата [теофиллин — пероксидаза] 100 мг глюкозооксидазы 2 г неиммунных IgG барана). В полученную смесь погружают край индикаторной полоски (4x90 мм), содержащей иммобилизованные антитела против теофиллина ( 30 мкг/см ),и дают растворителю подняться за счет капиллярных сил до противоположного края полоски (на это уходит 10 мин). Переносят полоску в проявитель (приготовленный на 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, и содержащий в 1 л 0,02 моль хлорида натрия 0,5 г тритона QS-44 400 мг 4-хлорнафтола 0,05 моль глюкозы 2 г бычьего сывороточного альбумина). Через 5 мин на бумаге появляется голубая окрашенная область в форме ровной полосы или ракеты. Высота окрашенной области пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для количественного анализа предварительно строят калибровочную кривую, отражающую зависимость высоты окрашенного фронта от концентрации теофиллина. [c.135]

Многие свойства ферментных меток исключительно ценны для иммуноанализа в лабораторных условиях, однако нелабораторные методы предъявляют более жесткие требования. Ферментам присущи ограниченная термостабильность, зависимость катализа от времени и температуры, чувствительность к помехам со стороны образца. В лабораторных методах для преодоления этих недостатков применяют ячейки с регулируемой температурой, точно измеряют время и предварительно обрабатывают образцы. Чтобы упростить использование индикаторных полосок, мы создали систему внутреннего стандарта, в которой компенсируются изменения каталитической активности. Эта система, состоящая из совместно иммобилизованных глюкозооксидазы и антител против пероксидазы, отличается от индикаторной полоски для определения морфия только специфичностьк антител. Поэтому можно ожидать, что цветные реакции на обеих поверхностях в одинаковой степени зависят от температуры активности фермента и от помех со стороны образца. [c.137]

В этом методе, как и в предыдущем, производится иодирование тирозинов белка за счет Na I, но вместо сильного химического окислителя используется ферментная система. Преимущество такого подхода состоит в том, что белок не находится в контакте с сильным окислителем. Иногда в этом направлении идут еще дальше и, чтобы избежать контакта белка с перекисью водорода, вводят две сопряженные ферментные системы глюкоза и глюкозооксидаза образуют НгО, за счет воды и окисления глюкозы, а затем уже лактопероксидаза использует образующуюся перекись водорода для окисления иода. [c.239]

О биосенсорах, т. е. сенсорах, включающих биологический материал (рис. 1.4), впервые сообщалось на симпозиуме New York A ademy of S ien es в 1962 г. [6]. В этом сообщении было предложено использовать ферментные преобразователи, встроенные в мембраны (так, что получается подобие сандвича), чтобы сделать электрохимические сенсоры (pH, полярографические, потенциометрические или кондуктометрические) более совершенными. В результате получились сенсоры, специфически чувствительные к определенным субстратам, поскольку они детектировали образование продукта ферментативной реакции или расход одного из участвующих в этой реакции веществ. Описана, в частности, комбинация глюкозооксидазы с Ог-электродом Кларка для определения глюкозы по убыли содержания кислорода при превращении глюкозы в глюконовую кислоту и пероксид водорода. [c.14]

Различные комбинации мембран на основе антител и ферментных электродов могут привести к созданию новых автоматизированных сенсоров, чувствительных к антигенам. Такие биосенсоры, возможно сопряженные с сенсорами ферментов печени, позволяют обеспечить быстрое и надежное наблюдение за кровеснабжением. На рис. 1.6 показан иммуносенсор на основе измерения потребления кислорода в присутствии глюкозооксидазы и глюкозы. Таким образом определяют содержание антител поверхностного антигена вируса гепатита В. Описаны и другие электроферментные методы для иммунологических исследований, и это направление, видимо, будет интенсивно развиваться (гл. 14). [c.18]

Концентрация растворимого ферментного электрода (гл. 1) впервые была выдвинута Кларком и Лайонсом [6] в 1962 г. Однако лишь в 1971 г. была создан [50] первый работающий ферментный электрод на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в геле на поверхности полярографического кислородного электрода, который позволяет определять глюкозу в биологических жидкостях и тканях. Ферментные электроды могут работать и как вольтамперометрические, и как амперометрические датчики, то есть измеряется ток при приложенном постоянном напряжении. В 1969 г. Гилболт и Монталвв [19] предложили первый потенциометрический (измеряется потенциал системы без наложения внешнего напряжения) ферментный электрод для определения мочевины. С тех пор в литературе описано более ста различных электродов данные [c.120]

Из приведенных выше примеров наиболее хорошо изучена, по-видимому, глюкозо-оксидазная редокс-электродная система [3, 10-12]. Глюкозооксидаза катализирует реакцию между р-В-глюкозой и О2 с образованием глюконолактона и пероксида водорода. Как отмечено во введении, в биокаталитических ферментных редокс-элект-родных системах оксидоредуктазный фермент иммобилизован на поверхности электрода, а определяемое вещество находится в растворе. Другие редокс-системы могут включать 1) иммобилизацию кофактора фермента, например порфирина или флавина, на поверхности электрода в расчете на то, что содержащиеся в пробе апоферменты смогут катализировать окисление или восстановление иммобилизованных редокс-цент-ров 2) иммобилизацию фермента и медиатора на поверхности электрода. Работая с глюкозооксидазой, мы иммобилизовали фермент на электроде из благородного металла или углерода. Предполагается, что потенциал этих электродов зависит от концентрации глюкозы, кислорода и пероксида водорода в растворе, а также наличия функциональных групп на поверхности платины или углерода. Ниже приведена методика и результаты работы с глюкозооксидазным редокс-электродом. [c.134]

Мы исследовали ряд различных проводящих органических солей на предмет использования их в ферментных электродах [7]. Входящие в состав этих солей доноры и акцепторы электронов приведены ниже. Многие проводящие органические соли впервые были синтезированы Мелби и сотр. [24, 25], а их электрохимические свойства изучены в работах [19, 20]. Почти все полученные нами соли проявляют электрохимическую активность по отношению к глюкозооксидазе. Это открытие несколько удивило нас, поскольку мы полагали, что для эффективного переноса электрона взаимодействие между поверхностью и ферментом должно быть достаточно специфическим. На [c.160]

До сих пор наше внимание было сосредоточено на системе с глюкозооксидазой, но и другие ферменты реагируют с электродами на основе проводящих органических солей. Из исследованных нами материалов [7] соль TTF T NQ дает наименьший фоновый ток, поэтому для дальнейшей работы была выбрана именно она. Этот электродный материал использовали в сочетании с четырьмя ферментными системами, содержащими флавиновую простетическую группу, FAD. Во всех случаях восстановленный фермент можно окислять непосредственно на электроде. Подробные сведения [c.166]

Ферменты, принимаюшие участие в окислении или восстановлении биологических молекул (оксидоредуктазы), либо содержат в активном центре группу, которая может окисляться/восстанавливаться, например железо, медь, флавин или хинон, либо выполняют свою биологическую роль совместно с каким-либо редокс-кофактором, например ЫАВ(Р) . Из-за трудности осуществления прямой электрохимической реакции между редокс-центром и голым электродом и отсутствия эффективных электро-каталитических поверхностей для рециклирования восстанавливаемого кофактора в первых ферментных электродах электрохимические процессы лишь косвенно влияли на активность фермента. Классическим примером является сенсор глюкозы па основе фермента глюкозооксидазы и полярографического кислородного электрода, предложенный Кларком и Лайонсом [15] в 1962 г. и усовершенствованный Апдайком и Хикссом [54] в 1967 г. (гл. 1). Глюкозооксидаза представляет собой РАВ-содержащий фермент (рис. 15.1), катализирующий окисление глюкозы в глюконовую кислоту [c.212]

Ферроцен представляет собой л-ареновый комплекс переходного металла, который состоит из атома железа, зажатого двумя циклопентадиениловыми кольцами. С электрохимической точки зрения это классическая редокс-пара (Е° = 165 мВ относительно н.к.э.), на физические и химические свойства которой можно влиять, вводя заместитель в любое из двух колец молекулярной системы [43]. Первый успешно работающий ферментный электрод на основе ферроцена содержал нерастворимое производное ферроцена и глюкозооксидазу [11]. Проще говоря, 1,Г-диметилферроцен внедрили в графитовый электрод, на котором химически иммобилизовали глюкозооксидазу (гл. 16). В этой конфигурации электрохимически генерированный ферроцений-ион действует как окислитель восстановленной глюкозооксидазы. Образовавшаяся при этом восстановленная форма ферроцена реокисляется на поверхности электрода в результате поляризации электрода при пропускании тока. Последовательность реакций, протекающих на электроде, можно представить в виде [c.214]

Растворимость кислорода в воде составляет примерно 0,25 мМ, а величина относительно кислорода для глюкозооксидазы необычайно велика-около 0,5 мМ [5]. Для того чтобы отклик электрода на увеличение концентрации глюкозы был линеен, реакция на электроде должна контролироваться скоростью диффузии глюкозы в ферментный слой. Однако из-за высокого (по отношению к низкой растворимости кислорода) значения Кщ отклик электрода становится нелинейным при концентрации глюкозы выше 1 г/л (рис. 19.1, а). Концентрация кислорода в ферментере обычно яамного ниже и может даже приближаться к нулю, вследствие чего ферментативная зеакция из лимитируемой глюкозой становится лимитируемой кислородом в неопределенной точке. Таким образом, глюкозный электрод, зависящий от диффузии сислорода, непригоден для работы в ферментере in situ. [c.283]