Пероксидаза на константы скорост

Связаны ли между собой анион и протон в недиссоциированную молекулу кислоты, или же они связываются с ферментом по отдельности Предположение о связывании недиссоциированных слабых кислот, таких, как H N, НСООН и HF, разумно с энергетической точки зрения, и можно назвать примеры связывания таких молекул, как HF, HNg, H N или HN , с комплексами, отличными от порфириновых. Однако интуитивно представляется крайне маловероятным, чтобы кислоты типа НС1, НВг и Н1, для которых р/С равны —7, —9, —10 соответственно [23], могли связываться с белком в такой форме. И действительно, кинетические измерения показали, что в реакциях I с комплексами Fe и Fe [187, 188] и при восстановлении перекиси водорода иодид-ионом [25] молекула HI не может быть реагирующей частицей, поскольку это потребовало бы, чтобы константа скорости на десять порядков [10] превышала диффузионную константу скорости. Таким образом, Н" и I" должны независимо друг от друга реагировать с ферментом. Показано, что кинетика обратимого связывания аниона слабой кислоты F с Fe -пероксидазой хрена также согласуется только с независимым связыванием Н" и F различными центрами белка [75]. Естественно, мы не можем с уверенностью утверждать, что этот вывод распространяется на анионы всех слабых кислот, одна- [c.208]

Константа 54 больше, чем А43, как для каталазы, так и для пероксидазы, как и следует ожидать, учитывая, что Fe — более сильный окислитель, чем Fe , и что аналогичные константы скорости для обоих ферментов численно весьма близки. [c.216]

Во-первых, константы 53 почти одинаковы в присутствии и в отсутствие белка. В этом трудно убедиться независимым путем, однако сравнительно малое влияние белка на ряд других констант скорости (например, на общую каталитическую активность миоглобина и пероксидазы хрена, константы 54 и 43 пероксидазы хрена) делает такое предположение вполне правдоподобным. [c.220]

И каталазы и в еще большей степени пероксидазы дают хорошие примеры ферментов, которые в значительной мере неспецифичны по субстрату — в противоположность многим другим ферментам. Они относятся также к числу самых активных из всех известных ферментов, а соответствующие константы скорости бимолекулярных реакций, протекающих при их участии (до 1,4-10 л-моль -с , табл. 17), близки к диффузионному пределу. [c.222]

Во-первых, белок увеличивает константу скорости 35 в случае каталазы и пероксидазы в 10 —10 раз, а скорость установления равновесия в предшествующей этой реакции стадии увеличивается в присутствии белка в 10 раз. Эту реакцию, вероятно, можно записать в следующем виде [c.224]

Во-вторых, в пероксидазе белок существенно не влияет на константы скорости 54 и 43. Однако в каталазе эти константы могут уменьшаться в 10 —10 раз вследствие пространственных затруднений, возникающих при атаке большими молекулами субстрата. [c.225]

Значение к — константы скорости разложения первичного комплекса на пероксидазу и перекись — не может быть получено прямыми измерениями. Измерения константы равновесия для диссоциации первичного и вторичного комплексов с гидроперекисью метила дали величины 3,2 10 Ж и 3 10 Ж, из которых при учете известных констант скорости процесса образования была оценена кп, оказавшаяся равной 2,2 сек. 1 или 3,4 сек.- . [c.209]

Реакции вторичных комплексов с донорами водорода являются быстрыми бимолекулярными реакциями. Чанс [49] для комплексов полученной из хрена пероксидазы с перекисью водорода и гидроперекисями метила и этила в случае реакции с аскорбиновой кислотой при pH 7,0 получил значения константы скорости k , соответственно равные 2,8 10 2,8 и 2,2 10 Ж сек- , а для реакции с пирогаллолом при pH 7,0 — соответственно равные 2,1 10 , [c.210]

Обнаружено [69], что каталаза в присутствии перекиси водорода образует какое-то промежуточное соединение. Спектр его измерялся в интервале 380—430 та, и по сравнению со спектром свободной каталазы наблюдалось небольшое смещение к видимой части. Этот комплекс не обнаруживает никакого сходства с циан-каталазой или соединением, образующимся при добавлении перекиси к азид-ката-лазе. Образование его происходит очень быстро, причем бимолекулярная константа скорости имеет величину около 3 10 сек Ч Если не добавлены доноры водорода, данный комплекс медленно разлагается по реакции первого порядка с константой скорости, равной примерно 0,02 сек. 1. Таким образом, этот комплекс каталазы напоминает первичный зеленый комплекс пероксидазы с перекисью водорода. [c.216]

Несмотря на то, что бимолекулярные константы скорости процесса образования этих комплексов велики, все же они несколько меньше, чем в случае образования комплекса с перекисью водорода. Их значения для гидроперекисей этила и метила и перекиси водорода соответственно равны 2 10-, 8,5 10 и 3 10- сек , причем обнаруживается уменьшение при увеличении размера молекулы перекиси. Образование вторичных комплексов иа первичных комплексов с гидроперекисями алкилов не является простым процессом [71]. Вторичные комплексы не образуются до тех пор, пока не появятся заметные количества первичного комплекса, однако реакция не представляет собой превращения первичного комплекса по первому порядку, как в случае пероксидазы. Скорость образования вторичных комплексов с ростом концентрации гидроперекиси алкила увеличивается, однако не настолько, чтобы следовать уравнению второго порядка. [c.218]

В гл. 7 мы рассматривали вопрос о том, каким образом белок может влиять па константы равновесия. Теперь перейдем к более сложному вопросу — о влиянии белка на скорость реакции. Эффекты этого типа будут рассматриваться на примере реакций перекиси водорода с каталазами и пероксидазами. Общее введение к вопросу [c.194]

Причем показано, что протонирование само по себе не вызывает никаких изменений в электронном спектре вплоть до pH 2,8, если pH среды регулируется с помощью серной кислоты [53]. В этом случае связывание Е должно менять основную константу диссоциации более, чем в 100 раз, и, наоборот, связывание Н+ должно во столько же раз менять константу связывания Е". Однако кинетические измерения показали, что протонирование Ре -пероксидазы хрена увеличивает скорость связывания Р в 10 раз, не влияя при этом существенным образом на скорость диссоциации [75]. [c.209]

В связи с этим можно заключить, что константы и 43 существенно не меняются в результате влияния белка в пероксидазе хрена (и, вероятно, в других гемопротеинах, например в миоглобине), однако белок в каталазе может существенно понизить скорость этих реакций за счет пространственных затруднений (в 10 — 10 раз), если молекулы восстановителя достаточно велики. [c.218]

Кривые термоинактивации [Воронова и др., 1981] имели сложную форму, и условно на кинетических кривых можно выделить два участка, соответствующие быстрой и медленной стадиям инактивации. В табл. 15 приведены величины константы скорости медленной стадии термоинактивации выделенного фермента. Сопоставление кинетических зависимостей скорости инактивации указывает на различия в термостабильности пероксидаз, выделенных из зараженных и контрольных растений (рис. 15, а, б). Термостабильность пероксидазы здоровых и вирозных (ВТМ) растений табака сорта Самсун 47/10 различалась не так резко, как для пероксидазы растений Ксанти (рис. 15, а). Константа скорости инактивации фермента из растений этого сорта как при 60°, так и при 72° была также несколько выше у зараженных растений, но ниже, чем у пораженных растений сорта Ксанти. Следовательно, как при системном (Ксанти + Хт или Ху), так и при некротическом (Самсун 47/10 + ВТМ) поражении вирусная инфекция приводит к понижению термоустойчивости фермента пероксидазы. Константа скорости тепловой инактивации пероксидазы контрольных растений оказалась одинаковой для исследуемых растений двух сортов табака (табл. 15). [c.78]

В случае высокомолекулярных субстратов существенное уменьшение константы скорости бимолекулярных реакций определяется уменьшением коэффициентов диффузии. Для ферментативного окисления ферроцитохрома С перекисью водорода с помощью цитохрома С пероксидазы теория реакций, контролируемых диффузией, при использовании параметров 0 2 — Ю" см -с и= 5A удовлетворительно описывает экспериментальные данные (Ag n = 1,2-10 М" -с , /е,еор = 2-10 М-1.С-1) [29]. [c.270]

Спектральным анализом установлено, например, что пероксидаза хрена образует два комплекса с перекисью водорода, из которых второй получается из первого и может быть активным или неактивным. При изучении кинетики реакции гидролиза п-нитрофенолацетата и 2,4-динитрофенолацетата, катализируемой химотрипсином, были обнаружены три стадии. Первая— быстрая адсорбция субстрата, вторая—освобождение одного моля нитрофенола на моль химотрипсина с параллельным ацилированием группы у фермента и третья — гидролиз соединения фермент-ацил. Константы скоростей второго и третьего процесса соответственно равны к2=Ъ сек и 3 = 0,025 сек Эти величины характеризуют скорости реакций каждой из активных групп катализатора при взаимодействии с ферментом. В первой стадии освобождается только нитрофенол, ацетат же реагирует с гидроксильной группой фермента. [c.262]

Влияние pH обнаружено для каталазы, пероксидазы хрена и хлоро-пероксидазы, причем оно распространяется как на константы равновесия связывания анионов, так и на константы скорости окис-, лительно-восстановительпых реакций, протекающих при участии анионов. Можно предположить, что природе пришлось развить это свойство для какой-то специальной цели и что оно каким-то способом участвует в обеспечении ферментативной активности. Поэтому целесообразно рассмотреть такого рода эффекты более подробно. [c.206]

Следует иметь в виду, что данные о константах скорости различных реакций не всегда относятся к одинаковым условиям в отношении температуры, pH и ионной силы. Поэтому следует тщательно рассматривать все экспериментальные условия по оригинальным публикациям, в которых эти константы были получены. Однако изменения скорости, определяемые условиями эксперимента, по всей вероятности, не существенны по сравнению с изменениями, индуцированными белком, что позволяет в дальнейшем обсуждении пренебрегать влиянием условий опытов. В ряде случаев мы будем сравнивать активность различных комплексов и белков с активностью железодейтеропорфирина. Поскольку замена железопротопорфирина в цитохром с-пероксидазе на железодейтеропорфирин дает искусственный фермент с активностью, составляющей 97% активности нативного белка (разд. 8.2), мы будем предполагать, что и соответствующие небелковые комплексы также характеризуются одинаковой каталитической активностью. [c.213]

Каталаза обнаруживает поразительное сходство с пероксидазой хрена в реакции восстановления ее нитритом, зависящей от присоединения протона. Сравним следующие константы скорости (л моль" с ), полученные в расчете на недиссоциированную HNOg [1591 [c.216]

Однако между этими ферментами в реакциях с аскорбиновой кислотой, ароматическими аминами и фенолами имеются существенные различия. Все указанные восстановители реагируют со скоростью, которая практически не зависит от pH, по крайней мере вблизи pH 7. И в этих случаях 54 > 43 и для каталазы, и для пероксидазы хрена, однако обе константы скорости в случае каталазы существенно меньше, чем соответствующие константы скорости для пероксидазы. Гваякол и л-аминобензойная кислота восстанавливает Fe -пероксидазу хрена ( 54 = 9-10 и 5-10 л-моль - с 1 соответственно) примерно в 25—30 раз быстрее, чем комплекс Fe того же фермента ( 43 = 3-10 и 2-10 л-моль - "i) [34]. Для каталазы соответствующие константы скорости не получены. Пирогаллол восстанавливает Fe -каталазу ( 54=2,4 10%-моль - с 1) [159] примерно в 30 раз быстрее, чем Ре -каталазу ( 43 = = 80 л -моль -с ) [159]. Однако последняя константа скорости на несколько порядков меньше, чем соответствуюшле константы для пероксидазы хрена ( 43 = 3-10 л-моль 1-с ) или для небелкового комплекса железопротопорфирина в присутствии избытка гистидина (( 43 = 6-10 л-моль" -с ) [219]. Можно также сравнить скорости реакций аскорбиновой кислоты при pH 7 с комплексами Fe -каталазы ( 54 = 300 л-моль -с ) 159], пероксидазы хрена ( 54 = 1,8-10 ) [49] и небелковым Fe -дейтеропорфирином ( 54 10 л-моль 1-с 1) [178]. Реакция с Fe -каталазой идет слишком медленно, чтобы ее можно было практически наблюдать. Таким образом, низкая активность каталазы в реакциях перекиси водорода с пирогаллолом и аскорбиновой кислотой обусловлена необычно низкими значениями констант 54 и 43 (табл. 16). По-видимому, белок в каталазе в действительности подавляет восстановление Fe и Fe такими большими молекулами, как пирогаллол или аскорбиновая кислота (примерно в 1000 раз), но не такими малыми частицами, как нитрит-ион. Как видно из данных табл. 16, эффект ингибирования становится еще больше (примерно в 10 раз) в случае таких реагентов, как гваякол и адреналин. То, что ингибирующий эффект белка обусловлен пространственными за- [c.216]

Лмеется ряд данных, позволяющих сравнить свойства пероксидазы хрена и небелковых железопорфиринов. Были определены константы скорости реакций второго порядка восстановления Ре -дейтеропорфирина до Ре " различными восстановителями при pH 7,4 [178]. По кинетическим данным не обнаружено отклонений от ожидаемого поведения для простой одностадийной реакции. Если считать, что исходный комплекс был правильно идентифицирован как комплекс Ре (а не Ре ), то это означает, что реакция идет в одну двухэлектронную стадию или 54 < 43, так что экспериментально определяемая константа скорости — 54, а не 43- Но, так как в случае пероксидазы хрена константы 54 и 43, по-видимому, различаются не более чем на два порядка, а мы рассматриваем гораздо большие различия в скоростях, можно пренебречь этим различием в константах. Зависимость скорости реакции от pH не изучена. В табл. 18 приведены данные по скоростям реакций пероксидазы хрена и железодейтеропорфирина с одними и теми же восстановителями и в сопоставимых условиях эксперимента. Как отмечено в работе [178], белок, по-видимому, слабо влияет на константы скорости 54 и (или) 43 по сравнению с тем большим эффектом белка, который наблюдается в отношении констант 35 и 53- Другими словами, белок не обладает общим свойством ускорять все реакции или влиять на субстратную специфичность путем изменения относительных скоростей реакций с различными восстановителями. Были также определены константы скорости железопротопорфирина в присутствии 0,3 М гистидина при pH 6,3— 6,5 с восстановителями лейкоформой красителя малахитового зеленого, гваяколом и пирогаллолом [219]. Константы скорости оценивали, исходя из общей каталитической активности в предположении (по аналогии с пероксидазой хрена), что лимитирующая стадия соответствует k s ( 4 в обозначениях авторов), однако нель- [c.217]

Константы скорости реакций второго порядка (кб4 и к4з, л моль 1-с 1) для одноэлектронного восстановления и (пероксидаза хрена [50] — pH 7,0, 25 — 30°С и железодейтеропорфирин [178] — pH 7,4, 25°С) [c.218]

Возможно, наиболее разительным отличием в действии пероксидазы и фумаразы явл5 стся то, что константы скоростей для пероксидазы не зависят от pH в широком интервале значений последних (вероятно, во всем интервале стабильности белка). Это, по-видимому, отражает то обстоятельство, что активным участком фермента является атом железа в восстановительной группе и что ни одна из ионогенных групп фермента непосредственно не вступает в реакцию. Это также означает, что ни в одной из стадий реакции не принимают участия ионы Н" и ОН . Другим отличием является то, что пероксидаза менее специфична, чем фумараза. В схеме реакции роль АНа могут выполнять не только органические молекулы, но и неорганические ионы, такие, как НОг и J. Более того, можно использовать большой ряд перекисей алкилов. [c.746]

Хорошо известно, что в водных буферных растворах в обычном для биологических объектов температурном интервале (0-ь40°С) энергия активации некоторых ферментов увеличивается при понижении температуры и при определенной температуре наблюдается излом в аррениусовской зависимости [637, 638]. Оказалось, что для ряда ферментативных реакций при низких температурах также наблюдаются отклонения скорости реакции от закона Аррениу-са [639]. На рис. 9.1 показана температурная зависимость константы скорости окисления гваякола перекисью водорода, катализируемого пероксидазой [625]. [c.239]

Очень большая константа скорости, наблюдаемая для зтой обратимой реакции, находится в соответствии с представлением о том, что скорость реакции лимитируется диффузией. При этом каждое столкновение иона фумаровой кислоты с активным участком фермента приводит к реакции. То же самое, по-видимому, справедливо для реакции соединения N0 0 железом гемоглобина и Н2О2 с пероксидазой дрожжей. [c.561]

Константа скорости термоинактнвации (Кин) пероксидазы, выделенной из листьев [c.78]

На кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета в течение длительного времени проводятся систематические исследования по изучению влияния УФ-ра-диации на структуру и функции молекул одно- и двухкомпонентных белков (гемоглобина человека и некоторых животных, сывороточного альбух лина, каталазы, пероксидазы, цитохрома с, лактатдегидрогеназы, белков системы комплемента) и их комплексов, иммобилизованных ферментов и биомембран в условиях различного микроокружения, в широком диапазоне pH и температур, в присутствии модифицирующих агентов (серотонина, НА1)(Н), аскорбиновой кислоты, третичного бута1 ола, маннита, а-токоферола и др.). Определены величины г вантовых выходов, констант скоростей, энергии активации и термодинамических параметров реакции фотомодификации белковых молекул. [c.141]

Соединение E, является промежуточной формой пероксидазы с константой перехода в Е 5 с [ han e, 1949Ь]. Константа скорости образования Е, не зависит от pH в диапазоне от 3,5 до [c.37]

Низкие значения константы скорости окисления фенотиазинов, возможно, как в случае с НАДН и аскорбиновой кислотой в первую очередь обусловлены тем, что их окисление пероксидом водорода протекает по одноэлектронному механизму аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы. Поэтому при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы [Лебедева, Угарова, 1996]. Среди изученных фенотиазинов расположение функциональных групп хлорпромазина обеспечивает его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-дианизидином. При этом вначале полностью окислялся хлорпромазин, а затем наблюдалось окисление о-дианизидина. [c.89]

Изучение каталитических свойств пероксидазы, обработанной карбодиимидами, показало, что модифицируемые ими частично маскированные карбоксильные группы располагаются вблизи участка активного центра фермента, ответственного за связывание органического субстрата (о-дианизидина). Объемистые ацилмочевинные остатки экранируют активный центр следствием этого является уменьшение констант скоростей переноса электрона с донора водорода — о-дианизидина — на окисленные формы пероксидазы Е, и Е . В то же время усиливается связывание о-дианизидина с ферментом. Неорганические субстраты связываются в другом участке активного центра пероксидазы, что и проявляется в особенностях механизма их окисления. Возможно поэтому модификация карбоксильных групп, функционально важных для окисления о-дианизидина, не влияет на окисление ферроцианида калия. Дополнительная модификация трех — семи экспонированных в раствор карбоксильных групп пероксидазы нуклеофильными агентами не влияет на каталитические свойства фермента. [c.112]

Электровосстановление пероксида водорода на электродах из NMA T NQ , содержащих адсорбированную пероксидазу, начинается при 0,3-0.5 В. Используя метод вращающегося диска, авторы установили, что этот процесс лимитируется каталитической активностью фермента. Для данной системы /с = 80 мкМ и max = 0,27 мА см . Рассчитанная константа скорости гетерогенной реакции составляет 8,5-10 см с . Эти электроды в сочетании с глюкозооксидазой используют также для конструирования биферментных сенсоров, чувствительных к глюкозе. Принцип работы таких сенсоров - биоэлектрокаталитическое восстановление пероксида водорода, образуемого под действием глюкозооксидазы. [c.222]

В случае механизма Бриггса — Холдейна, для которого 2 -1, отношение кса /Км равно к] — константе скорости связывания фермента и субстрата. В гл. 4 будет показано, что константы скорости связывания должны быть порядка 108 М . с-. Это позволяет сделать вывод, что для механизма Бриггса — Холдейна отношение кса. /Км равно 10 — 10 М С-. Каталаза, ацетилхолинэстераза, карбоангидраза, кротоназа, фумараза и триозофосфатизомераза — все эти ферменты по указанному критерию подчиняются кинетике Бриггса— Холдейна, о чем свидетельствуют данные табл. 4.4. Еше одним ферментом такого типа является пероксидаза, выделенная из хрена,— один из первых ферментов, к которому были применены методы исследования быстрых реакций [3]. Сначала пероксидаза образует с перекисью водорода компекс Михаэлиса, который затем взаимодействует с донором водорода (реакция второго порядка). При достаточно высоких концентрациях донора скорость второй реакции значительно превышает скорость диссоциации комплекса Михаэлиса. [c.114]

Известно, что с разбавлением ферментов возрастают константы скорости их термоинактивации [6], а также константы скорости УЗ-инакти-вации пероксидазы хрена [12], тиреоид-пероксидазы человека [13], Г6ФДГ [11] и других. На рис. 3 показаны зависимости констант скорости суммарной инактивации каталазы (/), ее термоинактивации (2) и УЗ-инактивации (3) при 45°С и обработке раствора ВЧ-ультразвуком (2.64 МГц, 1 Вт/см-), а также зависимость УЗ-инактивации каталазы при обработке ее раствора НЧ-ультра-звуком (20.8 кГц, 62 Вт/см-) (4) от концентрации каталазы в диапазоне от 0.4 до 4.0 нМ. Характер зависимостей всех трех констант скорости от концентрации каталазы (сд) аналогичен при обработке растворов НЧ- и ВЧ-ультразвуком. Как и следо- [c.167]

К сожалению, невозможно сказать, даст ли график линейной зависимости скоростей реакций в стационарном состоянии (либо по Лайнуиверу—Бэрку, либо по Идаю) значение К или /Сщ. Интересно вычислить Км при различных температурах и таким образом установить соотношение между стабильностью комплекса, его реакционной способностью, выраженными соответственно через Км и кз, с одной стороны, и его химическим составом и строением — с другой. Как ни парадоксально, эти сведения можно получить для некоторых бимолекулярных реакций на основании метода стационарных состояний (в действительности определить ki и kz, а также кз), несмотря на то что кинетика этих реакций сложнее, чем рассмотренная здесь это оказывается возможным потому, что второй субстрат допускает изменение еш,е одного фактора, влияющего на скорость, и, следовательно, дает возможность вывести иное уравнение, связывающее константы другим способом. В некоторых реакциях каталазы и пероксидазы удавалось проследить [20] за ростом концентрации комплекса фермент — субстрат на ранних стадиях реакции при использовании методики быстрого смешивания и при спектрофотометрическом измерении концентрации комплекса. Таким способом могут быть определены ki и kz- [c.120]

Скорость образования соединений фермент—субстрат очень велика, и активность фермента лимитируется скоростью распада этого комплекса — константой Михаэлиса—Ментен Кт- Однако величина Кт может меняться в зависимости от того, какой изоэнзим катализирует данную реакцию. Так, Гибсон и Ли проверили два выделенных изоэнзима пероксидазы проростков гороха с искусственными (о-дианизидин и бензидин) и естественными (эугенол, кофейная и феруловая кислоты) субстратами и показали, что величина Кт различается для изоэнзимов этой пероксидазы в зависимости от использования того или иного субстрата. Исследуя изоэнзимный состав пероксидазы в динамике развития проростков гороха с этим пятью субстратами, они установили, что в опытах с кофейной кислотой наибольший пик активности наблюдается на 7-й день после проращивания семян. Методом электрофореза был выявлен изофермент, ответственный за эту реакцию, и выяснено, что он не реагировал с другими субстратами [Gibson, Liu, 1978]. [c.16]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология