Полиакриламидный гель, диск-электрофорез

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

Определение изоферментов ЛДГ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле основано па различиях в зарядовом состоянии и электрофоретической подвижности молекул разных изоформ белка. [c.271]

В настоящее время, сочетая методы экстракции буферными растворами, хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и диск-электрофореза в полиакриламидном геле, удалось выделить из ткани мозга около 100 различных растворимых белковых фракций. [c.629]

Определение общего содержания белка в муке семядолей мутантов проводили по Барнштейну. Затем методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле исследовали альбумины и глобулины семян, извлеченные 10%-ным раствором поваренной соли из обезжиренной муки. Навеска — 1,0 г. [c.85]

Степень гомогенности полученного препарата анализируют методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (см. лабораторную работу № 20). [c.271]

Изоэлектрическое фокусирование в столбиках полиакриламидного геля. Эта методика очень сходна с описанным Дэвисом [281] диск-электрофорезом, и поэтому для нее пригодны [c.148]

ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ В ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.231]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Рис. 9.1. Система диск-электрофореза в геле. Каждый белковый компонент отделяется в виде диска в трубке с полиакриламидным гелем.

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле [c.235]

Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е. электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного когщентрирования. [c.94]

Исследуют изозимный состав лактатдегидрогеназы в гиалоплазме сердечной и скелетной мышц крысы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. [c.339]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле —методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [c.32]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала ИЛИ при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразньгм даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой поми мо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.). [c.107]

Кристаллизация фермеявляется сложным методом их очистки и применяется для субстанций, проше1Щ1их концентрирование и многоступенчатую очистку [49]. Кристаллическое состояние не является единственным критерием гомогенности ферментного белка, а требует дополтштель-ного подтверждения другими методами (диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, ультрацентрифугированием и др.). Методы и техника кристаллизации подбираются индивидуально для каждого фермента. [c.170]

За последние пять лет преимущество разделения белков при помощи микрометодов получило общее признание. В 1965 г. Гроссбах [1] описал модификацию диск-электрофореза на полиакриламидном геле для определения 10 г количеств белка с помощью стеклянных капилляров. В 1966 г. авторы этой главы предложили микрометод разделения белка в количествах 10 — 10 г при использовании полиакриламидного геля в стеклянных капиллярах, имеющих диаметр 200 мк [2]. В 1967 г. Фельген-хауер [3] описал подобный метод для разделения 10—30 мкг белка с разрешающей способностью 1—3 мкг для одного белка. Гофман [4] для микроэлектрофореза белков вместо стеклянных капилляров применил плексигласовую камеру. [c.277]

Для электрофореза можно использовать один буферный раствор определенного состава ( непрерывный буфер) либо систему из двух буферных растворов ( ступенчатый буфер). В последнем случае собственно разделению образца на компоненты предшествует стадия его концентрирования в виде узкой стартовой зоны на границе раздела буферов (ступенчатый электрофорез). Если разделение проводится в трубках с полиакриламидным гелем, образующиеся зоны имеют форму дисков. В условиях изотахофореза [50] мигрирующие вещества образуют соприкасающиеся друг с другом зоны, которые расположены между лидирующим и замыкающим электролитом. Чтобы эти зоны не соприкасались, в исходную смесь добавляют вещества- разделители (spa ers), которые по своей электрофоретической подвижности занимают промежуточное положение между двумя наиболее близкими по этому параметру компонентами смеси. Таким образом, изотахофорез в опре- [c.28]

Рис. 16.10. Слои геля и поведение ионов при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. А. Образец в геле. Б. Образец, сконцентрированный иа границе раздела между гелем-прокладкой и разделяющим гелем. В. Образец, разделенный на полосы в коиие процесса.

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим. [c.276]

Хорошо известно, что при разделении белков с помощью диск-электрофореза в одной полосе не всегда -содержится только один белок, т. е. разделение сложных смесей может быть неполным. Наиболее эффективный подход предусматривает две стратегии разделения на основе различий в размерах молекул и в значениях р1. Например, образец можно вначале подвергнуть изо-электрическому фокусированию в полиакриламидном геле. Затем гель извлекают из трубки или (если электрофорез проводился на пластине) вырезают узкую полоску геля. Эту полоску помещают у верхнего края новой пластины геля в том месте, где обычно делают канавки для образцов, и закрепляют ее растопленным агаром. Проводят второй этап разделения — гель-электрофорез в присутствии ДСН, после чего гель окрашивают. Пример особенно эффективного разделения белков этим методом описан О Фарреллом [77], которому удалось обнаружить 1000 белков в экстракте клеток Es heri hia oli. [c.278]

Определение молекулярной массы проводили методом диск-электрофореза на основании относительной подвижности белков в зависимости от концентрации полиакриламидного геля [Hedri k, Smith, 1968]. Согласно расчетам по таблице, предложенной Г. А. Бузун [1976], масса исследуемых анионных изопероксидаз была одинаковой для вирозных и контрольных изоэнзимов, так как тангенс угла наклона линии регрессии был совершенно одинаков как в опыте, так и в контроле (рис. 20). На рисунке представлена зависимость относительной подвижности анионных изопероксидаз от концентрации акриламида в гелях. Проведенный расчет показывает, что их молекулярная масса равна 45—46 кДа. [c.87]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Сузуки и др. [1253] предложили использовать электрофорез для выделения белков из любого типа геля после любого способа их фракционирования. Вырезанный участок геля с белковой зоной помещают в стеклянную трубку поверх слоя предварительно заполимеризованного геля, который не доходит на несколько миллиметров до нижнего конца трубки. Этот гель можно приготовить следующим образом. Сначала, как обычно, закрывают дно трубки н в нее до желаемой высоты наливают концентрированный раствор сахарозы или глицерина, на который затем аккуратно наслаивают забуференную смесь компонентов полиакриламидного геля. После полимеризации сахарозу или глицерин удаляют, дно трубми затягивают диализной мембраной, а образовавшееся между ней и гелем пространство заполняют буферным раствором. Такую трубку с находящимися в ее верхней части кусочками геля, содержащего сфокусированную при ИЭФ белковую полосу, устанавливают в аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез в соответствующем буфере. Под действием электрического поля [c.151]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

На практике чаще всего работают либо при постоянном напряжении, либо при ста-билизированном токе. В самом деле, если напряжение остается неиз меиным и сопротивление в кювете падает, то ток должен возрастать. Если же сохраняется на одном уровне ток, то уменьшение сопротивления неизбежно приведет к снижению напряжения. Аналогичные простые выводы на основе закона Ома можно легко сделать в каждом конкретном случае. Решение вопроса о том, удастся ли получить лучшие результаты при поддержании неизменным тока пли напряжения, зависит от выбранного метода электрофореза. Например, электрофорез на бумаге обычно проводят при постоянном напряжении, а диск-электрофорез в полиакриламидном геле —при постоянном токе. Очень простой руководящий принцип, хотя и не всегда верный, заключается в том, что в случае неоднородной буферной системы более высокого разрешения можно достигнуть при стабилизации тока. Вместо с тем если электрическое сопротивление в разделительной камере существенно возрастает во время опыта (как, скажем, при ИЭФ), то лучше прибегнуть к стабилизации напряжения. [c.179]

Проблема другого рода, связанная с фотографированием полиакриламидных гелей после диск-электрофореза, заключается в том, что в этих гелях отдельные полосы расположены очень близко друг к другу. Вместе с тем известно [184], что на фотоснимке соседние полосы различаются только в том случае, если между ними имеется некоторое минимальное расстояние, которое не трудно рассчитать с помощью тригонометрических функций на основе схематического чертежа, приведенного на рис. 73. Если оптическая ось объектива фотоаппарата проходит через середину столбика геля длиной 40 мм и диаметром 5 мм, а сам объектив отстоит от геля на 160 мм, то минимальное расстояние между соседними полосами на концах геля должно составлять не менее 0,625 мм. Зачастую оно оказывается меньше, и тогда две лолосы выглядят на негативе как одна, потому что фотоаппарат не способен отличить верхний край одной полосы от нижнего края другой. Эту трудность можно преодолеть путем перемещения объектива в направлении продольной оси геля, -как это делается в большинстве денситометров. Было предложено и другое решение этой проблемы [184]. Гели помещают в трубку, аккуратно изогнутую таким образом, что ратетояния между объективом и каждой полосой в геле оказываются одинаковыми. [c.198]

Электрофоретическую десорбцию белка с матрицы можно осуществить с использованием модифицированной ячейки Ma ro для электрофореза в полиакриламидном геле (Bir hover Instruments Ltd., Великобритания), устройство которого изображено на рис. И. Полиакриламидный гель (7,5%-ный) должен иметь углубление по центру на верхней поверхности для предотвращения возможной потери матрицы. Диск пористого полипропилена, находящийся на выступе геля, предотвращает взмучивание матрицы, вызываемое высокими скоростями циркуляции буфера (500 мл/мин). Циркуляция буфера в свою очередь предотвращает любые возможные локальные изменения pH. Перед нанесением матрицы гели предварительно подвергают [c.120]

Ait et al. (1977) из фильтрата культуральной жидкости анаэробных бактерий lostridium thermo ellum посредством препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получен частично очищенный целлюлазный комплекс. В аналитическом диск-электрофорезе целлюлаза характеризуется одной белковой полосой с ММ 125 000+ 10000. Однако при электрофорезе в присутствии додецилсульфата целлюлаза диссоциирует по меньшей мере на пять белковых компонентов. Авторы предположили, что целлюлаза существует в виде мультиферментного комплекса. [c.186]

Через определенное время после введения метки зараженные клетки промывают физиологическим раствором, снимают с поверхности культурального сосуда стерильной резиновой палочкой или струей физиологического раствора и осаждают 5 мин при 2000 g или при 10 000 g (в микроцентрифуге) 30 с. Если меченые белки необходимо разделить электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na (см. рис. 6.7), осадок ресуспендируют в буфере для нанесения образцов, объем которого равен исходному объему культуральной среды. Альтернативный, упрощенный метод обработки зараженных клеток состоит в том, что буфер для нанесения образцов добавляют непосредственно к клеточному монослою (не менее 200 мкл раствора на 10 клеток) и далее извлекают лизат из культурального сосуда. Если лизат оказывается очень вязким из-за высокой концентрации ДНК, его обрабатывают ультразвуком или пропускают через тонкую иглу для инъекций. Все вирусоспецифические белки хорошо разделяются в содержащих ДДС-Na 15—17,5%-ных полиакриламидных гелях с помощью диск-электрофореза Лэммли [32]. [c.197]

Описанный метод дает возможность сравнительно простого получения гомогенных, по данным ультрацентрифугирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле, препаратов кислой а-глюкозидазы с выходом около 30%. Благодаря тому что этот метод очистки кислой а-глюкозидазы основан исключительно на специфических свойствах самого фермента (способность расщеплять а-1,6-глюкозидные связи в декстране и конкурентно тормозиться метил-а-Ь-глюкопиранозидом), существенным достоинством его перед другими методами является его универсальность, т. е. применимость для получения высокоочищенных препаратов фермента практически из любого биологического источника. [c.108]

Диск-электрофорез кислой а-глюкозидазы проводят в 7,5% полиакриламидном геле при pH 4,3 с р-аланин-ацетатным электродным буфером (Маурер, 1971) время электрофореза 90 мин при силе тока 4 мА на трубку. После окончания электрофореза столбики полиакриламидного геля быстро извлё1сают из стеклянных трубочек. Часть столбиков геля окрашивают на белок 0,2% раствором кумасси бриллиантового голубого R-250 в 7% растворе уксусной кислоты (можно использовать и другие красители, например амидочерный) другую часть столбиков геля используют для выявления ферментативных активностей кислой а-глюкозидазы методом контактных пленок. Для этого гели полиакриламида помещают в желобки гофрированной пластмассовой [c.110]

Препарат кининогена, полученный из фракции 46, неоднороден по белковому составу, хотя содержание примесей не превышает 25% при диск-электрофорезе (7,5% полиакриламидный гель, трис-глициновый буфер, pH 8,9 Davis, 1964) обнаруживают, помимо кининогена с подвижностью ai-глобулина, белковые фракции в области альбумина, Рз- и аа-глобулинов. [c.177]

Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика использовали препараты фермента, очищенные в 150—300 раз. Тремя независимыми методами электрофорезом в однородном геле и в градиенте концентрации полиакриламидного геля, путем разделения в тонком слое сефадекса С-200, с помощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом С-200 — была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны, характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0, после его элюции и кондентрирования обнаружил несколько белков с более низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07). [c.137]

Вначале в полиакриламидных гелях удавалось выявить лишь часть из 10 реовирусных белков [171, 283]. Совершенствование техники электрофореза, включая применение диск-электрофореза в гр с-глициновой системе, позволило идентифицировать все реовирусные белки [41, 57]. Определены последовательности аминокислот на С- и К-концах некоторых капсидных белков 1220, 244]. [c.276]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология