Белок А иммобилизованный

Эту хроматографию можно применять во всех случаях, когда белки или пептиды содержат сульфгидрильные группы, чтобы их изолировать, разделить, иммобилизовать, если это, например, ферменты. Она пригодна также для иммобилизации или выделения полинуклеотидов, содержащих ртуть. [c.84]

Следует сказать, что вышеупомянутые методы измерения относятся к случаю радикала, вращающегося в изотропной среде, т. е. к случаю изотропной диффузии. Однако, в реальных ситуациях спектры ЭПР спиновых меток следует анализировать, исходя из того, что подвижность метки слагается из двух составляющих движения метки относительно молекулы биополимера и движения самой молекулы биополимера, несущего на себе метку. В случае, если метка жестко иммобилизована на поверхности биополимера, спектр ЭПР отражает подвижность только молекулы биополимера, поскольку движение метки будет определяться относительно медленным вращением белковой глобулы. Эффективное время корреляции можно определять, измеряя, например, расстояние между крайними широкими пиками и ширину линий в спектре (Кузнецов, 1976). Однако, случай, когда спиновая метка жестко связывается с молекулой биополимера, практически не реализуется. Па самом деле, спин-метка, связанная с белком, принимает участие в двух типах движения. Во-пер-вых, это быстрое вращение оси радикала и ее колебания относительно системы координат, связанной с глобулой. Это движение носит локальный характер. Во-вто-рых, это движение самой белковой глобулы, которое может носить изотропный характер (сферическая глобула) и замедляется с ростом вязкости окружающей среды. [c.279]

Емкость гелей. С гелем может связаться максимально 3 мг белка на 1 мл геля. Если требуется высокое содержание белка в геле, то в реакцию присоединения следует вводить 30—50 мг белка. В то же время следует заметить, что если требуется иммобилизовать как можно больше введенного в реакцию белка, нужно использовать относительно низкую концентрацию белка (10—20 мг) в растворе для реакции присоединения. [c.89]

NBr-активированную сефарозу (10 мл) смешивают с 40 мг триптофаназы, растворенной в 0,1 М калийфосфатном буфере (pH 7,0 5,0 мл). Смесь осторожно перемешивают в течение 24 ч при 4 °С. В результате этой реакции 80% исходного количества белка иммобилизуется на сефарозе. Препарат иммо- [c.141]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Поверхность фибриллярных и глобулярных белков имеет большое количество гидрофильных групп, создающих вокруг этих макроструктур почти сплошную водную оболочку. Гидрофобные радикалы аминокислот, образующих полипептидные цепи, обращены, видимо, преимущественно внутрь структуры. Тем не менее некоторые количества воды связаны (иммобилизованы) и внутри их 1) диполи воды могут вклиниваться в водородные связи, не нарушая их прочности 2) гидрофильные группы содержатся и во внутренних отделах макроструктур белков, где связывают определенное количество воды 3) некоторое количество воды замкнуто внутри белковых молекул в своеобразных сотах , образованных гидратированными полипептидными цепочками. Благодаря этому различают интрамицеллярную воду, находящуюся внутри белковых глобул, и интермицеллярную воду, находящуюся в свободном состоянии между ними. Для устойчивости коллоидных частиц имеет значение только вода, создающая внешнюю водную оболочку, препятствующую столкновению и объединению частиц. [c.180]

П р И м е р 21. Очистка ДНК-связывающих белков из ядрышек гепатомы Новикова распределением между двумя колонками ДНК-сефадекса [Bearden, 1980]. Предложенная автором методика УФ-иришивки ДИК к сефадексу G-10 рассмотрена выше. Для очистки ядрышковых белков была использована оригинальная система, показанная на рис. 145. В замкнутую цепь рециркуляции были включены последовательно две колонки ДНК-сефадекса большая (0,9 X 25 см), на которой иммобилизовали 44 мг гетерологичной Д]г1К спермы лосося, и малая (0,9 х 2 см), содержавшая 0,3 мг гомологичной ДНК из ядрышек гепатомы. [c.427]

Внутримол. динамика мембранных белков изучена меньше, чем липидов. Известно лишь, что боковые заместители на тех участках полипептидной цепи, к-рые погружены в липидный бислой, в значит, мере иммобилизованы. Мн. мембранные белки способны легко диффундировать вдоль мембраны и обладают довольно высокой вращат. подвижностью. Но даже в случае самых подвижных белков измеряемые коэф. диффузии примерно на порядок ниже, чем для липидных молекул. Времена вращат. релаксации для интегральных белков лежат в диапазоне от 20 до 500 мкс, а коэф. латеральной диффузии (вдоль бислоя) варьирует от 7-10 до 10 см -с . [c.30]

Метод спиновых меток оказался весьма эффективным для изучения структуры биологических мембран и конформационных явлений в мембранах [263, 264]. Весьма перспективно изучение ядерной релаксации в биополимерах, содержащих парамагнитную метку. Время релаксации зависит от взаимодействия спинов ядра и электрона и, следовательно, от расстояния между ними (Т пропорционально г ). Тем самым, можно получить информацию о геометрии молекулы и о ее движениях [265]. В работах [266] изучались спектры ЭПР и ЯМР алкогольдегидроге-назы, меченной аналогом никотинамидадениндинуклеотида. Оказалось, что метка конкурирует с НАД-Н в месте связывания ферментом, сильно иммобилизуется белком, резко изменяет время релаксации протонов воды, причем величина Т сильно зависит от концентрации спирта. Установлено место связывания спирта этим ферментом и оценены кинетические и геометрические характеристики системы. [c.346]

Большинство белков может быть иммобилизовано в мягких условиях на NBr-активированной агарозе илн агарозе, активированной другим методом. [c.451]

Методы иммобилизации не требуют обязательного выделения определенного фермента. Интактные клетки, содержащие нужный фермент, можно иммобилизовать на твердой поверхности. Например, интактные клетки бактерий Е. соН использовались после иммобилизации для катализа химического превращения фумаровой кислоты и аммиака в аспарагиновую кислоту — один из аминокислотных строительных блоков белков. Кроме того, иммобилизованные клетки дрожжей могут применяться при ферментации в производстве этилового спирта. Этот процесс был реализован в крупном опытном производстве. [c.122]

Для иммобилизации ферментов применяют растворы полиэлектролитов, способные к фазовому разделению при определенных условиях. Запатентован способ иммобилизации большой группы ферментов (более 10) путем смешения растворов хитозана и фермента с последующим осаждением комплекса щелочью либо ионами SOl с полным сохранением ферментативной активности белка (пат. 4167447 США). Аналогичным способом с использованием хитозана была иммобилизована уреаза (пат. 80—74794, 1980 Япония). Из кислого раствора фермента и хитозана отливали пластинки, которые после высушивания выдерживали в боратном буфере. Полученная пластинка имела удельную активность 0,08 ед/см . С помощью водорастворимого карбоди-имида на хитозане иммобилизовали глюкозоизомеразу [102]. Таким образом, процесс иммобилизации не вызывает инактивации фермента, более того, такая обработка снижала степень инактивации фермента ионами металлов. [c.127]

Химические сигнальные механизмы различаются по расстояниям, на которых они действуют 1) в случае эндокринной сигнализации специализированные эндокринные клетки выделяют гормоны, которые разносятся кровью и воздействуют на клетки-мишени, находящиеся иногда в самых разных частях организма 2) в случае иаракринной сигнализации клетки выделяют локальные химические медиаторы, которые поглощаются, разрушаются или иммобилизуются так быстро, что успевают подействовать только на клетки ближайшего окружения, быть может, в радиусе около миллиметра 3) при синаитической передаче, используемой только в нервной системе, клетки секретируют нейромедиаторы в специализированных межклеточных контактах, называемых химическими синапсами, Нейромедиаторы диффундируют через синаптическую щель, обычно на расстояние около 50 нм, и воздействуют только на одщ постсинантическую клетку-мишень (рис. 12-2). В каждом случае мишень реагирует на определенный внеклеточный сигнал с помощью специальных белков, называемых рецепторами, которые связывают сигнальную молекулу и инициируют ответ. Многие сигнальные молекулы и рецепторы используются в передаче сигнала и по эндокринному, и по паракринному, и по синаптическом типу. Главные различия касаются быстроты и избирательности воздействия сигнала на определенные мишени. [c.339]

Если получены два антитела к стерически различным участкам белкового продукта ОРС, их можно использовать для специфической детекции этого белка с помощью радиоиммуноанализа. При этом методе одно из антител (связывающий агент) иммобилизуется на пластике, из которого изготовлены лунки планшета. Второе антитело (антитело второго порядка) иодируется до достижения высокой удельной радиоактивности (100 мкКи/мкг) с помощью специального метода (табл. 6.12). Метод твердофазного радиоиммуноанализа подробно приводится в табл. 6.13. [c.199]

В ТО-е гг. первым исследованием упаковки липидов вблизи мембранного белка в небольпаих временных интервалах (< 10 с) было определение подвижности спин-меченной жирной кислоты в реконструированной системе цитохромоксидаза — эндогенные митохондриальные фосфолипиды методом ЭПР. В дальнейшем подобные эксперименты проводились с использованием цито-хромоксидазы и цитохрома и липидных бислоев, содержаш их грамицидин А, а также мембраны микросом печени крысы, эритроцитов, вирусов Синдбис и везикулярного стоматита. Было показано, что значительная часть липидов в этих мембранах иммобилизована за счет белок-липидных взаимодействий. Количество иммобилизованных липидов при температурах 20—40 °С составляет примерно 0,2 мг на 1 мг белка (47 молекул фосфолипидов на белковый комплекс) цитохромоксидазы, что соответствует приблизительно одному слою липидов вокруг белковой глобулы. Примерно такое же количество (45—90) молекул иммобилизуется за счет взаимодействия с Са -АТФазой саркоплазматического ре-тикулума. Понижение температуры может приводить к возрастанию количества иммобилизованных липидов в 2—3 раза. [c.59]

Как видно из схемы, помимо альдегидных и аминных групп в реакцию (18) вступают соединения с карбоксильной группой и изонитрилы с образованием амидной связи между белком и носителем. Иными словами, по методу Уги ферменты можно ковалентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и карбоксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группи-ров в присутствии низкомолекулярных альдегидов. [c.93]

Уменьшение каталитической активности фермента за счет стерических факторов проявляется особенно часто в случае высокомолекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализаторов, действующих на белки, нуклеиновые кислоты и другие природные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой. Стерические ограничения иногда удается уменьшить или даже полностью устранить путем деградации носителей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кислотами и т. п.) или специальными ферментами (декстраназой, цел-люлазой и др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затронула первичную структуру и не нарушила пространственную организацию ферментов, пришитых к носителю. [c.108]

Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество-инактиватор. Например, многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые для катализа, инактивируются в результате их отравления катионами тяжелых металлов по механизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой фермент с другим белком с высоким содержанием реакциониоспособных SH-rpynn или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные тиолы, добиваются того, что основная часть катионов металлов расходуется не на отравление фермента, а на модификацию SH-rpynn несущественного белка или тиола. [c.127]

Способ получения таких иммобилизованных ферментов заключается в соосаждении поликатионов с ферментами под действием полувосстановленной соли ТЦХДМ. Фермент иммобилизуется в водопроницаемые полимеры с высокой электрической проводимостью (вплоть до 10" Ом - см ). Емкость носителей — до 500 мг белка на 1 г носителя. [c.78]

В гл. 3 уже была описана иммобилизация гонадотропина хориона человека (ГХЧ) путем активации реакционноспособным азокрасителем. Этим же методом Грибнау и сотр. иммобилизовали также другие белки, например анти-ГХЧ кролика и анти-(кроличий IgG) барана. [c.135]

Техника микроинъекций, первоначально разработанная 1970 г. для клеток животных независимо А. Грасс.манном и> Е. Г. Дьякумакосом, в настоящее время стала рутинным методом для введения небольших молекул, макромолекул (ДНК,. РНК, белков), органелл и вирусных частиц в самые различные животные клетки [4]. Методика основана на использовании стеклянных микропипеток с диаметром кончика 0,5—10 мкм,. с помощью которых осуществляют прямой перенос макромолекул в цитоплазму или в ядро реципиентной клетки или органа. Последние иммобилизуют на твердой подложке, искусственно связывают с субстратом или закрепляют посредством пипетки с присоской [1, 17, 39]. [c.221]

Создание молекулярных аналоговых устройств переработки информации основано на использовании больших белковых молекул и, в частности, ферментов. Молекулярные системы такой сложности, как белки, ферменты и другие аналогичные им соединения, имеют достаточно много устойчивых состояний. Разработано и возможное управление переходами между этими состояниями — оптическое возбуждение, изменение кислотности (pH) среды, воздействие полей и т. д. Это позволяет на базе ферментов, функционально наиболее гибких белковых молекул, построить устройства переработки информации принципиально новой архитектуры. Белковые молекулы легко иммобилизуются на подложках, образуя квазидвумерные системы, к тому же они дешевы и легко доступны, стоимость их получения постоянно снижается. [c.43]

Большой интерес представляет тот факт, что значительная часть сывороточных / -белков способна формировать комплексы с сывороточными у-глобулинами. Комплекс формируется за счет нековалентных взаимодействий, и для отделения / -белка достаточно обработать препараты таким детергентом, как дезоксихо-лат натрия (А. Я. Кульберг, И. А. Елистратова, 1985). Изолированный в указанных условиях / -белок сохраняет свои лиганд-связывающие свойства. В качестве иммуноглобулинов, связывающих / -белки, выступают IgG и IgA (А. Я. Кульберг с соавт., 1986) Для того чтобы оценить общее количество комплекса / -белок — иммуноглобулины в различных препаратах иммуноглобулинов (включая коммерческие), был использован следующий методический прием. Поскольку в отличие от / -белков собственно иммуноглобулины имеют вариотипические детерминанты в скрытой форме, антитела к этим детерминантам были иммобилизованы на сефарозе, и через колонки с таким иммуносорбентом пропускали препараты иммуногл булинов. Последние в комплексе с / -белками связывались иммуносорбентом за счет / -белков, а иммуноглобулины, не содержащие / -белка, прохо дили через колонку с иммуносорбентом. Таким способом удалось уста овить, что комплекс иммуноглобулинов с / -белками составляет в средь ем около 5 от общего количества иммуноглобулинов. [c.84]

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителе.м производят по возможности в мягких условиях, чт )бы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления иммуносорбеита крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины. [c.242]

Молекулярный механизм экзоцитоза до конца не выяснен. Существует несколько гипотез, объясняющих роль Са + в инициации движения секреторных пузырьков, их взаимного слияния и взаимодействия с поверхностной мембраной. Согласно одной из них, пузырьки иммобилизованы в цитоплазме покоящейся клетки благодаря существованию желеобразной структуры, состоящей из белков цитоскелета и контрактильных элементов, таких, как микротрубочки, филаменты актина и миозина. Образование таких гелей полностью ингибируется при концентрации Са + выше 1 мкМ. Поэтому предполагают, что увеличение концентрации Са + в клетке при ее активации и разжижение геля облегчают диффузию секреторных пузырьков. [c.98]

По окончании ЭИЗ каждую дорожку, соответствующую одному образцу, разрезают лезвием бритвы на 2-мнллиметровые кусочки по ранее намеченным линиям). Эти кусочки геля помещают в пробирки с иммуносорбентом в буфере ННТА и перемешивают, вращая в течение ночи при 4°С, для элюирования и иммунной сорбции специфических белков. Поскольку антитела иммобилизованы на сефарозе, иммунные преципитаты образуются только на ее гранулах, а не в буфере и ие в геле. [c.89]

Основные вопросы, связанные с иммобилизацией белков. При рассмотрении вопросов, связанных с иммобилизацией белков, в первую очередь необходимо отметить, что при иммобилизации белок частично денатурируется, то есть, по наиболее общему определению, изменяет в какой-то степени свои первоначальные (нативные) характеристики. Эти изменения происходят как под воздействием физико-химических условий синтеза (температура, состав и концентрация модифицирующего раствора), так и в результате ковалентной межмолекулярной сшивки. Поэтому условия синтеза гетероповерхностного сорбента, предназначенного для анализа биологических проб с прямым вводом, следует подбирать таким образом, чтобы, с одной стороны, не происходило значительных изменений нативной глобулярной структуры белка для создания максимально однородного внешнего покрытия частиц, а с другой — чтобы уже иммобилизованный белок был лишен детерминантных групп (активных центров) для устранения возможных биоспеци-фических взаимодействий с содержащимися в пробе белками. Хотя для иммобилизации используются преимущественно инертные белки (например, сывороточный альбумин), их инертность весьма относительна. Но, по крайней мере, такое допущение принимается по сравнению со специализированными белками. Примерно в половине работ, посвященных созданию селективных электродов и сорбентов при иммобилизации ферментов, последние иммобилизуются совместно с альбуминами или коллагеном, либо на их матрицы. [c.544]

Свойства бычьего сывороточного альбумина и некоторые примеры иммобилизации. Для разделения хиральных изомеров и для аффинной хроматографии были иммобилизованы еще некоторые узкоспецифичные белки, однако примеры использования этих неподвижных фаз для анализа биологических жидко- [c.547]

Другим плодотворным приемом оказалось использование двойных и тройных иммунных систем, когда, например, к первоначальным комплексам антиген—антитело присоединяются антитела, полученные от другого животного, иммунизированного сывороткой первого донора. Эти так называемые вторичные антитела узнают антитела, входящие в состав первичного иммунного комплекса, поскольку для второго животного первичные антитела являются антигенами. Кроме того, в систему можно ввести еще и белок А, способный присоединяться к одинарному или двойному иммунному комплексу, поскольку константная часть соответственно первичного или вторичного антитела в этих комплексах остается свободной. Белок А можно иммобилизовать Hii некоей матрице, создав тем самым сорбент для антител и иммунных комплексов. Этот белок можно использовать и прямо в составе бактериальной стенки. Убитые, но не разрушенные бактерии Staphylo o us aureus, за счет белка А способны связывать иммунные комплексы, в результате чего преципитация этих комплексов из раствора сводится к осаждению бактерий низкоскоростным центрифугированием. [c.270]

Вместе с тем вне сферы действия иммобилизованного гепарина остаются такие стадии, как адгезия тромбоцитов и лизис стабилизированного фибрина. И хотя, как показано в работе [68], сорбированные тромбоциты не претерпевают изменений и не оказывают существенного влияния на процесс формирования фибринового сгустка, это не исключает возможности образования белого тромба — ассоциатов тромбоцитов. Поскольку повышенная адгезия тромбоцитов на ГСП (табл. 7.1) обусловлена концентрированием на поверхности этих полимеров фибриногена за счет комплексообразования этого белка с иммобилизованным гепарином, то для решения этой проблемы в работе [69] предложено иммобилизовать на полимерной поверхности одновременно с гепарином протеолитические ферменты, способные гидролизовать адсорбированный фибриноген. Наличие на поверхности полимера таких ферментов обеспечивает также эффективное воздействие на фибриновый сгусток в случае его образования, например в сложных конструкциях в области застойных зон крови (рис. 7.3). Из рисунка видно, что с увеличением содержания в полимере иммобилизованного трипсина лизирующая способность полимеров повышается, а эффективность лизиса бинарными системами выше, чем системами с одним иммобилизованным трипсином. Таким образом, при использовании бинарных систем наблюдается взаимное влияние трипсина и гепарина, выражающееся в усилении гепарином литического действия трипсина и в усилении трипсином антикоа-гулянтного действия иммобилизованного гепарина. Последнее было продемонстрировано в работе [69] при исследовании [c.261]

Глюкозооксидазу (в чистом виде или в смеси с каталазой) иммобилизуют на платине, пористом графите или золоте. Такая система дает непосредственный потенциометрический сигнал в растворах глюкозы при pH 7,4. Методика приготовления может быть, например, следующей. В буферном растворе фосфата натрия (pH 7,4) смешивают каталазу, лиофилизованную глюкозооксидазу из А. тдег, бычий сывороточный альбумин и глутаровый альдегид. Смесь выливают в формочку, в которой находится диск из платиновой фольги толщиной 0,05 мм. Толщину поперечно-сшптой фермент-альбуминовой матрицы можно менять с помощью прокладок на дне формы, например от 0,05 до 0,32 см. При комнатной температуре сшивка белков глутаровым альдегидом длится 2 ч. Перед проверкой ферментативной активности или потенциометрическими измерениями сшитый глутаровым альдегидом слой отмывают буферным раствором в течение 1-2 дней, чтобы удалить слабосвязанный фермент [11]. [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология