Белки флуоресценция, измерение

Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции [c.421]

Общая теория флуоресценции 415 Аппаратура для измерения флуоресценции 418 Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции 421 [c.579]

Иногда необходимо знать абсолютные квантовые выходы (F) (стр. 169). Прямое определение F требует измерения поглощенных и испускаемых квантов во всей области частот с поправками на рассеянный свет, повторное поглощение и на эффекты преломления. Относительное число квантов, испускаемых за секунду флуоресцирующим раствором, можно определить при помощи счетчика квантов , представляющего собой комбинацию второго флуоресцирующего раствора (например, родамина В в глицерине) и фотоумножителя так как выходы флуоресценции не зависят от длины волны возбуждающего света (выше длинноволнового предела), реакция этой системы зависит от числа поглощенных квантов независимо от длины волны [14, 15]. Число падающих квантов определяется тем же счетчиком квантов после замены второго раствора поверхностью окиси магния, способность которой рассеивать свет известна, или еще лучше очищенным раствором белка, рассеивающую способность которого можно вычислить. Тогда из данных измерения поглощения света можно найти число квантов, поглощенных флуоресцирующим раствором. Отношение числа излученных квантов к числу поглощенных квантов дает величину F. Для бисульфата хинина в воде, например, принято значение 0,55 [15]. [c.158]

Метод заключается в измерении интенсивности флуоресценции хромофорных группировок триптофана и тирозина в области 340—350 нм под действием УФ-облучения (280—290 нм). Наибольший вклад вносит флуоресценция индольного хромофора триптофана, наиболее чувствительная к структурным изменениям исследуемого белка. Наименьший вклад вносит флуоресценция остатка фенилаланина. По чувствительности флуоресцентный метод на три порядка превосходит спектрофотометрию при 280 нм, однако здесь предъявляются более высокие требования к природе и чистоте элюента. К другим факторам, ограничивающим применение метода, относится различная зависимость интенсивности флуоресценции от pH среды у разных типов белков. [c.459]

Наряду с измерением параметров собственной флуоресценции белка (трипто-фановых остатков) большое значение имеет изучение свечения экзогенных фосфо- [c.270]

С повышением концентрации детергентов флуоресценция усиливается. Конечная концентрация SDS должна быть ниже 0,01%, Тритона Х-100 — ниже 0,001%, других детергентов — ниже 10 мкг/мл. Флуоресценция одноцепочечной геномной ДНК примерно вполовину менее интенсивна по сравнению с двухцепочечной ДНК эквивалентной концентрации. Поэтому при измерении концентрации одноцепочечной ДНК стандартная ДНК тоже должна быть одноцепочечной. Если проба содержит высокий уровень белков, которые могут увеличивать уровень шумов, предварительная обработка пробы Протеиназой К может снизить флуоресцентный фон. [c.184]

Истон и др. [329] определяли белки в полиакриламидном геле по их естественной флуоресценции. Для ее возбуждения использовали свет с длиной волны 280 нм, измерение же проводили при 340 нм. Метод основан на флуоресценции триптофана, интенсивность которой линейно зависит от его содержания в белках. При соответствующих условиях получаемый сигнал прямо пропорционален концентрации излучающего вещества. Таким путем можно выявить 1 — 10 мкг белка [614]. [c.183]

При измерении рассеяния света на крупных частицах белков или нуклеиновых кислот иногда серьезной помехой служат поглощение и флуоресценция. [c.452]

Многие мембранные преобразователи энергии содержат разного рода группы, поглощающие свет. Таковы не только пигменты фотосинтеза, но и гемы цитохромов, флавины и некоторые другие группировки редокс ферментов. Измерение спектров поглощения или флуоресценции этих групп служит полезным орудием анализа быстрой кинетики транспорта зарядов. В некоторых случаях с той же целью измеряют поглощение или флуоресценцию ароматических аминокислотных остатков в белках-преобразователях энергии. [c.42]

В основе использования измерений собственной флуоресценции белков лежат эмпирические правила , полученные при изучении модельных соединений с хорошо известной структурой и конформацией. Обычно применяемые правила представлены в табл. 15.1. Следующие примеры иллюстрируют, как некоторые из этих правил используются на практике. [c.422]

В следующих примерах показано, как, проводя простые измерения флуоресценции, можно делать довольно серьезные заключения о структурных особенностях белков. Необходимо отметить, что во многих случаях можно ограничиться измерением относительной флуоресценции. (Выражение свободная аминокислота всегда означает, что аминокислота растворена в воде.) [c.423]

АНС — флуоресцентный зонд, нековалентно связывающийся с белками и неполярными областями мембран. При связывании АНС с бе,л-ками или мембранами его флуоресценция значительно возрастает, так как квантовый выход флуоресценции АНС зависит от полярности его окружения и увеличивается в гидрофобных средах. Максимум возбуждения АНС — 360 нм, максимум флуоресценции — 460—480 нм (в зависимости от полярности микроокружения). При работе с препаратами СР измерение флуоресценции проводят в среде, содержащей 100 мМ КС1, 0,5 мМ ЭГТА и 50 мМ имидазол, pH 7,0. Концентрация белка СР в кювете — 0,3—0,5 мг/мл, концентрация АНС — от 5 до 75 мкМ (в зависимости от чувствительности прибора и поставленной задачи). [c.366]

Концентрация свободных ионов кальция в тканях чрезвычайно низка, и до последнего времени не существовало надежного метода для ее количественной оценки. Сейчас в этих целях используют метод, основанный на измерении интенсивности кальций-зависимой флуоресценции белка экворина (гл. 13, разд. 3). [c.375]

Другой пример сильного взаимодействия белка с ДНК—регуляция оперона белком-репрессором. Наиболее изученным примером является 1ас-оперон Е. соИ [25]. Ген-регулятор кодирует синтез белка 1ас-репрессора, который затем связывается с соседним оператором. Связывание с белком-репрессором малой молекулы— индуктора, например изопропилтио-р- )-галактопиранозида, вызывает диссоциацию репрессора с операторного участка. Последующая транскрипция трех соседних генов оперона приводит к биосинтезу трех ферментов — Р-галактозидазы, галактозопермеазы и тиогалактозидтрансацетилазы. 1ас-Репрессор представляет собой тетрамерный белок, состоящий из идентичных субъединиц по 347 аминокислот каждая. Сродство репрессора к последовательности ДНК оператора зависит от ионной силы константа диссоциации в клетке, вероятно, менее 10 " моль/л . Структура участка связывания ДНК в 1ас-репрессоре до сих пор не выяснена, однако удаление трипсином 59 остатков с Л -конца и 20 остатков с С-конца предотвращает связывание. Несколько больше известно об участке связывания индуктора. Измерения флуоресценции показывают, что находящийся в участке связывания индуктора остаток триптофана при связывании перемещается в менее полярное окружение. Изучение изменения флуоресценции методом остановленного потока показывает, что процесс связывания проходит в две стадии. Быстрая начальная стадия подчиняется, как и ожидалось, кинетике второго порядка. Более медленная стадия мономолекулярна и, по- [c.569]

Ацетилхолиновый рецептор регулирует ионную проницаемость постсинаптической мембраны, вероятно, посредством кон-формацпонного изменения рецепторного белка. Данные о конформационных изменениях после связывания лиганда были получены Путем измерения внутренней (триптофан) и внешней флуоресценции (в последнем случае может быть использован в качестве флуоресцентной репортерной группы местный анестетик хинакрин см. рис. 8.11). [c.263]

ТОД широко применяют для обнаружения в элюатах белков и крупных пептидов, но он недостаточно универсален. Более общим методом анализа, не зависящим от аминокислотного состава пептидов, является измерение поглощения в области 180— 220 нм, где пептиды и белки характеризуются высокими коэффициентами поглощения [1] (например, поглощение при 210 нм в 10—20 раз выше, чем при 280 нм). Однако здесь имеются определенные технические трудности. Кроме того, в этой области интенсивным поглощением обладают почти все известные буферные растворы исключение составляют нелетучие буферы на основе неорганических солей. Можно также вести анализ по флуоресценции ароматических группировок. Этот метод обладает более высокой чувствительностью по сравнению со спек-трофотометрией при 280 нм, но область его применения также ограниченна. [c.391]

Сильное светорассеяние, обусловленное матрицей, может затруднять измерения. Однако концентрация белков в иммобилизованных ферментах достаточно высокая. Следовательно, оптическая плотность растворов белков в области полос поглощения, как правило, высока. Таким образом, поглощение света эффективно конкурирует со светорассеянием. При возбуждении свет поглощается очень тонким слоем поверхности конъюгата белок — матрица, и поэтому флуоресценцию следует наблюдать с фронтальной части поверхности носителя с иммобилизованным белком. Кро.ме того, поскольку излучение имеет большую длину волны по сравнению с длиной волны при возбуждении,. флуоресценция может быть легко отделена от светорассеяния. Гейбл и др. [26] описали кювету, с помощью которой им удалось методом флуоресценции исследовать конформационные изменения иммобилизованных трипсина и химотрипсина, вызываемые мочевиной, нагреванием или присутствием специфических лигандов. Поскольку эту кювету не всегда можно применять, Барел и Рузенс [3] сконструировали очень простую цилиндрическую флуоресцентную кювету, схема которой показана на рис. 9.5. [c.253]

Деполяризация флуоресценции малой молекулы, обладающей в жидком растворе коротким временем вращательной релаксации, сильно снплсается, если эту молекулу связать с большой молекулой полимера. Поэтому измерения поляризации можно использовать для определения доли связанных молекул и, следовательно, константы равновесия этого обратимого процесса. Таким способом Велик [310] измерил константы равновесия комплексов коферментов, а Лоуренс [311] изучил равновесие между красителями и белками и их комплексами. [c.374]

НИЗКИЙ оптический дихроизм хлоропластов может объясняться именно этой недостаточно строгой ориентацией. Парк и др. [251—253] определили молекулярный состав квантосом, исследуя разрушенные хлоропласты шпината. Для зеленых ламеллярных структур диаметром от 2000 до 80 нм, полученных центрифугированием при постепенно возрастающих скоростях, отношение хлорофилла к азоту было довольно постоянным. Крупные структуры были, по-видимому, лишены гран, тогда как фракция более мелких частиц содержала граны. Эти результаты служат доказательством равномерного распределения хлорофилла по всей ламеллярной структуре хлоропласта. Было высказано предположение, что обычно наблюдаемая флуоресценция одних только гран объясняется более высоким содержанием ламеллярных структур. В квантосомах были обнаружены небольшие количества трех переходных металлов — железа, марганца и меди, причём концентрация марганца оказалась наиболее низкой. Марганец необходим для выделения кислорода при фотосинтезе. Учитывая это. Парк и Пон [253] рассчитали молекулярный вес наименьшей единицы в ламелле, которая, очевидно, еще могла бы осуществлять фотосинтез, т. е. частицы, соответствующей одному атому марганца. Он оказался равным 9,6-10 . Позже [251] расчеты были проведены с учетом данных об объеме квантосом (полученных путем измерений на электронных микрофотографиях), а также результатов определений эффективной плавучей плотности разрушенных ламеллярных структур в ультрацентрифуге. Было обнаружено, что молекулярный вес квантосом равен 2-10 , что соответствует двум атомам марганца. Данные о молекулярном составе квантосом представлены в табл. 1. Мембрана толщиной 10 нм содержит 50% липида и 50% белка. Следовательно, с учетом разницы в плотности (1,0 1,4) можно считать, что на долю липида приходится около 6,5 нм толщины мембраны, а это согласуется с представлением о существовании двойного липидного слоя. [c.35]

Диапазон времен релаксации, который может быть исследован путем, измерения деполяризации флуоресценции, определяется продолжительностью жизни возбужденных компонентов использованных флуоресцирующих красителей этот диапазон обычно колеблется от 10до 10 сек. Типичные значения времен релаксации %е - 1,2-10 сек для 1-диметил-аминонафталин-5-сульфонильных производных и 5-10" сек для производных флуоресцина [486]. Следовательно, с помощью этого метода можно характеризовать молекулы с коэффициентом диффузии порядка 10 сек- , которые нельзя исследовать при помощи двойного лучепреломления в потоке. Этот диапазон значений Ог очень важен, поскольку он охватывает более мелкие молекулы глобулярных белков. Следует также указать, что деполяризация флуоресценции может быть измерена с одинаковой легкостью независимо от того, является ли форма молекулы растворенного вещества асимметрической или сферической. Таким образом, можно исследовать вращательную диффузию даже частиц, которые не могут быть ориентированы каким-либо образом. [c.252]

Метод урезонансной спектроскопии позволяет регистрировать высокочастотные движения (т < 10 с) с амплитудами 0,02 нм в фотосинтетических мембранах и РЦ. Измерение параметров флуоресценции и фосфоресценции хромофорных меток (см. 2 гл. X) в тех же температурных областях позволило оценить подвижность молекул среды в диапазоне времен Тс от 1 до 10 с. Оказалось, что, как и в случае применения методов ЯГР и ЭПР, температурная зависимость для эффективности прямого переноса электрона в системе Qa Qв — звена электронтранспортной цепи, локализованного вблизи поверхности трансмембранного белка РЦ — лучше коррелирует с быстрыми движениями в поверхностных слоях препаратов с характерными временами Тс 10 с. В то же время изменения скорости обратной реакции — рекомбинация Р+ и (P+Q PQa) процесса, протекающего во внутренних структурах РЦ, лучше коррелирует с появлением в образцах при размораживании низкочастотных движений с Тс 10 с. В температурном интервале 130-190 К во внутренних частях мембранных белков также наблюдаются движения с временами Тс 1 с, которые регистрируются по сдвигу спектров собственной фосфоресценции ароматических аминокислот. [c.376]

Действительно, в зрительном хромопротеиде насекомых условия для эффективной миграции энергии по индуктивно-резонансному механизму благоприятны спектр флуоресценции триптофанилов белка (>ктах= = 330- 350 нм) сильно перекрывается спектром поглощения хромофора (Ятах=350 нм). На эффективную миграцию энергии с белка на хромофор в зрительном хромопротеиде указывают и прямые измерения. В спектрах действия фоторецепции белоглазого мутанта мухи, измеренных Голдсмит и Фернандесом, обнаруживаются два максимума, один из которых принадлежит белку. Тем не менее независимо от того, каким путем возникает электронно-возбужденное состояние хромофора — при поглощении света самой хромофорной группировкой или за счет миграции с белкового носителя,— [c.150]

В отличие от тирозин-триптофановой тирозин-тиро-зиновая и триптофан-триптофановая миграции энергии в белках выявляются только с помощью поляризационных измерений. Вебер зарегистрировал значительную по сравнению с флуоресценцией тирозина в растворе деполяризацию флуоресценции тирозинсодержащих белков инсулина, рибонуклеазы и зеина. Явление деполяризации флуоресценции характерно и для поли-/-тирозина. [c.254]

Различные модификации флуоресцентной спектроскопии с успехом используют в биохимии мембран для характеристики белок-липидных взаимодействий и подвижности мембранных белков в процессе их функционирования. Один из примеров такого рода — расчет подвижности белковых молекул из величин поляризации флуоресценции. Для измерения используют флуорофоры с хорошим квантовым выходом, способные избирательно модифицировать химические группы белка (дансилхлорид, атакующий КНа-группы, или эритрозин, присоединяющийся к 5Н-группам белка). Поляризацию флуоресценции Р определяют (в стационарном режиме при непрерывном освещении образца) из уравнения [c.81]

Если оптически активная система обладает способностью к флуоресценции (см. следующий раздел), то оказывается возможным измерить еще два параметра оптической активности. Предположим, что для возбуждения используется свет с круговой поляризацией, а весь излученный свет удается регистрировать. Поскольку интенсивность излучения пропорциональна количеству поглощенного света, разность интенсивностей излучения, отвечающих возбуждению при помощи лево- и правополяризованного света, будет давать разностный спектр поглощения (в данном случае — КД) только флуоресцирующих хромофоров. Так, например, если молекула белка содержит два остатка триптофана, из которых лищь один является флуоресцирующим, обычный КД будет просто суммой КД обоих этих остатков. КД, регистрируемый по флуоресценции, будет относиться только к одному из остатков триптофана КД другого можно найти путем вычитания. Для возбуждения можно использовать неполяризованный свет, но измерять разность интенсивностей лево- и правополяризованного излучаемого света. Такой подход позволяет получить КД хромофора, отвечающий его конфигурации в возбужденном состоянии, в отличие от всех прочих методов измерения КД, регистрирующих конфигурации основного состояния (см. Steinberg, 1978). [c.84]

В табл. 8.2. представлены флуоресцентные характеристики хромофоров, присутствующих в белках и нуклеиновых кислотах. Для большинства из них характерны низкие квантовые выходы и малые времена жизни. Экспериментальная чувствительность, которая определяется произведением фр нас ц [уравнение (8.42.)], низка. Это далеко не идеальные образцы для экспериментальных измерений. На рис. 8.15 сравнивается флуоресценция типичных белков и свободных аминокислот. Спектр флуоресценции большинства белков определяется в основном флуоресценцией триптофана. Тирозин тоже мог бы давать существенный вклад во флуоресценцию, поскольку этот остаток, хотя и обладает более слабой флуоресценцией, обычно присутствует в белках в большом количестве. Однако вследствие переноса энергии на триптофан, о чем речь пойдет ниже, флуоресценция тиро-1ИНОВЫХ остатков, как правило, тушится. [c.93]

Таким образом, степень анизотропии флуоресценции сферической молекулы спадает по простому экспоненциальному закону. Измерение характерного времени спада позволяет при известной вязкости рассчитать объем гидратированной молекулы И др. Из уравнения (8.73) видно, что чем больше молекула, тем медленнее спадает степень анизотропии флуоресценции. Это довольно очевидный результат, поскольку чем больше молекула, тем медленнее она вращается. На рис. 8.23 приведены данные по уменьшению степени анизотропии для антранилоилхимотрипсина. Измеренное время вращательной корреляции равно 15 НС. Это — типичное значение для небольших белков. [c.109]

Флуоресцентные метки. Степень изменения поляризации флуоресценции зависит от метки, среднего времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, молекулярной массы антигена и природы комплекса. Считается, что молекулярная масса комплекса не должна превышать 20 ООО. Среднее время жизни молекулы в возбужденном состоянии примерно, равно среднему времени релаксации антигена, которое составляет несколько наносекунд. Однако при измерении подвижности мембранных белков метка должна существовать в возбужденном состоянии намного дольше, так как время вращательной релаксации таких белков лежит в диапазоне миллисекунд. Время жизни триплетного состояния сравнимо с временем вращательной релаксации мембранных белков, поэтому последние рекомендовалось изучать с помощыо деполяризации фосфоресценции [10]. При разработке методик ФИА выбор флуоресцентной метки имеет ключевое значение. В принципе метка должна обладать следующими качествами [c.142]

Поскольку продукт реакции, по-видимому, связан частично метиленовыми мостиками с белками, его не удается экстрагировать органическими растворителями. Срезы свежей и фиксированной формалином нервной т рани, полученные на вибратоме при температуре от О до + 5°С, подвергают высушиванию на воздухе и воздействию паров формальдегида на таких срезах удается выявлять катехоламины высокочувствительным стандартным методом Фалька—Хилларпа. Измерение с помощью микро-спектрофлуориметра спектров возбуждения и флуоресценции таких продуктов конденсации дает возможность дифференцировать в клетках различные амины, такие, как норадреналин, дофамин и 5-окситриптамин. Параметры флуоресценции некоторых биогенных аминов и их предшественников, а также родственных им соединений суммированы в табл. 47. [c.259]

НОГО С белком динуклеотида обусловливает значительную интенсификацию излучения (увеличение квантового выхода), вследствие чего измерение флуоресценции — особенно чувствительный метод для обнаружения комплекса между ферментом и коферментом. Связывание восстановленного никотинамиднуклеотида с определенным флавопротеидом приводит к гашению флуоресценции рибофлавином посредством механизма, аналогичного действующему в растворах динуклеотида. [c.465]

Y-Радиоактивные препараты в последнее время приобрели большое значение в биохимии и особенно в радиоиммунологических исследованиях гл. 10), при которых антитела или другие белки часто метят радиоактивным Этот вид излучения легко регистрируют и измеряют радиоактивность у-излучателей с помощью производимых серийных у-счетчиков, где применяется внешний сцинтилляционный детектор, который работает по следующему принципу. Образец помещают в стеклянный или пластмассовый флакон и вводят внутрь большого кристалла Nal, активированного таллием [Nal(Tl)] это носит название счета в колодце (рис. 5-8). Поскольку у- 1учи имеют очень высокую энергию, они выходят за пределы образца и флакона без заметной потери энергии. С выходом в несколько процентов за время прохождения через кристалл они приводят к появлению электронов. Эти электроны в свою очередь возбуждают близлежащие части кристалла, в результате чего возникает флуоресценция, регистрируемая фотоумножителями. Как и в жидкостном сцинтилляционном методе, соответствующая электронная аппаратура превращает свет в регистрируемые электрические импульсы. При измерении 7-радиации нет необходимости в схеме совпаде- [c.120]

Следует отметить, что методы, предложенные для количественной регистрации активности рестриктаз являются методами с отбором проб в течение реакции и только в одной работе [159] был предложен непрерывный количественный метод регистрации скорости гидролиза ДНК, основанный на измерении флуоресценции при гидролизе кольцевой ДНК с интеркалированным бромистым этидием. В-третьих, для структурно-кинетических исследований рестриктаз требуются довольно большие количества, желательно, гомогенного белкового препарата фермента, что стало реальным лишь в последние годы в результате работ по клонированию генов целого ряда рестриктаз и созданию супер-продуцентных штаммов (см. разд. 5, часть II). В последние годы интерес к структурно-кинетическому изучению рестриктаз стал возрастать в связи с развитием исследований, направленных на установление механизма специфического узнавания ДНК белками, так как в этом ключе эндонуклеазы рестрикции являются исключительно интересными объектами. [c.69]

Рассмотрим два примера. Первый пример — исследование связывания лиганда ферментом в ходе иекатализируемой реакции. При этом могут произойти два физических события связывание и индуцируемое лигандом конформационное изменение фермента. Чтобы установить число промежуточных стадий и определить соответствующие им константы скорости, прежде всего необходимо определить число времен релаксации и найти их концентрационную зависимость. В идеальном случае число времен релаксации будет равно числу стадий данной реакции. Если найдено даже одно время релаксации и его концентрационная зависимость нелинейна, это может означать, что процесс протекает в две стадии [например, уравнения (4.71) и (4.74)], Далее стоит воспользоваться несколькими физическими методами (например, исследовать флуоресценцию и поглощение лиганда и белка), поскольку некоторые стадии могут быть выявлены только с помощью одного из этих методов. В ходе рассматриваемой реакции могут протекать и другие физические процессы, например отдача или присоединение протона или изменение степени агрегации белка. В первом случае весьма полезен еще один метод — измерение pH, для чего можно использовать просто цветные индикаторы. Агрегация осложняет кинетические исследования, однако ее можно обнаружить и количественно охарактеризовать, что также даст дополнительную информацию. Для исследования простых реакций релаксационные методы часто оказываются эффективнее струевых, поскольку позволяют изучать более быстрые процессы. Однако иногда метод остановленной струи более ценен, например, при исследовании процессов, слишком медленных, чтобы применять метод температурного скачка. Кроме того, некоторые эксперименты (такие, как исследование влияния сильных изменений pH) можно осуществить только в том случае, если использовать методы, включающие быстрое смешивание реагентов (хотя небольшого изменения pH можно добиться, применив метод темпера- [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология