Фракционирование на колонке по структуре

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Фракционирование смеси олигосахаридов на колонках позволяет выделять вещества в количествах, достаточных для дальнейшей, более точной их идентификации, определения состава, свойств и установления структуры. Выделенные олигосахариды характеризуются по величине [а]в, температуре плавления или температуре плавления их производных. [c.126]

Одним из наиболее сложных вопросов химии полимеров является фракционирование и анализ ММР гомополимеров и сополимеров олефинов. Эти полимеры растворимы при достаточно высоких (выше 100 °С) температурах, а интерпретация данных ГПХ для них обычно осложняется особенностями их структуры, такими, как разветвленность цепей (ответвления могут быть как длинно-, так и короткоцепочечными), гетерогенность и кристалличность. Следовательно, вполне естественно, что со времени создания ГПХ появилось множество работ по применению этого перспективного метода в столь трудной области. В настоящее время точно установлено, что насадку из стирогеля можно использовать при температурах значительно выше 100 °С при условии, что растворитель непрерывно насыщается инертным газом и содержит достаточное количество антиоксиданта для предотвращения деструкции образцов и колонки. Тем не менее всегда наблюдается определенное снижение эффективности колонки, и время от времени необходимо проводить ее повторную калибровку. Некоторые исследователи предпочитают для ГПХ при высоких температурах использовать в качестве насадки пористое стекло или силикагель, однако в большинстве работ обычно используют гранулы сополимера стирола с дивинилбензолом.. [c.288]

Распространение метода ГПХ в область синтетических полимеров происходило довольно медленно, так как для этих целей необходимы гели с особой структурой. Но этот процесс стимулировался рядом преимуществ, метода. Представляя собой разновидность метода хроматографии на колонке, метод ГПХ очень удобен и гибок. Метод ГПХ можно различными способами, видоизменить так, чтобы он удовлетворял почти любым требованиям, таким, как отсутствие кислорода в системе, варьирование масштабов фракционирования, автоматизация процесса. В связи с многократностью использования гелей метод ГПХ относительно дешев. Относительно невелик также объем жидкости, идущей на фракционирование. Наконец, разделение с помощью метода ГПХ осуществляется быстро например, аналитическое фракционирование можно провести в течение 10 мин, препаративное — всего за 6 час. Еще до того, как закончится полностью фракционирование одного образца, колонка готова для проведения следующего фракционирования. Следовательно, можно проводить полунепрерывное фракционирование в течение нескольких недель автоматически [8, 11]. Недавно было описано (разд. 1,В), вероятно, наиболее важное приложение метода ГПХ, на основе которого распределение по молекулярным весам в природных и синтетиче- [c.111]

Главная особенность конструкции системы для гель-проникающей хроматографии заключается в относительно небольшом объеме элюирующей жидкости, в пределах которого происходит полное разделение. В тех случаях, когда фракционированию подвергается полимер, образец обладает весьма широкой областью распределения по молекулярным весам, распределение при этом непрерывное, но не обязательно простое. Как было показано, моншо приготовить гели, у которых размеры внутренних структур будут изменяться в пределах, достаточно широких для целей разделения молекул во всем диапазоне их размеров. Но степень разделения будет нри этом небольшой. Если распределения фракционируемых образцов по молекулярным весам имеют характерные свойства или асимметричны, то для того, чтобы выявить эти особенности, потребуется колонка с высокой разрешающей способностью, большим числом теоретических тарелок. Способность разделить компоненты полимерного образца определяется конструкцией и условиями работы заполненной гелем колонки. Более удачные конструктивные решения дают больше возможностей варьирования рабочих параметров колонки, например времени элюирования данного образца. [c.142]

Фракционная экстракция полимеров колоночным методом также сложна. Известны два типа экстракции на колонке разделение градиентным элюированием при заданной температуре растворителями с постепенно повышающейся элюирующей способностью или фракционирование заданным растворителем с постепенным повышением температуры. Как показано в работе [230], с помощью колоночных методов градиентного элюирования при температуре, достаточно близкой к температуре плавления полимера (150°С), разделение фракций происходит только по молекулярным массам, тогда как фракционирование при повышающейся температуре приводит в основном к разделению полимера в соответствии с геометрической конфигурацией. С другой стороны, при фракционном экстрагировании в аппарате Сокслета кипящими растворителями с возрастающими температурами кипения разделение, по-видимому, происходит в соответствии с геометрической структурой. [c.77]

В промышленных масштабах выпускают самый распространенный сорбент - силикагель. Внедрение методов тонкой очистки и фракционирования позволило получить силикагель с высокой степенью чистоты, механической прочностью частиц, однородной структурой пор, узким фракционным составом. В ряде случаев проводят его модификацию органическими радикалами. Потребность в сорбенте указанного качества для изготовления хроматографических колонок аналити ес-58 [c.58]

Наиболее полное освещение всех имеющихся в настоящее время методов фракционирования полимеров приведено в недавно опубликованных трех обзорных статьях [7—9], посвященных этому вопросу. Из пятнадцати методов, описанных в статье Холла [7], в данной главе рассматриваются только два элюирование на колонке и элюирование на колонке в условиях градиента температуры. Оба эти метода относятся к методам фракционирования полимера из раствора. Первый представляет собой однократную экстракцию, в то время как второй сочетает в себе многократную экстракцию и осаждение, происходящие по всей длине колонки. Оба метода оказались чрезвычайно удобны особенно для фракционирования полиолефинов вследствие возможности их автоматизации. В этой главе в основном рассматриваются результаты, полученные при фракционировании полиолефинов. Однако указаны также некоторые данные по фракционированию других полимеров или приведены ссылки на эти данные. Кроме того, в главу включен раздел, в котором описывается метод разделения полимеров по структуре. [c.361]

Фракционирование на колонке позволяет проводить разделение полиолефинов по структуре па основе различия в степени разветвленности или микротактичности. Применяющаяся для этого колонка аналогична колонке, используемой для фракционирования по молекулярным весам. Опубликованы только некоторые данные, которые тем не менее свидетельствуют о перспективности этого метода. [c.375]

Уникальный метод разделения описан Натта с сотр. [26] он заключается в использовании активного носителя в колонке. Было проведено разделение стереоблочного полипропилена по структуре, а не по молекулярному весу. В качестве носителя использовали высококристаллический полипропилен, применявшийся в виде гранул или нанесенный на аморфный силикагель. Растворителем служил изопропиловый эфир при температуре 30—52°. Авторы установили, что разделение основывалось на различии в структуре полимера. Данные о результатах по фракционированию стереоблочного полипропилена ([т)] 0,541, плотность 0,877 г см , степень кристалличности 22%) приведены в табл. 27. Активный носитель был использован Натта с сотр. [27 ] и при фрак- [c.376]

Очистка и фракционирование длинных олигонуклеотидов (до 17 остатков) методом ионообменной ЖХВД требует принятия мер, предотвращающих образование локальных вторичных структур за счет комплементарных участков. Для этой цели было предложено вести элюцию с колонки Partisil 10-SAX линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (О—0,3 М), pH 6, в 30%-ном (а в некоторых случаях 60%-ном) растворе формамида при комнатной температуре [Newton et al., 1983]. [c.322]

Раствор, содержащий смесь двух и более веществ, отличающихся по размеру молекул, а следовательно, и по молекулярной массе, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. На этом принципе основаны методы фракционирования белков и других полимеров, их обессо-ливание, определение молекулярной массы, замена одних буферных растворов другими и др. [c.106]

Разновидностью метода фракционирования на колонке является гель-хроматография [86]. В качестве разделительного вещества применяют органические или неорганические вещества (например, силикагель) пористой структуры с размером пор, зависящим от плотности сшивок и условий получения. Для фракционирования полимеров, растворимых в воде, чаще всего применяют набухший в воде декстран с различной степенью сшивания (сефадекс). Для растворов полимеров в органических растворителях применяют сшитые полистиролы или сополимеры метилметакрилата с этилен-гликольдиметакрилатом. Образец полимера растворяют, заливают в колонку и элюируют, используя тот же самый растворитель. Небольшие молекулы полимера свободно диффундируют внутрь геля. Размеры некоторых молекул оказываются настолько большими, что им не удается проникнуть внутрь пор, в результате чего они первыми выходят из колонки при элюировании. Продолжительность элюирования фракций возрастает с уменьшением размера макромолекул. Существует критическое значение молекулярной массы, ниже которого макромолекулы полимера могут проникать в поры сетки и поэтому могут быть разделены. Молекулы большего размера уже не могут быть разделены, так как они не могут диффундировать в гель. Частота сетки геля и критическое значение молекулярной массы связаны между собой простой зависимостью чем чаще сетка, тем меньше критическое значение молекулярной массы. [c.83]

Хорвитц и Блумквист [13] выполнили детальное и весьма тщательное сравнительное исследование сухой и суспензионной методик подготовки колонок при приготовлении высокоэффективных колонок с силанизированным фракционированным целитом, на который нанесена ди-(2-этилгексил)фосфорная кислота. Они показали, что на колонках, заполненных целитом с размером зерен 50 мкм при неравномерной его упаковке, получаются весьма широкие зоны. Рабочие характеристики колонок существенно улучшаются при применении суспензионного метода. Детально изучены [14] устойчивость структуры набивки и рабочих характеристик колонки при ее эксплуатации. [c.80]

Фракционирование смесей путем селективного комплексообразования можно легко осуществить хроматографическими методами. В газо-жидкостной хроматографии одним из наиболее известных способов разделения и анализа смесей ненасыщенных углеводородов является хроматографирование на колонках с растворами нитрата серебра в качестве неподвижной фазы. Для приготовления этих растворов обычно применяют этиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоль и бензилцианид. Опубликованы результаты подробного изучения времени удерживания ненасыщенных и ароматических углеводородов [8]. Как и можно было ожидать, время удерживания ароматических соединений значительно короче, чем ненасыщенных, поскольку ароматические соединения образуют менее прочные комплексы по сравнению с алкенами и алкинами. Смеси ароматических углеводородов удобно разделять методами жидкостной хроматографии на колонках с окисью алюминия в качестве неподвижной фазы. Можно предположить, что время удерживания углеводородов в этом случае, как и для колонок с нитратом серебра, определяется их способностью связываться в комплекс с неподвижной фазой, играющей роль акцептора. Опыт подтверждает это предположение, так как окись алюминия все прочнее адсорбирует углеводороды по мере того, как они становятся более плоскими по структуре и обогащаются я-электронами [9а]. Другие комп-лексообразователи, особенно 2,4, 7-тринитрофлуоренон и пикриновая кислота, нанесенные на силикагель, также довольно ус-пещно используются для разделения смесей ароматических веществ [96]. [c.155]

Гели (гидроокиси алюминия, фосфата кальция), используемые для адсорбции, при фракционировании на колонках малопригодны. Здесь необходимы иные материалы. Так, применяют одну из форм фосфата кальция — гидроксилапатит, имеющий характерную микрокристаллическую структуру. Формула гидро-ксилапатита as (ОН) (Р04)з. Его иногда смешивают с инертными материалами — целлюлозным порошком, селитом, инфузорной землей, чтобы ускорить протекание жидкости черев колонку. Однако необходимости в этом нет, ибо гидроксилапатит можно приготовить в форме достаточно крупных кристаллов, через которые жидкость проходит свободно, без повышения давления. В колонки помещают также силикагель, инфузорную землю, крахмал или боксит. [c.150]

Пористые материалы широко используются для фракционирования смесей по молекулярному весу компонентов. Примером тому служит ультрафильтрация — продавливание раствора через мембрану, способную пропускать лишь молекулы небольших размеров и препятствующую фильтрации макромолекул. Аналогичный принцип был использован при электроосмотической миграции веществ через гели [18]. Противоположное явление — прохождение молекул больших размеров и удерживание молекул меньших размеров ( обратные сита ) — наблюдалось при фильтрации растворов электролитов через колонку, содержащую ионообменную смолу. Это явление основано на способности ионов малых размеров проникать в сетчатую структуру ионита и сорбироваться там в то время, когда ионы больших размеров проходят через колонку без задержки. Применение сильносшитых малопористых смол позволяет отделять ионы металлов от органических оснований. На несколько более набухающих смолах осуществимо разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных полипептидов, на сильнонабухающих ионообменных смолах достигается разделение белков по молекулярным весам [19]. [c.201]

Для иллюстрации проведенного выше рассмотрения можно привести некоторые примеры. Каваи и Келлер [51] исследовали явление фракционирования в процессе осаждения в виде кристаллов линейного полиэтилена из разбавленного раствора. Как и следовало ожидать, при этом происходило крайне недостаточное разделение молекул полимера но молекулярным весам. Вийджа с сотр. [52] фракционировал полипропилен по молекулярным весам с помощью фракции керосина (хороший растворитель) и бутилкарбитола (плохой растворитель) при 150°, когда, очевидно, преобладало разделение на две жидкие фазы. Эти же авторы фракционировали полипропилен по степени тактичности, используя керосин при изменении температуры в области 30—145°. В этом случае, по-видимому, происходило преимущественное разделение жидкой и кристаллической фаз. Хоукинс и Смит [53] провели грубое фракционирование полиэтилена но структуре молекул в ксилоле (хороший растворитель) при изменении температуры от 57 до 104°. Мендельсон [54] рассмотрел условия избирательного нанесения полипропи.чена на насадку в соответствии с молекулярными весами компонентов образца при фракционировании на колонке. Он показал, что при нанесении полимера из раствора в хорошем растворителе наблюдался обратный порядок фракционирования, чего не было, если полимер наносили на насадку из раствора в смеси растворителя и осадителя. В этих опытах смесь растворителей должна была действовать как плохой растворитель и нанесение полимера на насадку осуществлялось в процессе разделения двух ншдких фаз, т. е. в соответствии с молекулярными весами. [c.26]

Жесткий гель обладает специфической структурой. Ионообменная смола должна быть жесткой и проницаемой, а также обладать максимальной емкостью в отношении ионов, т. е. наибольшей массой и, следовательно, минимальным количеством разбавителя. В гелях, предназ11аченных для ГПХ, количество разбавителя должно быть значительно большим и вся внутренняя область геля должна быть доступной для молекул растворенного вещества. Мур [157], варьируя количество и состав разбавителя в полистирольных гелях с высокой плотностью поперечных связей, показал, что структуру геля можно было менять в широких пределах. Такие гели производились в виде мелких шариков и обладали достаточной прочностью и жесткостью для того, чтобы фракционирование па заполненных таким гелем колонках можно было проводить при высоких скоростях элюирования. [c.132]

Учитывая на основании предварительных исследований, что сульфиды подвергаются гидродесульфурированню в более мягких условиях по сравнению с сульфоксидами и легко фракционируются, более детализированное представление о строении и типах структур сульфидов было получено при гидродесульфурировании узких фракций сульфидов с последующим микрохроматографическим анализом углеводородов и масс-спектральным анализом исходных фракций сульфидов. Для этого была проведена ректификация суммы сульфидов нефтей Хаудага и Кызыл-Тумщука фракционированием в вакууме на ректификационной колонке эффективностью 19 т. т. Характеристика полученных пятиградусных фракций сульфидов дана в табл. 13, 14. [c.49]

Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно ОЕАЕ-целлюлозу и ОЕАЕ-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только от используемого материала, но также в большой степени от pH и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хроматограммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [c.108]

В настоящее время трудно ответить на вопрос о том, почему фракционирование на ионообменнике сопряжено с разрущением четвертичной структуры НАД-киназы из сердца голубя. Можно высказать лишь предположение, что по аналогии с ферментом яз проростков гороха в процессе ионообменной хроматограф 1и от НАД-киназы отделяется фактор в отсутствие которого последняя утрачивает свойства регуляторной диссоциирующей ферментной системы. Принципиальная возможность регуляции степени ассоциации фермента при помощи специфического фактора показана для 3-фосфоглицераткиназы из ряда объектов [31]. Авторы ра-<боты установили, что молекулярный вес частично очищенного фермента может колебаться от 43 000 до 160000 в зависимости от условий гель-фильтрации через колонки с сефадексом G-100 или G-150, а после фракционирования на ионообменнике ДЭАЭ-сефадексе А-50 фермент утрачивает способность к ассоциации — диссоциации, и независимо от условий гель-фильтрации молекулярный вес его остается неизменным и равным 43000. При этом было замечено, что в процессе ионообменной хроматографии с колонки смывается фракция, содержащая низкомолекулярныи, тер-мостабильный фактор, при добавлении которого к очищенному ферменту с молекулярным весом 43000 последний вновь приобретает утраченную способность образовывать более высокомолеку- [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология