Методы измерения концентрации белка

Определение белка. Для определения белка используют метод Лоури (с. 81). При спектрофотометрическом измерении определяют оптическую плотность при 280 нм и рассчитывают концентрацию с помощью коэффициента Л им =9,0. [c.217]

Измерение спектров дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД) получило широкое распространение как метод конформационного анализа оптически активных соединений. Особенно методы ДОВ и КД используются в органической химии, биохимии, энзимологии и молекулярной биологии. Данными методами исследуются белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, стероиды, углеводы и полисахариды, вирусы, митохондрии, рибосомы, фармакологические средства, синтетические полимеры, координационные соединения, неорганические и редкоземельные комплексы, кристаллы, суопензии и пленки и т. п. и решаются следующие задачи 1) определение по эмпирическим пра вилам конформации и ее изменений под действием различных физико-химических воздействий 2) изучение механизма и кинетики химических реакций (особенно ферментативных) 3) получение стереохимических характеристик 4) измерение концентраций оптически активных веществ 5) определение спиральности макромолекул 6) получение электронных характеристик молекул 7) исследование влияния низких температур на конформацию соединений 8) влияние фазовых переходов типа твердое тело — жидкость — газ на изменение структуры. [c.32]

Метод определения молекулярной массы по величине осмотического давления нашел широкое распространение для высокомолекулярных веществ. Измерение величин других коллигативных свойств в этом случае нецелесообразно, так как закон Рауля выполняется только при очень малых концентрациях растворенных высокомолекулярных веществ, при которых чувствительность мала например, 0,001 т раствор белка с молекулярной массой М=10 000 дальтон содержит 1 г вещества в 100 г воды. [c.147]

При выделении препарата мембран оценивают количественный выход белка. Метод Лоури (1951) - наиболее распространенный и высокочувствительный метод определения концентрации белка, основанный на измерении интенсивности окраски раствора, зависящей от концентрации белка. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии белка с реактивами, используемыми в определении, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них — биуретовая реакция между пептидными группами и ионами меди. Возникающая сине-фиолетовая окраска обусловлена об- [c.232]

Метод Лоури приблизительно в 100 раз чувствительнее биуретового метода и в 10—20 раз спектрофотометрического метода измерения концентрации белка по поглощению света с длиной волны около 280 нм (ультрафиолетовая область). С помощью метода Лоури можно определить количество белка в растворе, если его содержание составляет 10—20 мкг в 1 мл, [c.20]

Помимо исследования пространственных структур в растворах и студнях желатины (трехмерные структуры) мы изучали образование и структурно-механические свойства поверхностных (двухмерных) слоев желатины, самопроизвольно образующихся на границе раздела фаз. Двухмерное состояние белков имеет важное биологическое значение. Был разработан удобный и достаточно точный статический метод измерения поверхностного натяжения белковых растворов по определению размеров большой лежачей капли или пузырька 103, 104]. С помощью этого метода изучена кинетика понижения поверхностного натяжения водных растворов желатины в зависимости от концентрации и pH среды. Весьма специфичной оказалась зависимость поверхностного натяжения от pH (максимум при рН = 3 и минимум при рН = 4,9) в кислой области и изоэлектрической точке наблюдается значительно большие снижения поверхностного натяжения, чем в щелочной среде. Изучена кинетика образования и дальнейших структурных изменений адсорбционного слоя желатины — весьма медленных процессов. В ходе этих исследований был разработан новый метод и аппаратура для изучения процессов адсорбции и десорбции поверхностно-активных веществ на жидкофазных границах (Р. А. Кульман) [103]. [c.400]

Обычным методом измерения концентрации ионов по электродному потенциалу является измерение концентрации водородных ионов (или pH) с водородным электродом. Титрование дает количество кислоты независимо ОТ степени кислотности раствора, измерение pH характеризует эту кислотность. Например,. на титрование 20 мл 0,1 н. соляной. кислоты идет столько же КОН, сколько на такое же количество уксусной. Измерение же pH покажет, что в нервом растворе pH = 1, а во втором — около 3. Для измерения pH можно применять индикаторы (стр. 502) однако в случае очень сильно окрашенных жидкостей, присутствия большого количества белков и солей или необходимости иметь очень точные данные для [Н ]— индикаторные методы не применимы и приходится обращаться к методам электрометрическим. [c.430]

Применение люминесценции для аналитических целей включает широкую область использования ее для идентификации веществ, для обнаружения малых концентраций веществ для контроля изменений, претерпеваемых веществом для определения степени чистоты веществ. Широко применяются измерения люминесценции при изучении кинетики обычных химических реакций. Высокая чувствительность метода позволяет фиксировать малую степень превращения, а иногда по люминесценции промежуточных соединений становится возможным установить механизм химической реакции. Люминесцентные методы используются в биологии, в частности, для исследования структуры белков методом флуоресцентных зондов и меток. [c.49]

МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА [c.310]

Принципиально возможно определение коэффициентов седиментации и, следовательно, приблизительных молекулярных масс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативной активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в ба-кет-роторе). Обычно в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седиментации s. Вещества с различными седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугирования в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от мениска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая [c.130]

Это быстрый и удобный метод измерения концентрации растворенных белков, основанный на количественном связывании белков с красителем. Он не применим для измерения белка в рассеивающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определению белка этим методом сравнительно невелико, краситель реагирует более или менее сильно с различными очищенными белками. Поэтому определение концентрации различных по составу белков этим методом лишь до некоторой степени количественное. К преимуществам метода можно отнести быстроту определения (10 мин) и высокую чувствительность. К недостаткам — варьирование результатов при определении концентраций различных белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей на определение. [c.140]

Остается сказать о том минимуме основного оборудования, который должна иметь в своем распоряжении каждая лаборатория по очистке ферментов. Активность ферментов обычно измеряют с помощью спектрофотометрических или радиохимических методов. Если все определения проводят спектрофотометрическим способом, то можно обойтись и без сцинтилляционно-го счетчика. Спектрофотометр же обязательно должен быть в лаборатории, так как он требуется, кроме того, и для измерения концентрации белков (разд. 8.5). К оборудованию первой необходимости относится спектрофотометр с УФ-лампой, желательно с самописцем для записи хода реакций во времени. [c.11]

К наиболее широко применяемым методам определения концентрации белка относятся следуюш ие биуретовая реакция, метод Лоури, метод Гринберга, метод Бредфорда, измерение поглош ения в ультрафиолетовой области спектра. [c.45]

Например, измеренное осмотическое давление раствора яичного альбумина при концентрации белка 34 г/л оказалось равным 2270 Па. Такое давление соответствует 0,001 М раствору [см. уравнение (П1.4)] и, следовательно, М = 34/0,001 = = 34000. Соответствие этого значения значениям М, найденным другими независимыми методами, показывает, что уравнение (1П.4) применимо не только к молекулярным, но и к коллоидным растворам. [c.34]

Определение белка методом Уодделя [12] основано на дифференциальном измерении поглощения при 215 и 225 ммк. Белковый раствор разбавляют раствором Na l (9 г/л) до тех пор, пока экстинкция при 215 ммк не станет меньше 1,5. Разность экстинкции при 215 и 225 ммк, умноженная на 144, показывает концентрацию белка в исследуемой пробе в мг/мл. При работе с индивидуальным белком при определенных условиях возможно точное измерение концентраций белка порядка 5 мкг/л. Из наблюдений Мерфи и Киса [13], Списа и др. [14] и Бендиксена [15] можно вывести некоторые важные замечания [c.270]

При высоких концентрациях полимеров скорость образования адсорбционного слоя несколько увеличивается. С этими результатами хорошо согласуются литературные данные, по которым минимальное значение межфазного поверхностного натяжения водных растворов белков и полимеров на границе с предельным углеводородом достигается в течение нескольких часов [149 . Однако следует отметить, что равновесное значение поверхностного натяжения, измеренное методом висящей капли, устанавливается раньте достижения предельного значения межфазной прочности. Например, для сывороточного альбумина, яичного альбумина и лизоцима равновесное значение поверхностного натяжения достигалось примерно через 30 жик, а предельное значение прочности— через 2—3 час. Это указывает на то, что метод определения Ps более чувствителен к изменениям, происходящим в межфазных слоях, чем метод измерения поверхностного натяжения. [c.213]

В ходе выделения белков обычно требуется иметь подходящий метод контроля эффективности процесса. Для определения концентрации белка в растворе пользуются количественным методом, который основан на измерении интенсивности поглощения (рис. 5) в ультрафиолетовой области спектра при длинах волн около 280 ммк, где поглощение в основном зависит от присутствия в белках ароматических аминокислот — триптофана I и тирозина II [c.19]

Для понимания поведения белков в центробежном поле полезно рассмотреть устройство ротора ультрацентрифуги (рис. 5.1), а также обсудить изменение концентрации белка в ячейке ультрацентрифуги в процессе седиментации (рис. 5.2). В результате постепенного изменения концентрации белка через некоторое время образуется четкая граница между растворителем и раствором белка. Измерение положения этой границы в зависимости от времени позволяет определить константу седиментации, являющуюся функцией молекулярной массы. За скоростью седиментации можно следить с помощью нескольких методов. Один из них заключается в следующем через кювету пропускают ультрафиолетовый свет (230— 290 нм) и регистрируют его поглощение (величина которого про- [c.126]

Определение белка. Для определения концентрации белка методом Лоури необходимо предварительно осадить его трихлоруксусной кислотой (с. 81). Спектрофотометрическое измерение можно проводить при условии, когда из раствора фосфорилазы удален АМФ, при этом отнощение Л260М280 равно 0,52—0,55 для расчета используют коэффициент А ° 1см= 13,2 при 280 нм. [c.221]

Тирозин и триптофан (в незначительной степени также и фенилаланин) поглощают ультрафиолетовое излучение с максимумом поглощения при 280 нм. На этом основан спектрофотометрический метод измерения концентрации белков в растворах. Белки можно определять также колориметрически с помощью цветных реакций. В щелочной среде ионы двухвалентной меди образуют с пептидными группами комплексы, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Но чаще всего применяют более точный метод Лоури. Он основан на комбинации би-уретового реактива со специальным реактивом на ароматические аминокислоты. [c.53]

Концентрация свободных ионов кальция в тканях чрезвычайно низка, и до последнего времени не существовало надежного метода для ее количественной оценки. Сейчас в этих целях используют метод, основанный на измерении интенсивности кальций-зависимой флуоресценции белка экворина (гл. 13, разд. 3). [c.375]

Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20]

Это наиболее простой и быстрый метод измерения количества белка в содержаищх его нерассеивающих растворах. Преимуществами метода является быстрота и неизменность пробы до и после анализа. К недостаткам следует отнести то, что метод не является строго количественным, так как основан на поглощении тнрозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. Поэтому различные белки имеют разные коэффициенты поглощения, а если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не будет поглощать при 280 нм. Метод применим для измерения концентраций белка и в растворах смесей белков. [c.139]

Матерталы и методы. Бычий сывороточный альбумин фирмы СаШшсЬеш метили по свободной сульфгидрильной группе ма-леимидаой спиновой меткой, как описано в работе [12]. После снин-мечения белок переводили диализом в фосфатный буфер (50 мМ, pH 7,5). Измерения проводили при концентрации белка не выше 10" М. [c.243]

Сильное светорассеяние, обусловленное матрицей, может затруднять измерения. Однако концентрация белков в иммобилизованных ферментах достаточно высокая. Следовательно, оптическая плотность растворов белков в области полос поглощения, как правило, высока. Таким образом, поглощение света эффективно конкурирует со светорассеянием. При возбуждении свет поглощается очень тонким слоем поверхности конъюгата белок — матрица, и поэтому флуоресценцию следует наблюдать с фронтальной части поверхности носителя с иммобилизованным белком. Кро.ме того, поскольку излучение имеет большую длину волны по сравнению с длиной волны при возбуждении,. флуоресценция может быть легко отделена от светорассеяния. Гейбл и др. [26] описали кювету, с помощью которой им удалось методом флуоресценции исследовать конформационные изменения иммобилизованных трипсина и химотрипсина, вызываемые мочевиной, нагреванием или присутствием специфических лигандов. Поскольку эту кювету не всегда можно применять, Барел и Рузенс [3] сконструировали очень простую цилиндрическую флуоресцентную кювету, схема которой показана на рис. 9.5. [c.253]

Александер и Речниц [564] исследовали возможность непосредственного контроля изменений концентрации белка или его структуры в различных химических реакциях и потенциометрического измерения скорости этих реакций. Александер и Речниц [574] изучали возможность прямого определения изменения концентрации белка в сыворотке крови с помощью Ag2S-мeмбpaннoгo электрода, изготовленного по ранее описанной методике [574]. Предложенный метод основан на измерении активности свободных ионов серебра после осаждения меркаптидов серебра, образовавшихся при взаимодействии серебра с серосодержащими группами белков. Электрод подготавливают к работе непрерывным 48-часовым встряхиванием в растворе, содержащем нитрат серебра (6-10 М) в изотоническом физиологическом растворе и боратный буфер (0,015 М борной кислоты и 0,00375 М бората натрия), при pH 8,4. После такой подготовки потенциал электрода быстро отзывается на изменение концентрации. Значение потенциала можно измерять уж через 100 с после погружения электродов (индикаторного электрода и электрода считывания) в исследуемый раствор. [c.193]

Интерес к определениям содержания белка в серуме крови или плазме с помощью измерений удельного веса особенно вырос после опубликования работы Барбура и Гамильтона [131] о простом микрометоде определения удельного веса растворов. Измерялось время падения капли образца сквозь 30 см смеси ксилола и бромбен-зола, имеющей плотность немного меньшую, чем у образца. При сравнении со стандартным раствором сульфата калия известного удельного веса может быть сразу рассчитан неизвестный удельный вес. При соответствующей температурной поправке предельная точность была + 0,0001. Моор и Ван-Сляйк [132], главным образом с помощью пикнометрического определения удельного веса, изучали серум крови и вывели коэфициенты для расчета концентрации белка из измеренного удельного веса. Они нашли, что концентрация в 7г белка на 100 дает плотность около 1,027, которая изменяется линейно на 0,0029 на 1 г белка. Предельная точность метода падающей капли соответствует предельной определимой концентрации, равной около +0,05 г на 100 мл. Моор и Ван-Сляйк показали различие в 0,6 г белка на 100 мл между методом удельного веса и газометрическим микрокьельдалем Ван-Сляйка [133]. Это различие представляет сумму экспериментальных отклонений в обоих методах, прибавленную к недостоверности сделанных выше основных предположений, а также недостоверности в интерпретации метода Кьельдаля. Колебания между пикнометриче- [c.29]

Таким образом, эта величина равна среднему значению v между с = О и с = с. Поэтому ее следует определять при различных концентрациях и затем экстраполировать к с = 0. Обычно плотность определяют пикнометрически. Однако существуют более точные методы измерения плотности [174, 175], для которых требуется достаточно малое количество раствора. Известная неопределенность возникает в вопросе о концентрации, так как может оставаться сомнение в том, что сухой гликонротеин совершенно не содержит воды. В большинстве случаев парциальный удельный объем определяют нри одной-двух концентрациях, лежащих в пределах 1%, причем постулируется идеальность раствора. Эта несколько сомнительная методика может быть экспериментально проверена для тех белков, для которых с помощью более надежных методов (см., например, [175]) под-тверн дена идеальность поведения в этой области концентраций с точностью 1% или выше, а также для тех соединений, для которых значение v было когда-либо подтверждено с точностью того же порядка при помощи обычной пикнометрической методики. Было высказано предположение [176], что парциальный удельный объем белка можно вычислить, если известны парциальные удельные объемы входящих в его состав аминокислотных остатков. Для этого используют следующую формулу (разумеется, необходимо располагать данными полного анализа белка) [c.69]

Определение белка. Для определения концентрации фосфоглюкомутазы используют метод Лоури (см. с. 81). При спектрофотометрическом измерении регистрируют оптическую плотность при 278 нм, учитывая, что Л °А1см=7,0. [c.228]

Достоинства метода Бредфорда заключаются в быстроте анализа и вое-п[>оизводимости результатов, но не всегда графики зависимости поглощения прп 595 нм от количества белка линейны и угол наклона кривой для разных белков сильно варьирует [289, 377]. Поэтому график, полученный для белка-стандарта, может быть неприменим без соответствующих поправок к неизвестному белку. Наиболее достоверные результаты [303] дает измерение поглощения белка при 280 нм (при концентрации белка >50 мкг/мл) или 205 нм (при концентрации белка <50 мкг/мл). [c.298]

Во вторсм исследовании показана возможность применения метода для измерения очень низких концентраций белков. В тиро-г идной эндокринологии постоянно ощущается потребности в высокочувствительных методиках определения тироидстимулирующего [c.229]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

Эритроциты в крови можно по ряду свойств рассматривать так же, как частички гидрофобной эмульсии. На их поверхности адсорбированы молекулы белков, аминокислот и ионы электролитов. Все они сообщают эритроцитам определенный отрицательный заряд, а противоионы создают некоторый диффузный слой. При различных патологических процессах в организме, когда в кровн увеличивается содержание некоторых видов белков (либо особого глюкопротеида, относящегося к а-глобулинам, либо при инфекционных заболеваниях Y-глoбyлинoв), происходит процесс, очень напоминающий ионообменную адсорбцию место ионов электролитов на поверхности эритроцитов занимают белки, заряд которых ниже, чем у суммы замещенных ими ионов. В результате заряд эритроцитов понижается, они быстрее объединяются и оседают (ускоряется реакция оседания эритроцитов — РОЭ). Этот процесс зависит еще от ряда факторов содержания других белковых фракций и мукополисахаридов, концентрации эритроцитов в крови, наличия в крови микробов, наконец, расположения сосуда, в котором наблюдается РОЭ (в частности, скорость ее выше в наклонно расположенном капилляре). Оседание эритроцитов протекает сходно с процессом седиментации гидрофобного коллоида. Как показали исследования при помощи микрокинематографии (Кигезен), к имеющимся в крови агрегатам и монетным столбикам присоединяются отдельные эритроциты укрупнившиеся агрегаты оседают вначале быстро, а потом медленнее, так как в нижних частях капилляров их расположение становится настолько плотным, что частично сохранившиеся у них заряды начинают в большей мере противодействовать сближению частиц. Структура этого осадка напоминает губку чтобы его уплотнить, необходимо выжать оттуда воду, причем чем плотнее осадок, тем труднее это достигается. Поэтому в клинических исследованиях обычно не ожидают завершения оседания эритроцитов, а регистрируют результаты спустя 1—2 ч после начала реакции. Учитывая, что скорость процесса меняется на разных этапах, было предложено изучение его динамики измерением величины оседания эритроцитов каждые 15—30 мин (так называемая фракционная РОЭ). Этот метод представляет значительный интерес и находит широкое применение. [c.167]