Михаэлиса константа определение

Рис. 75. Определение истинной константы Михаэлиса в реакции гидролиза метилового эфира Ы-ацетил-Ь-валина, катализируемого а-химотрипсином, при селективном влиянии ионной силы раствора на константу скорости ацилирования фермента. Концентрации КС1 а — 0,1 М 6 — 0,3 М а — 0,5 М г — 0,8 М ( —1,0 М е—1,5 М ж — 2,0 М 3 — 2,7 М

Рис. 36. Определение максимальной скорости и кажущейся константы Михаэлиса для гидролиза метилового эфира М-ацетил-Ь-ва-лина, катализируемого а-химотрипсином, в координатах Лайнуивера-Берка

Рис. 43. Определение кинетических и равновесных параметров ингибирования к-бутанолом гидролиза гиппурового эфира Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В, с помощью обработки значений каталитических констант (а) и констант Михаэлиса (б) в координатах уравнения (5.14)

Рис. 29. График Лайнуивера— Бэрка. Определение величины константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции [Кт и V)

Определение величины К имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 4.13). Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой К . [c.137]

Из приведенного ранее материала вытекает важное заключение одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта (продуктов). При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис. 4.12, 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. В таких случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, т.е. все молекулы фермента связаны с субстратом. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента. Именно при этих условиях определяют величину максимальной скорости (У ) и значения константы Михаэлиса (К (см. рис. 4.13 4.14). [c.144]

Для определения кинетических и равновесных параметров уравнения (6.27) выражение для кажущейся константы Михаэлиса [c.223]

Величина называемая константой Михаэлиса, представляет собой константу стационарного состояния, величину, характеризующую сродство комплекса к субстрату в процессе течения реакции. Эта характерная для данного фермента величина (постоянная при определенных условиях), может быть определена экспериментально и является наиболее важной константой в химии ферментов. [c.254]

Кинетические параметры У т — максимальная скорость и Кт(кят)— кажущаяся константа Михаэлиса ферментативной реакции— функции констант скоростей индивидуальных стадий (см. соотношения 5.10, 7.2, 7.3). Для раздельного определения этих параметров в общем случае нельзя использовать интегральные методы обычной неферментативной кинетики вследствие смешанного порядка ферментативных процессов. Например, метод Гуггенгейма (см. гл. 2) пригоден для обработки кинетики ферментативных реакций только в случае. т(каж)> [8]о или [Е]о>[8]о, т. е. только при наличии кинетики первого порядка по субстрату или продукту. [c.166]

Предложить аналитический метод определения константы Михаэлиса, исходя из уравнения касательной к кинетической кривой в начальный момент времени и интегральной формы уравнения кинетической кривой ферментативной реакции. [c.175]

Величина константы Михаэлиса Км. для различных систем изменяется от 1 до 10" моль/л. Помимо природы субстрата, она зависит от величины pH, температуры и других факторов. Поэтому ее значение приводят для характеристики конкретных фермент-субстратных систем в определенных условиях. [c.304]

Если константа диссоциации индикатора известна, то измерение глубины окраски, отвечающей отношению а/(1—а), позволяет определить pH раствора. Этот метод часто называют методом Михаэлиса. Чтобы уменьшить солевую ошибку, следует пользоваться формальной константой диссоциации индикаторной кислоты, соответствующей ионной силе исследуемого раствора. При определении значений формальных констант диссоциации индикаторов полезно применять буферные растворы, pH которых измерено электрометрическим методом (стр. 134). [c.144]

Итак, теоретические расчеты авторов работы [14] приводят к выводу о зависимости среднего числа мономерных остатков субстрата, прошедших через активный центр, и среднего числа расщепленных при этом связей не только от строения активного центра, но и от степени полимеризации субстрата. Поскольку эти значения (средние числа) определяют численные величины констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции, то Кт и Ут достигают своих предельных величин при степенях полимеризации субстрата существенно больших, чем число сайтов в активном центре фермента. Таким образом, по мнению авторов работы [14], характер зависимости величин Кт или Ут (или их отношения) от степени полимеризации субстрата не может быть использован для определения числа сайтов в активном центре фермента. Здесь следует отметить, что именно на последнем подходе в значительной степени базируется концепция картирования активных центров, разработанная Хироми и сотр. С другой стороны, формальный подход, используемый для расчета степени множественной атаки, приводит к тому, что с его помощью нельзя объяснить специфичность действия эндоглюканаз по отношению к длинным субстратам по сравнению с короткими (см. [14]). Видимо, в основе подобного несоответствия подхода определенным экспериментальным данным опять лежит (как в подходе Хироми) предположение о некой характеристической константе скорости расщепления связей субстрата в активном центре, независимо от числа занимаемых центров и степени полимеризации субстрата. Это общий недостаток многих теоретических концепций о расщеплении полимерных субстратов разрабатываемых в последнее время. [c.101]

Изменив константу Михаэлиса (А ), которая характеризует прочность связывания субстрата с ферментом, и максимальную скорость превращения субстрата в продукт при определенных условиях, можно повысить общую каталитическую эффективность (реакции тзх Р вна полному количеству фермента умноженную на каталическую константу [c.158]

Значение константы Михаэлиса может быть использовано для определения концентрации субстрата, необходимой для получения максимальной скорости реакции, а так же при решении вопроса об идентичности ферментов, полученных из различных источников. Для различных классов ферментов значения константы Михаэлиса обычно сильно отличаются. В табл. 29 приведены значения константы Михаэлиса для некоторых ферментов. [c.257]

При определении Кт(каж) следует принимать во внимание существенную зависимость от количества иммобилизованного фермента, как это следует из табл. 12.4, где приведены константы Михаэлиса для нативного трипсина и трипсина, связанного в различных количествах с поливиниловым спиртом [33, 34]. [c.431]

Таким образом, эта величина более определенная, чем константа Михаэлиса, хотя она и характеризует кинетику лишь одной, последней стадии реакции. Измерение максимальной скорости ферментативной реакции составляет обязательный этан изучения кинетики любого ферментативного процесса. [c.56]

В случае кинетического исследования двухсубстратных реакций при выборе некоторых специальных условий экспериментов можно получить приближенное решение задачи определения кинетических констант. Во всех рассмотренных здесь случаях удается получить уравнения для начальной стационарной скорости реакции, аналогичные уравнению Михаэлиса [ср. уравнение (VII.5), (VII.6), (VII. 10)]. При этом, однако, необходимо иметь в виду, что физический смысл постоянных членов этих уравнений зависит от конкретной схемы реакции и выбранных условий эксперимента. [c.71]

Таким образом, если методически возможно определение К ферментативной реакции при различных температурах, то, выражая экспериментальные данные графически в координатах 1п/(5 (или lg Кз) против 1/Т, представляется возможным вычислить изменение энтальпии АН системы при образовании комплекса Михаэлиса. Для того чтобы не ошибиться в знаке АН, необходимо иметь в виду условность выражения константы равновесия через константы скорости прямой и обратной реакции. В физической химии принято, что константой равновесия Кр реакции [c.128]

Во-первых, для ацетилхолинэстераз характерно субстратное торможение, которое при работе с концентрациями ацетилхолина, приближающимися к насыщению фермента, может искажать результаты определения Кт- С этой точки зрения мы склонны придавать большее значение величинам констант Михаэлиса, измеренным [c.158]

Приведенные выше данные о величинах констант Михаэлиса для реакций, катализируемых холинэстеразами, не позволяют считать, что эти константы могут однозначно характеризовать сродство субстрата к ферменту — нередко низкие значения Кт (т. е. высокое сродство ) сочетаются с относительно невысокой скоростью реакции, и наоборот. Это вполне естественно, поскольку скорость реакции при прочих равных условиях есть функция не только константы скорости распада фермент-субстратного комплекса +2, но и константы Михаэлиса. Положение осложняется еще и тем, что последняя константа определяется не только но и другими константами. Таким образом, влияние как и влияние Кт, на скорость реакции зависит от соотношения величин констант скорости отдельных стадий процесса. В связи с этим в настоящее время предпринимаются попытки раздельного определения констант скорости известных стадий реакций, катализируемых холинэстеразой. [c.163]

Получены ферменты в кристаллической форме, расщепляющие ксиланы [51]. Некоторые высокоочищенные ферменты характеризовались более широкой субстратной специфичностью и помимо связей в ксилане расщепляли кристаллическую целлюлозу [52, 70], карбоксиметилцеллюлозу [75] и крахмал [44, 75]. На юсновании этого высказано предположение [75], что расщепление ксилаиа и целлюлозы катализирует один и тот же активный центр фермента. Однако более подробное определение оптимальных параметров ФГ ксилана и карбоксиметилцеллюлоз, т. е. pH соответственно 4,8 и 4,0), термостабильиости, чувствительности к ингибиторам и значений константы Михаэлиса (константа Миха-элпса — концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от. максимальной), показывает, что имеются отдельные катализирующие центры для каждого иолисахарида [44]. [c.225]

Константа Михаэлиса в определенной мере характеризует сродство фермента к субстрату. Так как эта величина является аналогом константы диссоциации комплекса Е8, то чем ниже А м, тем выше сродство. В то же время Кц, как следует из (6.6), превышает констант диссоциации коьшлекса Е8. Как видно нз уравнения (6.9), А м численно равна значетио а, при К07 0р0м достигается значепие скорости, равное половине от К ах- [c.211]

Кинетические методы основаны на завнсимости скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов и фермента, а также присутствующих в среде активаторов или ингибиторов. Если анализируемым веществом является субетрат ферментативной реакции, то для определения его концентрации не обязательно доводить реакцию до конца и достаточно определить любым методом начальную скорость реакции, к-рая при прочих равных условиях (концентрация фермента, второго субстрата, величина pH, темп-ра и т. д.) зависит от концентраций этого вещества. Характер этой зависимости определяется законами ферментативной кинетики (см. Ферменты, Михаэлиса константа), он может быть найден эмпирически п выражен в форме калибровочного графика, используемого для нахождения концентрации определяемого вещества по найденной экспериментально скоростп ферментативной реакции. Любой из приведенных выше прямых Ф. м. а. с участием одной ферментативной реакции может быть использован как кинетич. метод. Если же применяется комбинация из нескольких реакций, то скорость индикаторной реакции может служить мерой концентрации субстрата первой вспомогательной реакции в том случае, если предварительно эта реакция доводится до конца. [c.206]

Зависимость констант Михаэлиса кз и Км от pH мон ет быть весьма сло кной. Поэтому для исследования зависимости от pH србды требуется использование буферных растворов. При этом нередко оказывается, что между компонентами буферного раствора (особенно НРО ") и ферментом имеется определенное взаимодействие. Кроме того, влияние на активность белка и активность субстрата также оказывает ионная сила раствора, что еще в большей стенени усложняет интерпретацию процесса в буферном растворе. Этот факт не всегда принимался во внимание. Во всех уравнениях, применявшихся в этом разделе, концентрации должны быть заменены на активности. Когда концентрация субстрата меняется в широком диапазоне, то поправка на активность может быть весьма существенной. Например, изучение скорости реакции уреаза — мочевина в диапазоне концентрации мочевины от 0,0003 до 2,0 М показало, что при высоких концентрациях мочевины скорость реакции надает [112]. Это может быть связано с изменением активности, а не механизма реакции. [c.564]

Сопоставляя па данном этапе рассмотрения концепции Хироми и Тома, мы видим, что отнесение константы Михаэлиса к соответствующим микроскопическим параметрам в рамках обеих концепций идентично (сравните выражения 14 и 15, с одной стороны, и 43 — с другой). Однако смысл каталитической константы в обеих концепциях различается (см. выражения 17 и 44). Если по гипотезе Хироми каталитическая копстапта пропорциональна гидролитическому коэффициенту ко, который является строго характеристическим для данного фермента, и определяется исключительно соотношением констант ассоциации субстрата в продуктивном и непродуктивном фермент-субстратном комплексах (17), то по гипотезе Тома величина гидролитического коэффициента зависит от способа связывания фермента с субстратом и от степени полимеризации последнего. На наш взгляд, это придает настолько больн1ую гибкость расчетам на основании концепции Тома, в особенности с помощью машинного анализа, что может в отдельных случаях делать бессмысленными определения показателей сродства индивидуальных сайтов активного центра. фермента, поскольку все наблюдаемые кинетические эффекты могут быть объяснены в рамках вариации гидролитического коэффициента при изменении структуры олигомерного субстрата и способов его связывания с ферментом. То же можно отнести и к определению константы скорости второго порядка ферментативного расщепления субстрата (см. выражения 18 и 45). [c.65]

Кажущаяся величина константы Михаэлиса для субстратов (фрук-тозо-6-фосфата и АТФ) зависит от pH реакционной среды, в которой проводится определение ферментативной активности и от концентрации второго субстрата. В зависимости от условий эксперимента она может изменяться в широких пределах для фруктозо-6-фосфата — от [c.238]

Определение константы Михаэлиса для АТФ и ИТФ. Все измерения проводят в присутствии КНЗОз в конечной концентрации 5 мМ, который добавляют для снижения ингибирующего действия АДФ [c.476]

Фермент катализирует р-ции, в к-рых участвуют, как правило, один или два субстрата. В односубстратной р-ции концентрация субстрата [З],, пропорциональна скорости процесса Уц только при условии [8]оСЛГ1 . где К -константа Михаэлиса. Следовательно, верхняя фаница определяемых содержаний лимитируется, как правило, величиной Предел обнаружения и ниж. фаница анализируемых содержаний субстрата определяются обычно той величиной Vo, к-рая м. б. зафиксирована выбранным инструментальным методом. Чем меньще величина Уц и чем выще каталитич. константа скорости и концентрация [Е]о фермента, тем ниже предел обнаружения и нижняя фаница определяемых содержаний субстрата. Для двусубстратных р-ций при определении субстрата 8, субстрат 82 берется в насыщенных концентрациях и двусубстратная р-ция сводится к односубстратной. [c.78]

Рис. 16.1. Типы анаморфоз, используемые для определения параметров уравнений Михаэлиса [К - константа Михаэлиса Ущах - максимальная скорость 1-3 соответствуют системам, различающимся параметрами (а), К (б) нли концентрацией субстрата (д))

Лля определения активности и изучения кинетики действия ферментов по отношению к НФГ реакцию останавливают защела-чиваш1ем и регистрируют количество НФ в видимой области (при 405 нм) [56]. Однако, более удобным является фотометрический метод непрывной регистрации кинетики образования НФ в кислой области при 346 нм — в изобестической точке п-нитрофенолят иона [3, 57]. Следует иметь ввиду, что целлобиазы и / -глюкозидазы значительно различаются константами Михаэлиса по отношению к НФГ. Методика определения / -глюкозидазной активности изложена в разделе 5.6. [c.141]

В некоторых случаях для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции более перспективным является метод Эди—Хофсти. При использовании этого метода на оси ординат откладывают и, на оси абсцисс — и/[8]. Полученная прямая линия отсекает на оси ординат отрезок, равный а с осью абсцисс образует угол а, тангенс которого равен (рис. 6.7). [c.75]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

В дальнейшем основное внимание было обращено на исследование процессов образования ацетатных и смешанных окси-ацетатных комплексов трехвалентного железа непосредственно в растворах. Поскольку ионы двух- и трехвалентного железа образуют обратимую окислительно-восстановительную систему, то изменение окислительного потенциала, наблюдаемое при образовании комплексных соединений, позволяет определить концентрацию потенциалопределяющих ионов Ре " и Ре и найти состав комплексных соединений и их константы образования [13—15]. Михаэлис и Фридгейм [16], изучив большое количество систем, включающих комплексы трех- и двухвалентного железа с различными анионами, установили, что каждый комплекс существует в определенной области pH и что в зависимости от природы комплексообразующего адденда окислительный потенциал меняется в довольно широком интервале. Ими также показано, что ионы трехвалентного железа обладают большей тенденцией к комплексообразованию, чем ионы двухвалентного железа. Как правило, в том случае, когда аддендом является анион, комплексы Ре " более устойчивы, чем комплексы Ре +, и относительная устойчивость комплекса увеличивается с зарядом адденда. Если же аддендом является нейтральная молекула, то в некоторых случаях было установлено, что комплекс Ре (II) более устойчив [17]. Известно, что повышение pH растроров, содержащих как ионы трех-, так и ионы двухвалентного железа, приводит к их гидролизу, который также сопровождается изменением окислительного потенциала [18—23]. Причем гидролиз иона Ре " " наступает при более низком pH, чем гидролиз иона Ре " [24-27]. [c.204]

Рис. 4. Определение предельной скорости (Wтал) и константы Михаэлиса (Хм) по уравнению (5) для гидроперекиси этилбензола

Из уравнения (VII 1.8) следует, что константа игибитора определяется не только величиной /во, но зависит также от константы Михаэлиса и от концентрации субстрата. Вследствие этого величина /бо для рассматриваемых здесь ингибиторов не может служить адэкватной мерой их реакционноспособности. Однако, если известны величины Кт и концентрация субстрата, при которой велось определение, то по величине /50 может быть рассчитана Ki- [c.88]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология