Выделение мембранных белков

При выделении препарата мембран оценивают количественный выход белка. Метод Лоури (1951) - наиболее распространенный и высокочувствительный метод определения концентрации белка, основанный на измерении интенсивности окраски раствора, зависящей от концентрации белка. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии белка с реактивами, используемыми в определении, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них — биуретовая реакция между пептидными группами и ионами меди. Возникающая сине-фиолетовая окраска обусловлена об- [c.232]

Рис. 7.11. Модель митохондриальной АТР-синтетазы (продольный участок). Протонный ток через мембранный ионофор, так называемая Ро-фракция, способствует синтезу АТР из АВР и Рг (см. рис. 7.10) в головке (Р[) белкового комплекса Р] — белок, который в выделенном состоянии обладает АТРазной активностью. Механизм синтеза еще не выяснен, а функция субъединиц весьма гипотетична [14]. р1 имеет четвертичную структуру азРз-

Каков механизм действия медиатора на постсинаптическую мембрану В случае ацетилхолина он состоит в деполяризации мембраны и увеличении проницаемости по отношению к ионам натрия и калия. Собственно, это, по-видимому, те же изменения мембраны, которые обусловлены возникновением потенциала действия (гл. 5, разд. Б, 3) при проведении нервного импульса. Ацетилхолин связывается со специальным рецептором, в результате чего натриевые каналы в мембране каким-то образом открываются. Из электрических органов электрического угря недавно был выделен белок большого молекулярного веса, обладающий, по полученным данным, свойствами рецептора ацетилхолина [45]. Имея мол. вес 330 ООО, этот белок представляет собой, видимо, тример из субъединиц с мол. весом =110 000, в свою очередь состоящих из 2—4 пептидов с мол. весом 34 ООО—54 ООО. Каким образом функционирует этот рецептор, пока неизвестно (гл. 5, разд. В, 5). [c.332]

Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент. Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом — в счетных камерах или на фиксированных мазках. При этом подсчитываются и живые, и мертвые клетки, к тому же такой подсчет возможен только для достаточно крупных микроорганизмов, не образующих агрегаты. К косвенным методам относятся высевы на твердые питательные среды, осаждение на мембранных фильтрах, определение параметров, пропорционально зависящих от количества клеток (биомасса, высушенная на фильтрах постоянной массы, мутность суспензии, общий азот, белок, поглощение кислорода и выделение углекислоты). Следует помнить, что нет универсального метода, лишенного недостатков. Любой метод имеет свои ограничения. Например, не все клетки способны дать колонии на твердой среде, нет питательной среды, подходящей для всех без исключения микроорганизмов, и т.д. [c.75]

Рибосомы шероховатого ЭР удерживаются на мембране частично благодаря растущим полипептидным цепям, продвигающимся сквозь мембрану по мере своего синтеза (см. ниже). Однако, если образование полипептидных цепей прерывается под действием какого-либо ингибитора (например, пуромицина), то рибосомы все равно остаются связанными с мембраной шероховатых микросом. Это сродство значительно повышается в растворах с низкими концентрациями солей. Если в таких условиях смешать очищенные рибосомы с мембранами шероховатых микросом, предварительно лишенными рибосом, то такие ободранные мембраны вновь приобретают то же количество рибосом, которое было на них после выделения из клеток. Участок связывания с мембраной находится на большой субъединице рибосомы, но до сих пор еще неясно, с каким из многочисленных белков мембраны шероховатого ЭР связывается рибосома. Установлено, однако, что для связывания рибосом с мембраной ЭР в физиологических условиях требуется дополнительное, более специфическое прикрепление, для которого необходим вновь созданный белок, несущий сигнальный пептид. [c.43]

Рис. 9-18. Пространственная модель цитохрома с-переносчика электронов в дыхательной цепи. Это небольшой белок, содержащий немногим более 100 аминокислотных остатков и довольно свободно перемещающийся в мембране (см. рис. 9-31). Атом железа (выделен темной окраской) в составе ковалентно связанного с белком гема (показан розовым цветом) может переносить только один электрон.

Сеть спектрина расположена на некотором расстоянии от мембраны, но с ней связана. Латеральная подвижность интегральных белков мембраны зависит от присутствия спектрина. При обработке тканей химотрипсином был выделен белок с массой 72 кДа, который ингибировал взаимодействие спектрина с обедненной этим белком мембраной. С помощью моноклональных антител показано, что 72 кДа белок принадлежит полосе 2,1 его назвали анке-рином. [c.57]

В случае клеток эукариот техника генетических манипуляций разработана значительно слабее. Здесь больше полагаются на спонтанные мутации, приводящие к какому-либо фенотипическому дефекту. Последний может быть обнаружен непосредственно в полевых исследованиях, в лаборатории или в клинике, иногда в результате систематического поиска, но часто как побочный продукт другой работы. Например, многие мутации, затрагивающие гемоглобин, приводят к анемиям, а последние легко распознаются клинически. В результате известно очень большое число мутантных форм гемоглобина человека, установлены различия в аминокислотной последовательности, а в некоторых случаях поняты причины функциональных изменений. Например, гемоглобин Сидней содержит единственную замену — валин в 67-м положении /3-цепи заменен в нем на аланин. Фенотипическим проявлением такой замены в клинике является гемолитическая анемия. Эритроциты при этом становятся хрупкими и легко разрушаются. Исследования выделенного из них гемоглобина показывают, что гем /3-цепей слабо связан с белком и легко отделяется. Это приводит к двум последствиям. Дефицитный по гему белок становится значительно менее эффективным переносчиком кислорода — как потому, что содержит на два связывающих кислород гема меньше, чем нормальный, так и вследствие изменения формы кривой связывания кислорода, приводящего к менее эффективному освобождению кислорода в капиллярах. Кроме того, отделяющийся гем вреден он, по-видимому, взаимодействует с клеточной мембраной эритроцита, что каким-то образом увеличивает ломкость последнего. Непрочности связывания гема с гемоглобином Сидней можно дать простое объяснение на молекулярном уровне. В нормальном гемоглобине валин способствует образова- [c.39]

Рецепторы исследуются на трех уровнях в интактной ткани или в отдельных интактных клетках, в суспензиях мембран, полученных из этой ткани, и на молекулах, выделенных из нее. Считается, что биохимические исследования отражают физиологические свойства, если на всех уровнях получены согласующиеся результаты. Биохимические исследования рецепторных молекул увенчивались успехом только тогда, когда удавалось отделить эти молекулы от окружающих мембранных компонентов с сохранением присущих свойств. Наиболее полезными инструментами при таких исследованиях являются неионные детергенты, типа, например, тритона Х-100, эмульфогена или бриджа. Они солюбилизируют мембрану, но стабилизируют гидрофобный мембранный белок в воде и благодаря своим амфо-фильньш свойствам заменяют липиды на белковой поверхности. Тем самым они предотвращают агрегацию и осаждение белка и позволяют избежать денатурации, которая всегда происходит при применении ионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) (гл. 3). [c.242]

Противоречивые данные получены также при исследовании избирательности связывания белков с различными фосфолипидами. Так, селективность взаимодействия фосфолипидов, несущих определенные полярные группы, была выявлена для родопсина, На+, К -АТФазы из 8диа1из a antus, цитохром-с-оксидазы, Са +-АТФазы. Вместе с тем многочисленные эксперименты по реактивации выделенных мембранных ферментов путем добавления экзогенных липидов и детергентов показали, что в большинстве случаев не существует специфических белок-липидных взаимодействий, обеспечивающих ферментативную активность разные типы липидов могут одинаково влиять на функционирование мембраносвязанных белков. Несмотря на то, что взаимодействие липидов с интегральными белками носит в основном гидрофобный характер, электростатические силы связывания заряженной гидрофильной части белковой молекулы и полярных групп окружающих липидов могут существенно влиять на характер липидного микроокружения белка. Кроме того, для активирующего действия липидов по отношению к некоторым мембранным ферментам важны такие факторы, как степень подвижности ацильных цепей и способность липидов образовывать мицеллы. По-видимому, сродство разных липидных молекул к белкам мембраны определяется не спецификой белков, а спецификой липидных молекул. [c.60]

Однако сама по себе модель работающего мембранного белка пока что остается гипотетической, базирующейся в основном на косвенных данных. Но следует подчеркнуть, что прямые подтверждения этой модели чрезвычайно затруднены особыми свойствами мембранных белков. По своей сути мембранный белок должен одновременно хорошо взаимодействовать с жирами (для закрепления его в липидной мембране) и водой, в которой растворены сигнальные и другие биологически вангные вещества. Двойственная природа прпводиг к значительным трудностям выделения и очистки подобных веществ для структурных исследований. К тому же несомненно, что выделение из естественной среды вызовет искажение формы белка и утрату активности. [c.76]

Предпринималось много попыток расчленить и вновь реконструировать субмитохондриальные фосфорнлирующие частицы. Первым из достижений было удаление нескольких факторов сопряжения , из которых наиболее известен фактор сопряжения р1 (разд. Д,1). Удаление фактора р1 из субмитохондриальных частиц всегда ведет к потере им способности синтезировать АТР, но перенос электронов остается незатронутым. Фосфорилирующую способность можно снова восстановить,, добавляя р1 к мембранным препаратам. Следовательно, р1 теснейши образом связан с синтезом АТР. Этот важный белок был выделен из митохондрий и из хлоропластов в виде гомогенных частиц с мол. весом 285 ООО. В его состав входят, по-видимому, полипептидные цепи пяти различных типов с молекулярными весами / 60 000, 56 000, 36000, 17000 и 13 000 [78. 79]. [c.409]

В постсинаптической мембране мионевральпого соединения установлена высокая концентрация ацетилхолинэстерааы (АХЭ) — фермента, катализирующего гидролиз АХ. Показано, что рецепторным веществом является специальный гидрофобный белок. Этот белок был выделен из мембран нервных окончаний. Он имеет большое сродство к АХ и к другим холинэргическим веществам. Де Робертис предложил модель постсинаптической мембраны (рис. 11.22). В мембрану включены дискретные рецепторные [c.382]

Вирусы относятся к ультрамикробам, которые настолько малы, что проходят через мембранные фильтры, задерживающие обычные бактерии. Так, размер частиц вируса полиомиелита составляет 8—17 нм, вируса Коксаки и E HO — 20—30 нм, инфекционного гепатита — 40-56 нм. Вирус полиомиелита выделен также в форме кристаллического протеина, обладающего инфекционными свойствами. Для вирусов характерны отсутствие клеточного строения, простота химического состава (обычно гидратированный белок и специфическая нуклеиновая кислота), своеобразие обмена веществ (не имея своей ферментативной системы, они являются паразитами живой клетки животных и растений). Вирусы не размножаются на искусственных питательных средах накапливаются они и проходят определенный цикл развития в соответствующих живых клетках. Действие многих антибиотиков и химиотерапевтических веществ на них малоэффективно. [c.186]

Белок клатрин впервые был выделен из мембран так называемых окаймленных пузырьков, принимающих участие в эн-доцитозе и быстром внутриклеточном транспорте веществ. Этот фибриллярный белок (М = 180 кД образует характерный многоячеистый чехол а виде корзиноподобной сети из пяти- и шестиугольных пептидных цепей на поверхности окаймленных пузырьков. Эта сеть формируется в результате нековалентных связей между трехлопастными молекулами клатрина, состоящими каждая из трех идентичных тяжелых и трех легких полипептидных цепей двта типов. Легкие цепи клатрина активно связывают ионы Са в молярном соотношении 1 1. [c.85]

Широко распространены липопротеиды, входящие в состав клеточных мембран (см. стр. 290). Связь между белком и липидом очень слабая, и ее можно расщепить этанолом. Многие препараты липопротеидов, выделенные из растений, обладают окраской вследствие содержания в них каротиноидов. Хлорофилл, который можно считать липидом, образует с белком зеленый комплекс. Этот комплекс, названный хлоропластином, выделен из листьев ряда растений. Однако попытки выделить хлоропластин определенного состава не имели успеха. Были получены кристаллические препараты хлоропластина, но, по имеющимся данным, белок в этом комплексе связан с кристаллическим хлорофиллом непрочной адсорбционной связью. [c.11]

Под влиянием афферентной импульсации усиливается выделение ацетил-холина. Он проникает через пресинаптическую мембрану и попадает в синаптическую щель. Здесь ацетилхолин действует на рецепторный белок постсинаптической мембраны, вызывая его деполяризацию, т. е. возбуждение. Предполагают, что рецептор ацетилхолина одновременно выполняет две функции участвует в активном транспорте ионов и катализирует ферментативный распад ацетилхолина (Ghangeux et al., 1969). [c.8]

Гемолитическая активность миксовирусов, по всей вероятности, происходит из клеточных лнзосом — наполненных ферментами пузырьков, окруженных липопро-тоидными мембранами [345, 346]. Из различных штаммов вируса гриппа был выделен и детально 0характерр130ван еще один типично клеточный компонент, называемый антигеном хозяина,— мукопротеид с очень высоким содержанием углевода [192, 273]. Во всех этих исследованиях для идентификации и дифференцирования высвобождаемых белков широко использовались серологические методы. Таким образом под термином антиген часто подразумевают белок (простой), гликонротеид, мукопротеид или липопротеид. [c.137]

Сетчатка глаза человека содержит рецепторные клетки двух типов — палочки и колбочки. Палочки отличаются большой светочувствительностью всего пяти квантов света достаточно, чтобы вызвать нервный импульс. Палочки предназначены для зрения при малой освещенности и дают черно-белую картину. Колбочки обеспечивают цветовое зрение. Существует три вида колбочек — чувствительные к синей, зеленой или красной областям спектра. Хромофором, воспринимающим свет в палочках сетчатки, является хромопротеин родопсин, или зрительный пурпур. Опсиновый белок в действительности является сложным комплексом собственно белка — опсина, липидов и углеводов, но термин опсин применяют как к белковой части, так и к комплексу в целом. Опсины, выделенные из сетчатки многих видов животных, представляют собой небольшие белки с молекулярной массой порядка 30 000—40 ООО. Почти у всех представителей животного мира зрительные пигменты в качестве хромофора содержат 11- < с-ретиналь (витамин А распространение 3,4-дегид-роретиналя (витамин Аг) ограничивается рядом пресноводных рыб и некоторыми видами земноводных. Родопсин находится в мембранных структурах — дисках, которые располагаются в палочке. Мембранные диски на 80 % состоят из родопсина, молекулы которого пронизывают [c.132]

После этих работ был выяснен механизм действия некоторых ядов. Например, из яда паука каракурта был выделен белок — латротоксин, который по существу представляет собой незакрывающиеся кальциевые каналы. Он встраивается в преспнаптическую мембрану и начинает пропускать в терминаль кальций. В результате запасы ацетилхолина в терминали полностью истощаются и нервная система не может вызвать сокращения мышц. [c.167]

Но каким способом лимфоцит делает отверстия в мембране атакованной им клетки Ведь отверстие, сделанное, например, микроэлектродом, вовсе не приводит к гибели клетки после вынимания микроэлектрода рана в мембране быстро затягивается. Оказалось, что лимфоцит при контакте с жертвой выбрасывает из особых пузырьков молекулы специального белка (этот процесс очень похож на выделение медиатора в химических синапсах). Эти молекулы встраиваются в мембрану жертвы и из нескольких таких молекул-субъединиц возникает трубка, продырявливающая мел1брапу. Белок, образующий такую трубку, назвалп перфорпном. Возникающий в мембране перфори- [c.281]

Для гиалуроновой кислоты Огстон и сотр. [30—32] получили данные, свидетельствующие о том, что гиалуроновая кислота из синовиальной жидкости быка представляет собой комплекс с белком, содержание которого равно 26—30%. При выделении в мягких условиях (дифференциальное фильтрование, использование хлористого цетилпиридиния) гиалуроновую кислоту не удается освободить от этого белка. Белок не отделяется и при электродиализе. Огстон и Шерман [33] сообщили, что электродиализ синовиальной жидкости быка при 37 ма (5,6 ма/см , 0,025 М фосфат, pH 7,0, 2°) вызывает быстрое удаление белка через мембрану (миллипоровые мембраны с диаметром пор 0,4 мк), но даже после 36 час содержание белка в комплексе не уменьшается. Тот же результат был получен при электродиализе чистого комплекса белка с гиалуроновой кислотой при 37 ма в течение 12 час — времени, которое необходимо для удаления 90% общего белка синовиальной жидкости. Сывороточные альбумин и углобулин легко проходят через мембрану. Огстон и Шерман так объяснили свои результаты Поскольку есть основания считать, что присутствующий в комплексе белок обладает нормальным размером молекул, и, следовательно, в свободном виде он должен легко проходить через миллипоровую мембрану (как проходят все остальные белки синовиальной жидкости быка и два исследованных белка сыворотки), полученные данные указывают, что этот белок нельзя выделить из комплекса простым электрофорезом . [c.32]

Рис. 7-28. Трехмерная модель питохрома с - одного из переносчиков электронов в дыхательной пени. Этот небольшой белок, содержащий немногим больше 100 аминокислотных остатков, может перемещаться в мембране, так как связан лишь ионными взаимодействиями (см. рис. 7-35). Атом железа (выделен более темным цветом) в составе связанного гема (окрашенного слабее) способен переносить один электрон (см. также рис. 3-

В направлении сигнального пептида к мембране ЭР участвуют 1) частица, распознающая сигнал (а signal-re ognition parti le, SRP), связывающая сигнальный пептид, и ее рецептор, известный также как стыкующий белок. Частицы, распознающие сигнал, были открыты в ходе экспериментов, которые показали, что отмывка микросом в растворах солей уничтожает их способность импортировать секреторные белки. Эту способность можно восстановить, добавляя супернатант, содержащий солевой экстракт. Впоследствии фактор переноса был выделен Он [c.44]

Цитоплазма эукариотической клетки вне органелл всегда пронизана системой мембран, состоящей главным образом из уплощенных пузырьков, — эндоплазматической сетью 1777]. В процессе выделения мембраны обычно разрываются, а возникающие при этом частицы называются микросома-ми они содержат синтезирующие белок рибосомы. В некоторых участках клетки мембраны упакованы более плотно и регулярно, образуя тельца Гольджи, имеющие довольно определенную форму. Кроме того, в клетке содержатся эндосек-реторные органеллы, так называемые лизосомы, происходящие, по-видимому, от телец Гольджи. Имеются также перок-сисомы 18, Е), а на поверхности клетки часто бывают жгутики (19, Д). [c.177]

Белок полосы III из мембраны эритроцитов человека представляет собой трансмембранный белок с молекулярной массой около 100 кДа (примерно 800 аминокислотных остатков). Это транспортный белок, две молекулы которого образуют анионный канал для ионов СГ и НСО3, пассивно перетекающих через мембрану в соответствии с градиентами их концентраций [242-244]. Полипептидная цепь белка в а-спиральной конформации несколько раз пронизывает бислой около трети его цепи с N-конца помещена в цитоплазму, а короткий С-концевой участок расположен во внеклеточном пространстве (рис. 1.6). Для того чтобы понять механизм функционирования транспортного белка полосы III, как и механизмы действия других мембранных белков, необходимо знать трехмерную структуру молекулы в условиях липидного бислоя. Для получения такой информации требуется, на первый взгляд, почти невозможное. Во-первых, необходимо отделить трансмембранный белок от липидов и других мембранных белков, не повредив его молекулярной трехмерной структуры, что очень трудно. Во-вторых, из выделенных белковых молекул следует получить, не нарушив их пластической, легко деформирующейся при изменении внешних условий структурной организации, высокоупорядоченный монокристалл требуе-мых размеров, что не всегда удается даже в случае водорастворимых [c.58]

Еще один пример - аргиопининсвязывающий белок (АСБ), выделенный из мембран коры головного мозга. Молекулярная масса полипептидной цепи составляет 68 кДа [605]. Двухмерные кристаллы получали диализом от детергента смеси АСБ и ДМФХ, солюбилизированных (З-О-октилгликозидом [606]. Средний продольный размер таких кристаллов составляет 0,2 мкм, поперечный 0,05 мкм. Кристаллы представляют собой ленты двухмерных слоев, свернутые в трубы. Вероятно, при кристаллизации первоначально молекулы АСБ собираются в нитевидные структуры, которые далее ассоциируют друг с другом, образуя ленты двухмерных слоев. Такие ленты в свою очередь образуют трубообразные структуры, в дальнейшем уже не склонные к более высокой степени ассоциации. Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры а = 8,3 нм, Ь = 8,9 нм, у = 99°. [c.192]

Нейроспецифический кальмодулин-связывающий белок Р-57 был выделен из мембран мозга. Этот белок характеризуется отсутствием упорядоченных участков цепи с а- или -структурой, и почти половина его аминокислотных остатков имеет гидрофильный характер. Вероятно, он составляет внешнюю часть мембранного рецептора (Wakim et al., 1987). [c.93]

Динамическая структура липидного бислоя наиболее полно изучена на примере искусственных бислойных везикул. Эти исследования показали, что молекула фосфолипида как целое может вращаться вокруг своей продольной оси и имеет достаточно высокую подвижность в слое с коэффициентами латеральной диффузии 10 —10 см /с. Полярные головки образуют на поверхности короткоживу-щие (10 —10 с) кластеры из 20—30 молекул, в результате чего могут возникать временные дефекты в структуре бислоя. Диффузия молекул воды через липидный бислой возможна при их попадании в эти свободные объемы между гидрофобными хвостами липидов. Молекулы фосфолипидов, находясь в бислое, могут осуществлять перескок из одного слоя в другой (флип—флоп). Однако в искусственных бислойных мембранах это происходит сравнительно редко из-за энергетической невыгодности переноса полярной головки через гидрофобный слой (Оеепеп, 1981). Только селективное взаимодействие с интефальными белками природных мембран может обеспечить быстрый переход фосфолипида из одного слоя в другой. Например, из печени быка был выделен белок, селективно взаимодействующий с ФХ и транспортирующий его с внешней стороны мембраны на внутреннюю, из искусственных везикул в плазматическую мембрану. После гидролиза этого комплекса был [c.110]

Чем следует руководствоваться, выбирая детергент для использования Экстракцию периферических белков из мембранных фрагментов легко осуществить изменением pH, ионной силы или применением хелаторов двухвалентных катионов. После этого внеклеточные фрагменты политопиче-ских белков можно отщепить протеолизом. Иногда для выделения мембраносвязанных белков используют органические растворители, если нет необходимости в получении белков в нативном состоянии. Для выделения комплексов белка с аннулярными липидами используются неионные детергенты, в то время как при использовании ионных детергентов можно получить белок— детергентные комплексы. [c.91]

Крупные пептиды и белки трижды диализуют в течение 12 ч против 0,15 М Na l, содержаш,его 0,1% ДСН, а затем трижды против 0,027о ДСН. Если белок был выделен методом электрофореза в ПААГ — ДСН, элюат центрифугируют при 20 000 об./мин в течение 20 мин для удаления частиц акриламидного геля. Примеси красителя кумасси не мешают секвенированию. Однако следует помнить, что равновесное распределение ДСН через диализную мембрану — процесс медленный и может потребовать нескольких дней. Таким образом, окончательная концентрация ДСН в образце зависит от продолжительности диализа. [c.76]

Трансйортные белки. В крови позвоиочпых животных имеется особый белок — гемоглобин. Он очень активно связывает молекулярный кислород. При прохождении крови через легкие гемоглобин соединяется с кислородом, когда же кровь попадает обратно в сердце и другие ткани, связанный кислород освобождается и используется ткапями. Таким образом, гемоглобин пе катализирует химическую реакцию, а выполняет функцию переносчика определенного вещества. Строение гемоглобина способствует тому, что он узнает молекулы кислорода и связывается с ними. В клетках и на их наружных мембранах также содержится много разнообразных белков, которые облегчают поступление в клетки необходимых веществ и выделение из них отработанных продуктов обмена. Все известные транспортные белГки узнают специфические вещества и взаимодействуют с ними. [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология