Определение аминокислот в белках и в белковых гидролизатах

Определение аминокислот в белках и белковых гидролизатах [c.30]

Аминокислотный состав белков. — Анализ гидролизата белков, содержащего до двадцати различных аминокислот (см. табл. 39), является чрезвычайно сложной задачей. Риттенберг (1940) разработал метод изотопного разбавления, согласно которому радиоактивную кислоту определенной удельной активности, например меченую глутаминовую кислоту, добавляют в известном количестве к анализируемой смеси, после чего выделяют глутаминовую кислоту обычным образом. Так как химические свойства природной и меченой кислоты одинаковы, то выделяемое вещество является смесью добавленной аминокислоты и первоначально присутствовавшей в пробе. Количество кислоты в гидролизате вычисляют по изотопному составу выделенной кислоты. Если добавляется рацемическая меченая кислота, то аминокислоты гидролизата перед выделением рацемизуют или же из выделенного рацемата отделяют чистую -форму. Точность анализа не зависит от метода выделения, выхода кислоты или концентрации ее в гидролизате. [c.655]

Количественное определение аминокислот. Для оценки количественного содержания аминокислот в исследуемом образце белка наряду с гидролизатом в отдельные точки хроматограммы наносят растворы аминокислот- свидетелей . Стандартные растворы аминокислот наносят в несколько (4—6) точек хроматограммы из расчета 0,01 — [c.136]

Аминокислотный анализ существенно способствовал бурному развитию химин белка. Главными областями применения аминокислотного анализа (наряду с идентификацией отдельных аминокислот) являются установление аминокислотного состава белковых гидролизатов, определение первичной структуры белков, а также аналитический контроль пептидного синтеза. [c.55]

Общая стратегия определения первичной структуры белка включает несколько этапов. Необходимо (а) провести количественный анализ гидролизата для того, чтобы определить мольное соотнощение имеющихся аминокислот (см. разд. 23.3.2) (б) определить молекулярную массу с помощью подходящего физического метода для того, чтобы вычислить количество всех присутствующих аминокислотных остатков [I—3] (в) определить количество входящих в молекулу полипептидных цепей либо с помощью хроматографического или электрофоретического разделения, либо посредством количественного анализа остатков, содержащих аминогруппу (JV-конец) и карбоксильную группу (С-конец) (см. разд. 23.3.4) [c.256]

Химические реакции для открытия и определения аминокислот в гидролизатах белков. В курсе органической химии подробно рассмотрено множество химических реакций, характерных для а-амино- и а-карбоксильных групп аминокислот (ацилирование, алкилирование, нитрование, этерификация [c.40]

Триптофан обычно определяют в белках, которые пе подвергались гидролизу [165, 186]. Однако в последнее время были сделаны попеки стабилизации его молекулы, а также молекулы тирозина, цистеина и метионина при помощи реакции восстановления, которой предшествовала реакция десульфурации [92]. Кроме того, был разработан количественный метод колориметрического определения аминокислот в гидролизатах, полученных при действии селенитов щелочных металлов [56]. [c.392]

Аминокислотный состав белков растений изучался в течение нескольких десятилетий. До последнего времени для этой цели применялись обычные методы аналитической химии. Однако определение аминокислот в гидролизатах белков обычными химическими методами очень сложно и громоздко, и для количественного определения всех аминокислот в одном только образце белкового препарата обычно требуется не менее 100 г белка и несколько месяцев кропотливой работы научного сотрудника. При такой сложности и дороговизне химических методов исследователи очень редко ставили своей задачей установить содержание всех аминокислот в белке и чаще ограничивались определением лишь главных аминокислот. [c.216]

Впервые общий метод определения аминокислот в гидролизатах белков был предложен Э. Фишером. В настоящее время разработаны весьма совершенные методы анализа продуктов гидролиза белка, позволяющие с большой точностью определять качественно и количественно содержание отдельных аминокислот в тех или иных белковых веществах после их гидролиза. Эти методы основаны главным образом или на осаждении отдельных аминокислот специфическими реактивами, или на образовании с последними характерной окраски. [c.33]

Гидролиз белков кислотой обычно сопровождается разрушением (в результате окисления) большей части триптофана, окислением цистеина в цистин и некоторым распадом серина и треонина. Щелочной гидролиз имеет то преимущество перед кислотным, что триптофан в этих условиях более стабилен. Однако при щелочном гидролизе имеет место интенсивный распад серина, треонина, цистина, цистеина и аргинина. Кроме того, при щелочном гидролизе наблюдается рацемизация природных аминокислот. Гидролиз белка как кислотой, так и щелочью сопровождается дезамидированием глутамина и аспарагина. Эти амиды аминокислот и триптофан можно выделить из гидролизатов, полученных при помощи протеолитических ферментов. Однако ферментативный метод также страдает определенными недостатками в частности, гидролиз может быть неполным и сам фермент может распадаться с освобождением аминокислот. Выделение аминокислот из белков и получение их с количественным выходом представляет очень сложную задачу, которой занимались многие исследователи. Эта обширная область всесторонне рассмотрена в монографии Блока и Боллинг [98]. [c.24]

Для определения аминокислотного состава белка применяют различные физико-химические методы, например распределительную хроматографию и ионообменную хроматографию. Распределительная хроматография на бумаге имеет преобладающее значение. Длительное и сложное определение аминокислотного состава гидролизатов сейчас автоматизировано по графику на ленте автомата находят абсолютное содержание аминокислот. [c.277]

Аминокислотный состав белка устанавливают методом его гидролиза кислотами, щелочами или ферментами. Широко применяется кислотный гидролиз (80% -ная серная или 20% -ная соляная кислота), протекающий наиболее полно. Для определения аминокислотного состава белка применяют различные физико-химические методы, например распределительную хроматографию и ионообменную хроматографию. Распределительная хроматография на бумаге имеет преобладающее значение. Длительное и сложное определение аминокислотного состава гидролизатов сейчас автоматизировано по графику на ленте автомата находят абсолютное содержание аминокислот. [c.278]

В последние годы достигнуты большие успехи в технике определения аминокислотного состава белка. Сконструированы автоматические аппараты, которые через 12 ч после введения в них гидролизата белка дают ответ о качественном и количественном содержании в данном белке различных аминокислот. [c.269]

Современные методы количественного определения аминокислот в гидролизате (особенно метод хроматографии) позволили достаточно полно изучить аминокислотный состав разнообразных белков. В настоящее время описано более 40 аминокислот, найденных в природе. Но не все они являются обязательными и постоянными частями белковой молекулы. Наиболее распространенных аминокислот насчитывается 23. Аминокислотный состав белков далеко не одинаков. [c.338]

Для определения аминокислот в гидролизатах успешно применяется и метод разбавления изотопной метки. К гидролизату белка добавляется определенное количество меченого препарата какой-либо аминокислоты, например, глицина С . Затем глицин выделяют и сравнивают его радиоактивность с радиоактивностью добавленного препарата. По степени разбавления изотопной метки рассчитывают количество глицина в гидролизате. Метод не требует полного выделения аминокислоты в этом его достоинство. [c.42]

При перегонке происходят большие потери, вследствие чего этот способ не может служить количественным методом определения аминокислот. Следует, однако, указать, что при помощи именно этого метода удалось установить наличие в белках пептидных связей и определить аминокислотный состав белков. Трудности, связанные с перегонкой эфиров аминокислот, принудили искать другие, более простые методы разделения аминокислот. Ценные результаты были получены при помощи фракционного экстрагирования аминокислот из гидролизата бутанолом [32]. [c.28]

НОСТИ цветных реакций. Эти попытки, однако, не имели достаточного основания, поскольку окраска, получаемая с белками, как правило, слабее окраски, получаемой с соответствующими белковыми гидролизатами. Это обусловлено, по всей вероятности, тем, что в белковой молекуле некоторые реактивные группы скрыты внутри глобулы и вследствие этого недоступны действию окрашивающего реагента (см. гл. VII). Поэтому для определения аминокислотного состава белка необходимо подвергнуть его полному гидролизу. Большинство аминокислот можно определить в кислотном гидролизате, однако некоторые аминокислоты обнаруживаются только после гидролиза белка гидроокисью бария (см. выше). Разделение смеси аминокислот представляет собой трудную задачу, так как аминокислоты являются амфолитами, растворимыми в воде и нерастворимыми в таких органических растворах, как спирт. Только иминокислоты пролин и оксипролин раство римы в этиловом спирте. Ввиду того что аминокислоты обладают сходными физико-химическими свойствами, их нельзя разделить фракционированием спиртом или нейтральными солями. Некоторые аминокислоты можно, однако, отделить путем осаждения их при соответствующих условиях. Например, растворимость цистина при нейтральной реакции и тирозина при слегка кислой реакции настолько мала, что при доведении реакции среды до соответствующего значения pH они почти полностью выпадают в осадок. Другие аминокислоты можно осадить специфическими реактивами. Однако ни один из этих методов не является полностью удовлетворительным в количественном отношении, так как все соответствующие осадки до известной степени растворимы. [c.31]

Особенно плодотворно изотопы применяются для исследования обмена веществ. Изучаемое вещество метят (поэтому метод получил название метод меченых атомов ), вводя в него радиоактивный изотоп меченое вещество вводят в организм. После его ассимиляции исследуют присутствие меченых атомов в различных химических фракциях в организме. Концентрация вводимого в организм радиоактивного изотопа должна быть небольшой, чтобы не нарушался обмен веществ, но такой, при которой, несмотря на разведение, изотоп мог бы быть обнаружен во всех выделяемых фракциях. Например, применение СОг с меченым углеродом позволило показать широкое участие двуокиси углерода в реакциях метаболизма бактерий и тканей живого организма, расширить наши представления о механизме фотосинтеза. Изотопный метод применяется в биохимии для количественного определения аминокислот в гидролизатах белков, содержания калия, натрия и других элементов в крови, для определения общего количества воды в живом организме, объема эритроцитов и плазмы в кровотоке и т. д. [c.12]

На современной стадии развития анализа весьма желательно, чтобы анализ белковых гидролизатов в каждом случае контролировался повторением всей методики анализа на искусственной смеси аминокислот, возможно ближе повторяющей состав гидролизата. Затем, если необходимо, может быть сделано последующее приближение. Применение таких смесей в значительной мере предохраняет от неудовлетворительных результатов, которые часто получают при простом приложении к гидролизату одного белка такой методики анализа, которая может дать удовлетворительные результаты с гидролизатом белка другого состава. Часто принимается, что определение 100% аминокислоты, добавленной к гидролизату, доказывает точность метода. Эта экстраполяция, однако, нё всегда оправдана. [c.62]

Нужно помнить, что методы определения аминокислот в белковых гидролизатах далеко не идеальны. Во время самого гидролиза при освобождении аминокислот происходят изменения разной глубины. Кроме того, в случае важных для питания белков, особенно растительного происхождения, следует помнить, что мог т иметь место большие колебания в составе в зависимости от вида растения или животного. Подобно тому как при псшощи отбора и культивирования можно изменить содержание витаминов и минеральных составных частей растения, так же можно, вероятно, изменять и аминокислотный состав белк( в в нем. Придет время, когда будут специально выращивать определенные растения из-за содержащихся в них незаменимых аминокислот, точно так же как сейчас их выводят из-за содержащихся в них витаминов. [c.366]

Определение аминокислот в белковых гидролизатах сопряжено с боль-иJими трудностями. Единого общепринятого метода количественного определения всех отдельных аминокислот, входян их в состав данного белка и получаемых в гидролизате в виде смеси, не существует. Методы их определения основаны иа различных принципах. [c.315]

Количественное определение аминокислот методом элюции и последующим фотоколориметрированием [105, 106]. С помощью этого метода можно определять в растворе или гидролизате белка 0,05—0,15 мкг аминокислоты. Метод основан на реакции аминокислот с нингидрином в слабокислой среде с последующим превращением полученного в результате реакции синего производного — дикетогидринделидендикетогидриндиамина (ДИДА) в стабильное производное меди оранжево-красного цвета, имеющее максимум поглощения при 530 ммк. [c.117]

N-Koнцe вoй лизин дает а,е- бис-динитрофенильиое производное лизин, расположенный в середине цепи или на С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди- и трипептидов анализом концевых групп. Если в гидролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [c.690]

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 г. С. Муром и У. Стейном. Принципиальная схема анализатора приведена на рисунке 4. [c.35]

В химии аминокислот используется много других аналитических способов. Определение азота по Къелъдалю дает содержание всего азота в белке или белковом гидролизате. При. этом определении органическое соединение разлагается путем, нагревания со смесью концентрированной серной кислоты и катализаторов, таких, как двуокись селена. Образующиеся аммонийные соли превращаются в аммиак, который отгоняют и титруют. Общее содержание азота заметно меняется в зависимости от характера аминокислот в белке. Количество азота, присутствующего в виде первичных аминогрупп, определяется по методу Ван-Слайка. Неизвестное вещество обрабатывают азотистой кислотой и измеряют объем выделяющегося азота. [c.539]

Никогда не будет лишним подчеркивать влияние гидролиза на количество аминокислоты, найденное в гидролизате. Так, Рош и Блан-Жан [551], которые пользовались ины.м. методом для определения аргинина, чем Хантер и Дофинэ [313], подтверждают наблюдение последних о том, что количество аргинина падает с увеличением времени гидролиза белка. Применяя метод Сака-гучи-Дюмазера, они установили [551], что при 24-часовом гидролизе белка соляной кислотой теряется от 15 до 35% общего количества гуанидинных групп. [c.54]

Существует значительный разрыв между числом статей, описывающих газохроматографические методы, и числом работ, посвященных приложению этих методов. Качественные анализы или же анализы, ограничивающиеся измерением лишь нескольких аминокислот пептидных или белковых гидролизатов . были выполнены уже давно [25, 69, 88, 147]. Наиболее полными являются данные Герке проведенное им газохроматографическое определение аминокислот в гидролизатах бычьего сывороточного альбумина, каппа казеина, белка бобов [41] и рибонукле-азы [43] прекрасно согласуется с результатами, полученными на ионообменниках. В табл. 5, 6 и 7 приведены некоторые экспериментальные данные, полученные ГХ н-пропиловых эфиров ацетиламинокислот из нескольких пептидных гидролизатов. Для гидролизатов фибриноиептидов те же молярные соотношения (табл. 6) найдены на ионообменниках [62]. С помощью ГХ контролировался синтез брадикинина (табл. 7). [c.130]

В отличие от других цветных реакций на белки биуретовую реакцию дают все без исключения белковые вещества, так как биуретовая реакция не является реакцией на те или иные отдельные аминокислоты. Ни одна аминокислота (за исключением гистидина, серина и треонина, которые в достаточно концентрированных растворах обусловливают появление сходного окрашивания) не дает положительной биуретовой реакции. Именно поэтому после достаточно продолжительного гид ролиза разбавленный гидролизат белка, состоящий из смеси аминокислот, не дает уже положительной биуретовой пробы. Биу]эетовой пробой можно, таким образом, пользоваться для установления конца гидролиза. В связи с этим биуретовая реаки,ия лежит в основе метода приближенного количественного определения малых количеств белка в разбавленных растворах, [c.37]

Г. выделяют из гидролизатов белков (желатины, фиброина шелка) его можно синтезировать общими способами получения аминокислот, напр, из монохлоруксусной К ТЫ и NH3. Б организме Г. синтезируется из глиоксиловой к-ты путем переа.мипировапия и частично из р-огсси-а-аминокислот. Г. примепяют в качестве исходного вещества в ряде синтезов, для нолучения буферных р-ров, как стандарт ири колориметрич. определении аминокислот и для колич. определения Сн и Ag. [c.488]

Нет сомнения в том, что из гидролизатов белков могут быть получены высокоочищенные Ь-аминокислоты. Тем не менее продажные препараты аминокислот зачастую загрязнены аминокислотными примесями, которые могут быть источником экспериментальных ошибок. В связи с этим микробиологи при приготовлении сред для определения аминокислот посредством бактерий нередко предпочитают применять синтетические ВЬ-аминокислоты, а не Ь-изомеры, выделенные из белковых гидролизатов. Можно привести следующие примеры часто встречающихся загрязнений в полученных из белков препаратах лейцина и глутаминовой кислоты часто содержатся метионин, а в препаратах глутамина — аргинин и аспарагин препараты триптофана бывают загрязнены тирозином, а препараты тирозина — цистином. Выделенный из гидролизатов изолейцин обычно содержит лейцин, и наоборот. Развитие современных хроматографических методов в значительной степени упростило задачу выделения аминокислот, и повсеместное применение этих методов, несомненно, улучшит качество продажных препаратов аминокислот. [c.91]

Некоторые из этих аминов очень ядовиты, как например тирамин> образующийся из тирозина (стр. 300), или гистамин — из гистидина (стр. 346). Интересно, что некоторые декарбоксилазы отличаются резкой специфичностью действия и способны декарбоксили-ровать только одну какую-нибудь аминокислоту. Так, например, аспартикодекарбоксилаза, выделяемая My oba terium nsp декар-боксилирует только /-аспарагиновую кислоту. Эта особенность микробов может быть использована как для препаративного получения некоторых биологически важных аминов из гидролизатов соответствующих белков, так и для количественного определения аминокислот по измерению количества выделившегося СО2. Метод определения аминокислот с помощью препаратов специфических декарбоксилаз при наличии соответствующей аппаратуры очень прост, отнимает мало времени, а главное, позволяет определять процентное содержание отдельных аминокислот, без предварительного выделения их из сложной смеси. [c.248]

Хартел и Плеймикерс [112] использовали бумагу с четвертичными азотными группами для количественного определения цистеиновой кислоты в гидролизате белков. В восходящем методе хроматографии проявляли 0,34 М хлоруксусной кислотой. После проявления высушенную бумагу обрабатывали нингидрином для обнаружения красных пятен и с помощью денситометра определяли количество цистеиновой кислоты в пятне. По мнению авторов, ни одна из аминокислот, найденных в белке, не перекрывалась с цистеиновой кислотой. Точность метода была проверена авторами на шестнадцати определениях этой кислоты в гидролизате 1 г шерсти. Средние значения составили 1,25% при относительной средней ошибке 3%. [c.323]

Определяли содержание обш его азота, а также его белковой и небелковой форм, состав и содержание свободных и свя.чан-ных аминокислот. Для этого из навески сухого растительного материала (1 г) проводили экстракцию небелковых форм азота после осаждения белков 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Свободные аминокислоты определяли во фракции небелкового азота, а аминокислотный состав белков — в кислотном гидролизате фракции белкового азота [3]. Идентификация и количественное определение аминокислот проведены на автоматическом анализаторе НД-1200Е. Ошибка определения на приборе 2,0%. Расчеты аминокислотного состава — на электронно-вычислительной машине Минск-22 [4]. Все определения проведены в двухкратной повторности. [c.89]

Физиологически ценные -формы аминокислот получают в промышленном масштабе путем кислотного или щелочного гидролиза природных белков. Наиболее приемлемым сырьем для данного процесса являются отходы различных производств, в том числе непищевых (например, кератинсодержащие отходы). Этот метод не лишен недостатков высокая стоимость процесса гидролиза, сложность выделения определенной аминокислоты из смеси многих аминокислот гидролизата, неизбежное разрушение части аминокислот в процессе гидролиза и ограниченность сырьевых ресурсов. Но все же этот способ позволяет утилизировать в полезный продукт отходы непищевого сырья, а в некоторых случаях (например, для получения парентерального питания) является единственно возможным. [c.7]

Одним из основных методов анализа белковых составляющих углевод-белковых (комплексов является кислотный гидролиз и количественное определение аминокислот. Однако следует иметь в виду легкое образование интеноивно окрашенного гумина при наличии углеводов в гидролизате аминокислот (см. кн. I). Присутствие в пидролизате гексозаминов может осложнить аминокислотный анализ, поскольку о.ни проявляются нингидрино М и элюируются аналогично аминокислотам. Ы- и С-Концевые остатки определяются так же, ак для обычных белков (см. кн. I). [c.72]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология