Ферменты методы количественного определения

Моча здорового человека содержит настолько мало белка, что он не обнаруживается ни с помощью реакций осаждения, ни цветными реакциями на белок. Однако более чувствительные ферментативные методы позволяют обнаружить в моче белки — ферменты. Одним из них является диастаза, называемая иначе амилазой. Амилаза образуется в поджелудочной железе, поступает в кровь и частично выводится с мочой. Содержание амилазы в моче заметно возрастает при воспалительных процессах в поджелудочной железе. Поэтому количественное определение диастазы в моче часто проводят при обследовании больных, обнаруживающих симптомы воспаления поджелудочной железы. [c.249]

Нетрудно также видеть, что все рассмотренные методы количественного учета ферментов дают представление не об абсолютном количестве фермента, но лишь об относительном его содержании. Однако для практических целей и эти относительные показатели имеют большую ценность. Так, при количественном определении пепсина в. желудочном соке по методу Метта полученные величины ничего не говорят об абсолютном содержании пепсина в желудочном соке больного, но они все же достаточно ясно-показывают, насколько исследуемый сок по своей активности, т. е. по своей способности растворять денатурированный яичный альбумин, отличается от нормального л<елу-дочного сока здорового человека. Очевидно, эти величины для клиники представляют большой интерес и вполне заменяют цифры, характеризующие содержание пепсина в желудочном соке в абсолютных весовых единицах. Точно так же для характеристики осахаривающей (амилолитической) способности слюны или вытяжки из проросших зерен ячменя (солода) совершенно достаточно для практических целей выражать эту способность в условно принятых единицах. [c.124]

Принцип метода. Методы выделения амилаз из покоящихся и проросших семян основаны на настаивании размолотых семян с водой или слабым раствором нейтральных солей. При этом большая часть амилаз переходит в вытяжку. Очищают ферменты чаще всего высаливанием из растворов сульфатом аммония. Раздельное количественное определение активности амилаз основано на различной термолабильности а- и -амилаз. -амилаза разрушается нагреванием до 70°, при этом а-амилаза сохраняет свою активность. Некоторое снижение активности а-амилазы, которое может быть в таких условиях, практического значения не имеет. [c.149]

Для некоторых биологических молекул разработаны энзиматические методы количественного определения. Они основаны на том, что под влиянием специфического действия фермента на определяемое ве щество образуется эквимолекулярное количество продукта реакции,. обладающего характерным спектром поглощения. Так, пировиноград-ную или молочную кислоту можно количественно определить с использованием лактатдегидрогеназы (с. 31). [c.7]

Основу руководства составили работы, которые на протяжении ряда лет используются в учебном процессе на кафедре биохимии 1 ММИ им. И. М. Сеченова. В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими, как электрофорез белков в полиакриламидном геле, ионообменная хроматография белков, гель-фильтрация, изучение четвертичной структуры белков и др. Подобраны и приспособлены к условиям работы в студенческой лаборатории современные методы выделения и изучения ферментов, их количественного определения в биологических жидкостях и тканях. Авторы стремились по возможности использовать в качестве объектов изучения биологические материалы, с которыми обычно имеет дело клиническая биохимия. [c.3]

Большой вклад в изучение пищеварительных ферментов внес И. П. Павлов и его сотрудники. Им были разработаны физиологические методы, позволяющие получать чистые пищеварительные соки и изучать в них активность ферментов. Далее он исследовал условие , влияющие на образование ферментов в пищеварительных железах животных. В лаборатории Павлова были разработаны методы количественного определения некоторых ферментов. И. П. Павлов впервые указал на белковую природу ферментов. [c.168]

Полисахариды сравнительно легко гидролизуются при кипячении с разбавленными растворами кислот или при инкубации с соответствующими ферментами. Щелочи не гидролизуют полисахаридов. Так, гликоген можно нагревать в течение нескольких часов с 30%-ным раствором щелочи без какого-либо разложения его. На этом основан метод количественного определения гликогена. Характерно, что в ряде случаев при ферментативном гидролизе таких [c.317]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Смесь, состав которой хорошо известен, можно подвергнуть экстракции раствором, насыщенным по отношению ко всем растворенным компонентам, кроме одного. В этом случае в экстрагенте растворится только этот компонент и его можно количественно определить в экстракте. Экстрагирующий раствор можно также насытить только по отношению к главному компоненту исследуемого образца и тогда растворятся только примеси. Метод растворимости и различные его варианты применялись для исследования ряда аминокислот, сахаров, стероидов и ферментов [71]. Точность определения концентрации примеси может достигать 0,1%. [c.169]

Эти методы часто -являются наиболее..специфическими и тонкими методами обнаружения и количественного определения индивидуальных белков и некоторых других компонентов в смеси. В последующих томах настоящего сборника, а также в большом числе монографий [4, 43, 112, 113] описаны методы, пригодные для измерения активности таких белков, как ферменты, гормоны, токсины, антитела и т. п. [c.23]

Определение ниацин а. В составе пищевых продуктов никотиновая кислота и ее амид находятся как в свободной, так и в связанной форме, входя в состав коферментов (НАД и НАДФ) ряда важнейших ферментов окислительного превращения. Существующие химические и микробиологические методы количественного определения ниацина предполагают наиболее полное выделение и превращение его связанных форм, входящих в состав сложного органического вещества клеток, в свободную никотиновую кислоту. Освобождают связанные формы ниацина воздействием растворов кислот или гидроокиси кальция при нагревании. Имеется много рекомендаций, касающихся условий обработки, вида и концентрации применяемого реагента. Для этих целей используют нагревание на кипящей водяной бане с растворами соляной и серной кислоты [27, 37] или с Са(0Н)2 [38]. [c.200]

Нетрудно также видеть, что все рассмотренные методы количественного учета ферментов дают представление не об абсолютном количестве фермента, но лишь об относительном его содержании. Однако для практических целей и эти относительные показатели имеют большую ценность. Так, при количественном определении пепсина в желудочном соке по методу Метта полученные величины ничего не говорят об абсолютном содержании пепсина в желудочном соке больного, но они все же достаточно ясно показывают, насколько исследуемый сок по своей активности, т. е. по своей способности растворять денатурированный яичный альбумин, отличается от нормального желудочного сока здорового человека. Очевидно, эти величины для клиники представляют боль- [c.131]

В результате фермент теряет активность. Сродство ионов Ае+ к тиольным группам настолько велико, что АдЫОз можно использовать для количественного определения —5Н-групп методом титрования. [c.360]

Для того чтобы исследовать ферменты, необходимо располагать методами для количественного определения их каталитической активности. Вещество, на которое воздействует фермент, называют его субстратом. Активность фермента определяют по количеству субстрата, которое под действием этого фермента превращается в продукт реакции за единицу времени. Рассмотрим в качестве примера р-галактозидазу — фермент, субстратом которого служит лактоза (дисахарид). Под действием р-галактозидазы лактоза расщепляется на галактозу и глюкозу [c.80]

Кроме того, эти авторы обнаружили изменения в количестве или активности некоторых печеночных ферментов. Количественных определений не производилось сдвиги регистрировались по интенсивности специфических гистохимических цветных реакций на эти ферменты, с помощью обычных методов связывания азокрасителей. Активности кислой фосфатазы, неспецифической эстера-зы и сукциндегидразы в паренхиматозных клетках печени были значительно снижены, тогда как щелочная фос-фатаза в купферовских и тучных клетках была повышена. [c.525]

В данном разделе рассматриваются физические, химические и ферментативные методы, которые используются при исследовании метаболизма бактерий. В последующих главах описаны физические методы и приборы, фракционирование и анализ химических компонентов, выделение и количественное определение ферментов, изучение катализируемых ими реакций, а также исследование проницаемости клеток и транспортных процессов. Все эти вопросы разработаны настолько хорошо, что вполне оправданно опубликование специальных книг, посвященных их методологии и применению. Однако в данном случае авторы ограничились описанием только самых надежных и простых методов, которые могут использовать для достаточно основательного изучения метаболизма бактерий даже начинающие исследователи. [c.166]

В настоящее время метод тонкослойной хроматографии продолжает успешно развиваться в ХНИХФИ и применяется при изучении состава растительного материала, исследованиях сложных лекарственных смесей, в том числе для количественных определений различных классов органических соединений (флавоноидов, алкалоидов, кумаринов, сердечных гликозидов, фуранохромонов, ферментов и др.). [c.32]

Методы обнаружения в слюне амилазы и мальтазы, а также метод количественного определения амилазной активности слюны рассматривались при изучении свойств ферментов. Ферменты, выделяемые в слюну бактериями, например альдолаза и щелочная фосфатаза, могут быть обнаружены в слюне теми же методами, что и в тканях или сыворотке крови животных (см. стр. 177 и 234). [c.260]

Для определения концентрации исследуемого соединения в исходном препарате не всегда необходимо проводить его предварительное выделение и очистку. Если соединение обладает каким-либо уникальным свойством, это свойство можно взять за основу при его количественном определении. Примером таких уникальных особенностей может служить биологическая специфичность существуют методы количественного определения ферментов в интакт- [c.138]

Благодаря чувствительности, воспроизводимости и простоте, спектроскопия в УФ/вид.-области применяется для количественного определения микроколичеств металлов, в анализе лекарственных препаратов, биологических жидкостей и пищевых продуктов. Пределы обнаружения обычно лежат в диапазоне 10 -10 моль/л (при использовании экстракщгонного концентрирования), погрешность воспроизводимости метода в обычных случаях не превышает несколько десятых процента. Подробнее см. разд. 9.1.6 (определение микроколичеств металлов, холестерина, ферментов, ВИЧ и др.). [c.156]

Применение. В микроскопии в качестве субстрата для количественного определения и гистохимического выявления локализации эстераз f t —3]. Метод основан на гидролизе индоксилацетата (или других растворимых сложных эфиров индоксила) с выделением свободного индоксила, который кислородом воздуха быстро окисляется в нерастворимый синий краситель — индиго, В гистохимии ферментов в качестве субстрата для выявления катепсина С [Пирс 847] и ацетилхолинэстеразы [4], [c.158]

Попытки непосредственно показать взаимопревращение пи-ридоксаминфосфат-ферменга и пиридоксальфосфат-фермента до сих пор были безуспешными , по-видимому, вследствие ряда экспериментальных трудностей, обусловленных тем, что в соединение с ферментом вступает лишь очень небольшое количество кофермента и при этом отсутствует достаточно хороший метод количественного отщепления и определения связанного с ферментом кофермента. Задача осложняется еще и тем, что добавленный синтетический кофермент может присоединяться к белковой молекуле фермента не только там, где он необходим для проявления ферментативной активности, но и в других ее участках. Исследования с применением кофермента, меченного радиоактивным фосфором, позволили обнаружить неспецифическое [c.251]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Вторым крупным достижением в изучении аминокислотной последовательности белковых молекул явилось определение структуры рибонуклеазы, выполненное Хирсом, Штейном, Муром и Анфинсеном. Молекула этого фермента, представленная одиночной полипентидной цепью, состоит из 124 аминокислот и содержит 4 дисульфидных мостика. При изучении ее, так же как и в случае инсулина, использовали окисление надмуравьиной кислотой с последуюш им ферментативным гидролизом. Однако для выяснения первичной структуры этой более крупной молекулы потребовалось ввести в методику некоторые усовершенствования авторы применяли ионообменные смолы для количественного разделения пептидов низкого молекулярного веса и использовали количественные методы для определения аминокислотного состава пептидов. Полная структура рибонуклеазы показана на фиг. 30. [c.94]

При помощи ферментов производятся точные количественные определения содержания, кроме сахара, также молочной, пировиноградной и а-кетоглютаровой кислот. Такие данные важны для понимания нарушений в обмене веществ в организме. С использованием ферментов связано и определение аденозинтрифосфор-ной, аденозиндифосфорной и аденозинмонофосфорной кислот, позволяющее узнать о количестве мобильных энергетических резервов, об их превращениях и утилизации в обмене веществ. Методы биохимического и клинического анализов, основанные на применении ферментных препаратов, как реактивов, обычно чувствительны и точны. [c.315]

Мы поставили задачу разработать доступный и высокочувствительный метод определения указанных дефолиантов, использовав для этого энзимный метод, основанный на способности фосфорорга-нических соединений определенного типа угнетать фермент холин-эстеразу. Используя микрохимический титрационный метод определения активности холинэстеразы в присутствии яда, опубликованный Смирновой [5] для меркаптофоса, мы разработали количественное определение фолекса и бутифоса в растительном материале. [c.130]

Как упоминалось выще, длину цепи полинуклеотида можно определить количественным определением концевых звеньев. В случае некоторых небольших полимеров гидролиз концевого фосфата (фосфатов) под действием очищенной фосфомоноэстеразы дает независимую оценку длины цепи из соотношения количества общего фосфора к количеству фосфора, выделенному в виде неорганического фосфата исследование оставшегося полинуклеотида уточняет природу концевых звеньев. Применение такого рода методов до некоторой степени ограничено высокой степенью чистоты, необходимой для применяемых ферментов, и изменением активности моноэстераз (и диэстераз) с изменением длины цепи полимера. Однако нуклеиновые кислоты второго и третьего типов все же были обнаружены (хотя и в гетерогенных смесях рибонуклеиновых кислот), причем нуклеиновые кислоты последнего типа, возможно, возникали главным образом в результате процессов расщепления [92]. [c.389]

Пинелли и Форменто [367] разработали метод анализа субмикрограммовых количеств стероидов в маленьких пробах мочи, объединив тонкослойную и газовую хроматографию. Чтобы получить свободные стероиды, эти авторы проводили ферментативный и химический гидролиз, после чего разделяли стероиды на силикагеле с.месью диэтиловый эфир—метанол (1 1). Для количественного определения методом газовой хроматографии они использовали триметилсилиловые эфиры. Вайдепхейвель [368] показал, что для ферментативного гидролиза нужны высокие концентрации ферментов. [c.352]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Методы открытия и количественного определения ферментов отличаются от обычных химико аналитических методов. О присутствии фермента в том или ином растворе (соке, вытяжке) обычяой судят по действию на определенный субстрат или на [c.124]

Для детального описания физико-химических основ специфичности действия ферментов требуются разделение и количественное определение различных факторов специфичности. Простой и удобный подход к этоцу вопросу основывается на методах корреляционного анализа и принципе линейности свободной энергии. Основы этого экстратермодинамического подхода разработаны в рамках физической органической химии и нашли широкое применение также в биохимии . Однако по настоящее вреул встречаются попытки упрошенного подхода к этому анализу. [c.184]

В настоящее время существует много различных методов изучения метаболизма бактерий, рассмотрение которых следовало бы включить в эту главу. Здесь было бы полезно, например, обсудить методы, применяемые для идентификации и количественного определения различных ферментов дыхагельной цепи, участвующих в образовании взаимосвязанных путей, через которые идет поток электронов и образуются хемиосмотические градиенты. Интересно было бы рассмотреть также общие методы анализа специфических катаболических и анаболических процессов. К сожалению, объем данной книги не позволяет включить описание этих и многих других методов. [c.375]

Довольно скоро выяснилось, что гемолитические реакции такого типа встречаются чаще у мужчин, чем у женщин. Было проведено количественное определение стабильности глутатиона, основанное на измерении его концентрации до и после инкубации эритроцитов с ацетилфенилгидразином Кривые распределения, построенные для 144 обследованных американских негров, имели ярко выраженный бимодальный характер, причем в значительной части популяции уровень содержания глутатиона был крайне низким. В группе из 184 негритянок кривая смещена влево, а доля больных с низким содержанием глутатиона гораздо меньще, чем в группе мужчин. Отсюда следует, что данный признак сцеплен с Х-хромосомой низкое содержание глутатиона после инкубации с ацетилфенилгидразином характерно для гомозиготных женщин и гемизиготных мужчин, а промежуточное-для гетерозиготных женщин. Это предположение вскоре получило подтверждение в работах по анализу родословных [1034]. Сходные картины распределения были получены и при использовании методов прям ого анализа ферментов в популяции. Заметим, что величины, полученные для гетерозигот, оказались средними между нормой и значением, характерным для гомозиготных больных (рис. 4.6). [c.23]