Гель-электрофорез полиакриламидном геле

Сравнительно недавно разработан метод электрофореза на полиакриламидном геле. Метод характеризуется высокой разрешающей способностью и применяется для фракционирования и определения размеров, конфигурации и суммарного заряда молекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) см. обзор 24]. [c.399]

Полученные гидролизаты анализируют различными методами гель-хроматографией, ионообменной хроматографией, электрофорезом и хроматографией на бумаге и в тонком слое, электрофорезом в полиакриламидном геле, методом пептидных карт на бумаге или в тонком слое (в одном направлении пептиды подвергаются электрофорезу, в другом — хроматографии) и др. При этом пептиды, содержащие остат ки аргинина, триптофана и гистидина, могут быть открыты с помощью специфических цветных реакций (с. 129). Выбор метода диктуется величиной (молекулярной массой) и характером пептидов гидролизата. [c.139]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.94]

Рис. 11. Схема прибора для вертикального электрофореза в пластинках полиакриламидного геля.

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Электрофорез белков в пластине полиакриламидного геля имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом в трубочках. Использование тонких пластин облегчает эффективное отведение тепла при электрофорезе. Процесс фиксации, прокраски и отмывания занимает значительно меньше времени. Использование одной пластины позволяет [c.97]

В настоящее время основное значение приобретает электрофорез в полиакриламидном геле. — Прим. ред. [c.387]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ [c.119]

ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез [c.111]

Согласно той же формуле (18.4) коэффициент диффузии обратно пропорционален вязкости растворителя. Поэтому особенно высокого качества разделения удается достигнуть, проводя электрофорез в гелях, вязкость которых чрезвычайно высока. Для разделения белков и нуклеиновых кислот наиболее широко используются полиакриламидные гели (см. 8.5). С помощью электрофореза в таких гелях удается в один прием разделить десятки компонентов. В качестве иллюстрации на рис. 91 приведен результат разделения смеси фрагментов нуклеиновой кислоты разной длины от 40 до 72 нуклеотидных звеньев. Электрофорезу подвергались фрагменты, меченые радиоактивным фосфором После завершения разде- [c.331]

Электрофорез проводят либо в свободной незакрепленной среде (в свободной жидкости) — фронтальный электрофорез, либо в закрепленной среде — зональный электрофорез — на крупнопористых носителях (фильтровальная бумага, целлюлоза, порошкообразная пластмасса, агар-агар, ацетилцеллюлоза, стеклянный порошок) или на мелкопористых носителях (силикагель, полиакриламидный гель, целлюлоза, оксид алюминия, крахмал и др.). [c.237]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

В качестве среды для электрофореза нуклеиновых кислот чаще всего используют полиакриламидный гель. Размер пор полиакриламидного геля, а следовательно, и его свойства как молекулярного сита варьируют в широком диапазоне, благодаря чему в этой среде можно разделять нуклеиновые кислоты различной молекулярной массы. Так, например, в гелях, содержащих 2—3% Т, разделяют рибосомные РНК (мол. масса 0,5-10 —2-10 ) в гелях с Т, составляющим около 10%, —транс- [c.370]

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-фата натрия в присутствии р-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли. [c.119]

С помощью гель-электрофореза молекулы, имеющие в иных условиях близкие электрофоретические подвижности, разделяются по их размерам. Первоначально для этой цели использовали крахмальный гель [128], который и до сих пор применяется в аналитических целях. Однако крахмальный гель никогда не удавалось успешно использовать в препаративных масштабах. Универсальным средством для анализа белков (а теперь и нуклеиновых кислот) в биохимических лабораториях стал полиакриламидный гель [129]. Он также пригоден и для препаративного электрофореза. Поскольку этот гель, представляющий собой трехмерную сетку нитей, образующих поры разных размеров [130], обладает разной эффективной вязкостью в зависимости от размеров молекул, уравнение (5.2) для электро- [c.215]

Ионообменная ТСХ гидрофильных белков вполне возможна, но ее практически оттеснил более совершенный метод электрофореза в полиакриламидном геле и пленках ацетилцеллюлозы (последний метод нашел себе применение для клинических анализов физиологических жидкостей). [c.490]

Для идентификации белков, элюируемых с колонки, содержимое пробирок, соответствующее отдельным пикам на кривой элюции, объединяют, подвергают диализу, лиофилизируют и исследуют с помощью электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле. [c.112]

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот [34]. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных — в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов. [c.27]

Исследование электрофоретической подвижности лактатдегидрогеназы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (с. 94) [c.338]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Вебера и Осборна [1379]. Белки инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в растворе, содержащем 0,01 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), 1,% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола если белки проявляют склонность к образованию агрегатов, то к ним добавляют 8 М мочевину. После инкубации белки диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 0,01М нат-рий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1% ДСН и 0,1% 2-меркаптоэтанола. Электродный буфер 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), содержащий 0,1% ДСН. Состав геля 10 /о Т, 2,65% С 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0) 0,1% ДСН 92 мг /о персульфата аммония, 0,15 мл ТЕМЭД на 100 мл раствора. К каждой пробе добавляют 3 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 1 каплю глицерина и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. [c.226]

Первоначально для гель-электрофореза применяли крахмаль-ный гель. На рис. 9.4 изображено типичное устройство для электрофореза в крахмальном геле. Гель представляет собой пасту из картофельного крахмала, зерна которого разрушены нагреванием в буфере. При горизонтальном положении геля, как показано на рисунке, образец наносится в пхель, прорезанную лезвием бритвы, в виде раствора или смеси с зернами крахмала. Щель заливают воском или жиром, после чего прикладывают напряжение. После окончания электрофореза полутвердый гель отделяют и часто разрезают на два или три слоя, каждый из которых окрашивается различным способом. Разнообразные компоненты проявляются в геле в виде серии полос (рис. 9-5). В настояш ее время крахмальный гель используется редко, поскольку более удобным оказался полиакриламидный гель. [c.229]

Гели в качестве поддерживающей среды при электрофорезе обладают рядом важных особенностей. Главная из них та, что размеры пор геля могут быть сравнимы с размерами белковых макромолекул. В этих условиях подвижность частиц очень резко зависит от их размеров. Таким образом, вводится дополнительный фактор, влияющий на разделение. Кроме того, адсорбция во многих гелях крайне мала. Но этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью по отношению к сложным белковым смесям — значительно более высокой, чем все другие методы. Это особенно выражено в крахмальном геле, предложенном Смитисом в 1955 г., и в синтетическом полиакриламидном геле, который все чаще используют в последнее время. В этих гелях, например, удается обнаружить до 30 компонентов сыворотки крови, в то время как фронтальный электрофорез дает только 5—7. Агаровый гель хотя и обладает малой адсорбцией по отношению к белкам, дает худшее разделение, так как размер пор в нем относительно велик. Но и в агаре было замечено, что отношение подвижностей больших и малых ионов уменьшается с увеличением концентрации агара (т. е. с уменьшением размера пор). [c.95]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Модификация методов последнего типа была использована для определения константы диссоциации глюканфосфорилазы [1271]. После электрофореза полиакриламидные гели инкубируют в 2 М На-ацетатном буфере (pH 5,9), содержащем 0,5 мг/мл АМФ и 2,5 мг/мл глюкозо-1-фосфата гликоген добавляют либо перед полимеризацией геля, либо к инкубационной среде. После инкубации при 37 С в течение 5—10 мин (в завиг симости от количества присутствующего фермента) гели погружают в раствор Щ—Ь в 7%-ной уксусной кислоте. Появление фиолетовых полос указывает местонахождение фермента. Через [c.292]

Наиболее часто для определения фенотипа трансферрина используют электрофорез в крахмальном геле. Разделение проводят в боратном буфере Смитиса [1199] или в неоднородной трис-цитратной системе Паулика [1028]. Для установления фенотипа трансферринов животных применяют и другие буферные системы, в частности систему Аштона и Брейдена [65]. Спунер и Бакстер [1221] использовали буфер трис-какодиловая кислота (pH 7,45). Кроме того, с этой целью проводят электрофорез в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере при pH 8,8 [960] или при pH 9,3 [1275]. Наличие в сыворотке человека того или иного вариантного трансферрина обнаруживают также с помощью электрофореза в агаровом геле [630], а для подтверждения полученных результатов осуществляют во втором направлении иммуноэлектрофорез [424]. Однако в этом случае картина оказывается менее четкой, чем при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле. В последнее время стали применять другой подход вначале сыворотку подвергают изоэлектрофокусированию в геле из специальной марки агарозы (лишенной электроэндосмоса), а затем проводят электрофорез в геле, содержащем антитела [492, 631]. [c.346]

Мэтьюс и Деккер [832] определяли молекулярную массу гликозаминогликанов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в 0,05 М фосфатном буфере (pH 7,5). Очищенные полисахариды подвергают электрофорезу в полиакриламидных гелях с концентрацией 3, 4, 5, 8 и 10%), а затем пройденные полисахаридами расстояния в этих гелях делят на длину пути,, пройденного в 3%-ном геле полисахаридом с наименьшей в данной фракции молекулярной массой. Таким путем устраняется различие в электростатических силах, действующих на каждый тип молекул. Полученные величины наносят на график как функцию от логарифма молекулярной массы полисахаридов. Точность метода составляет 7—26%. [c.398]

Диск-электрофорез кислой а-глюкозидазы проводят в 7,5% полиакриламидном геле при pH 4,3 с р-аланин-ацетатным электродным буфером (Маурер, 1971) время электрофореза 90 мин при силе тока 4 мА на трубку. После окончания электрофореза столбики полиакриламидного геля быстро извлё1сают из стеклянных трубочек. Часть столбиков геля окрашивают на белок 0,2% раствором кумасси бриллиантового голубого R-250 в 7% растворе уксусной кислоты (можно использовать и другие красители, например амидочерный) другую часть столбиков геля используют для выявления ферментативных активностей кислой а-глюкозидазы методом контактных пленок. Для этого гели полиакриламида помещают в желобки гофрированной пластмассовой [c.110]

Электрофорез проводят в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия на приборе для электрофореза с вертикальным расположением пластин производства объединения Хийу Калур (ЭССР). Основные и рабочие растворы готовят по методике Лэммли (с. 121). [c.397]

Наряду с разделением белков по величине электрофоретической подвижности ири использовании указанных носителей имеет значение молекулярно-ситовой эффект геля и размеры молекул Оелка ири прохождении их через ячеистую структуру геля. Так, если при электрофорезе иа бумаге белки сыворотки разделяются на 4—5 четких зон, то в полиакриламидном геле выявляется 13—16 полос, соответствующих отдельным белкам (рис. 98). [c.219]

Биогели серии Р. Кроме агарозных, фпрма Bio-Rad выпускает сферичеекпе матрицы на основе полиакриламидного геля под общим торговым наименованием Bio-Gel Р . Пористость геля, как и при электрофорезе, определяется концонтрацпей в нем акриламида. Основные параметры этих биогелей таковы [c.121]

Метод обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделерше белковых смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме частиц. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ химическая стабильность и инертность геля, возможность получения гелей с заданной величиной пор, отсутствие адсорбции и электроосмоса, устойчивость к растворителям, изменениям температуры и pH. [c.94]

Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е. электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного когщентрирования. [c.94]

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе осуществляют с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку последовательно следующие растворы 0,02 М натрий-ацетатный буфер, pH 4,6 ( стартовый буфер), затем 0,05 М натрий-ацетатный буфер, pH 5,2 0,08 М натрий-ацетатный буфер, pH 6,0 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,0 и, наконец, 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,5 М Na l, pH 8,3. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик, вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 мл/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 мл. Обработку результатов см. на с. 108. Идентификацию белков осуществляют методом электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле (с. 112). Регенерацию КМ-целлюлозы проводят вне колонки. [c.113]

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами. [c.116]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

Исследуют изозимный состав лактатдегидрогеназы в гиалоплазме сердечной и скелетной мышц крысы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология