Антигены, адсорбция

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Адсорбционная иммобилизация антигенов. Многие макромоле-кулярные антигены — пептидные гормоны, белки, ферменты, липо-полисахариды, денатурированная ДНК н т. д., а также целые вирусные частицы, компоненты клеток (например, рибосомы) и целые клетки могут быть связаны с поверхностью полимерных н неорганических носителей путем адсорбции в условиях, идентичных описанным для иммобилизации антител. Различия чаш,е всего относятся к оптимальным значениям pH, которые могут изменяться от нейтральных до ш,елочных (pH 6,8—9,6) в зависимости от заряда сорбируемой молекулы. Длительность процесса адсорбции и максимальное количество связанного с поверхностью антигена являются характеристиками, индивидуальными для каждого процесса и зависящими от гидрофобности, заряда и молекулярной массы Молекулы. Однако для многих антигенов время, необ- [c.212]

Иммобилизованные ферменты могут быть использованы в качестве иммуносорбентов для выделения из антисыворотки специфических антител на эти ферменты. Эффективность адсорбции антител, количество адсорбированных антител и условия их элюции зависят от свойств иммуносорбента от количества связанного с матрицей белка-антигена, прочности связи антиген—носитель, конформации антигена и числа вовлеченных в ковалентное связывание субъединиц антигенов-олигомеров. [c.304]

Белки имеют тенденцию адсорбироваться на различных материалах, это свойство можно использовать для разделения. Целлюлоза, стекло и силикагель — все они нашли применение для адсорбции белков. Классический способ удаления растворенного вещества из раствора — использование измельченного древесного угля, но в случае белков адсорбция затрудняется из-за несоответствия между большим размером молекул белка и малыми порами угля. Древесный уголь модифицируют, покрывая его декстраном и 1 С, и в растворе сохраняется комплекс 1 С-антиген, тогда как антиген адсорбируется на древесном угле. В случае меченого антигена этим способом удаляют из раствора свободную метку, оставляя связанную метку для определения в растворе. [c.577]

Количество осажденного азота (лг) лосле адсорбции сывороток антигенами [c.140]

Ряд исследований посвящен изучению реакции между антителом и антигеном в мономолекулярных слоях. Если яичный альбумин адсорбировать на поверхности хромовой пластинки и погрузить затем эту пластинку в раствор антитела, то на поверхности антигена образуется мономолекулярный слой антитела [118]. Однако при обратном процессе, т. с. при адсорбции на металле антитела и погружении пластинки в раствор антигена, отложе- [c.346]

С некоторым успехом проведены изоляция и частичная очистка вирусов достигнуто и удаление некоторых примесей из вирусов на ионитах с оставлением очищенного вируса в растворе. В некоторых случаях полезной оказалась комбинация этих методов. Кроме того, специфическая адсорбция вирусов на ионитах по типу реакций антиген-антитело достигнута на специальных смолах. [c.621]

Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген — антитело (рис. 60). Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку [c.119]

Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией. [c.247]

В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов). Чаще всего для целей твердофазного ИФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя. [c.201]

Концентрация иммобилизованных антител. Эта величина является одним из основных параметров, варьированием которого можно оптимизировать чувствительность и длительность анализа. Для успешной разработки метода ИФА знание точного значения этой концентрации необязательно. В большинстве случаев экспериментатор оперирует понятиями количество, или концентрация иммуносорбента (при использовании гранулированных носителей) или концентрация белка при адсорбции (для непористых полимерных материалов). Точное знание концентрации необходимо в тех случаях, когда ставится задача изучения физико-химических характеристик взаимодействия антиген — антитело либо получения исходных данных для оптимизации схемы ИФА на ЭВМ. [c.217]

Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. [c.218]

Удаление неспецифических антител из антисыворотки обычно осуществляют с помощью метода адсорбции на соответствующем неспецифическом антигене. Адсорбция неспецифических антител в реакции преципитации с растворимой фракцией путём центрифугирования может привести к появлению в антисыворотке или растворимых комплексов Ат—Аг, или избытка добавленного Аг, присутствие которых влияет на способность антисыворотки реагировать со сцецифическим антигеном в ИФА. Наиболее удобно для адсорбции антисыворотки использовать антиген, иммобилизованный на твердой фазе. Добавляя такой иммуносорбент в антисыворотку или пропуская антисыворотку через колонку с иммуносорбентом, можно быстро освободиться от перекрестно реагирующих антител. [c.155]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Величина этого параметра определяет возможность применения тех или других антител. Иммуноанализ и гистохимические методы требуют антител с высоким сродством (/Ссв=Ю-э—чтобы комплексы антигена с антителами были очень прочными С другой стороны, имму-ноаффинная очистка лучше осуществляется с низкоаффинными антителами Ксв=10- —10- ), поскольку в этих условиях адсорбция и освобождение антитела проходят при относительно мягких условиях без повреждения антигена и антител и колонка может использоваться повторно. Анализ взаимодействия антител с антигеном проводят по методу Скэтчарда (см. с. 343) с использованием радиоиммунного анализа. [c.324]

Эффекты неспецифического связывания могут также быть источником проблем. Изменение поверхности частиц влияет на агрегацию частиц и адсорбцию реагента, так что следует оптимизировать условия, чтобы уменьшить вандерваальсово притяжение между частицами, обеспечив достаточное куло-товское отталкивание, но не ингибируя реакцию антитело—антиген. [c.585]

Инфекционность и автономность полового фактора доказывается высокой эффективностью его передачи. Переход F-фактора от F к F клеткам происходит через F-волоски, обнаруженные, например, у Е. соН К12. Их образование детерминируется F- и R-факторами. Диаметр F-волосков около 9,5 нм и длина 20 мкм. Эти волоски несут f -антиген и на них адсорбируются специфические мужские РНК-содер-жащие фаги. Предполагают, что в этой адсорбции принимают участие выпуклости дистальных концов F-волосков. Указанные выпуклости бывают чашеобразные, дисковидные и, наиболее часто, сферические. Полая структура F-волосков обеспечивает транспорт фаговых частиц в чувствительную бактериальную клетку. [c.86]

Кроме дифференциации клеток важной особенностью их является склонность к аггломерации (от лат agglomeratus — скопление) Это может происходить в различных условиях и с клетками различного уровня организации — прокариотами и эукариотами Те из них, которые имеют клеточную стенку, чаще аггломерируют за счет химических компонентов, локализованных в ней Причем процесс "скучивания" является физико-химическим (адсорбция, ионное и ковалентное взаимодействия), зависящим не только от особенностей клеток, но и от компонентов среды, используемой для их культивирования Поэтому аггломерация может быть следствием 1 адгезии (от лат айЬаезю — склеивание, слипание) клеток друг к другу или к поверхности культурального сосуда за счет веществ — адгезинов, расположенных на их поверхности, и других причин, 2 агглютинации по схеме "антиген-антитело", когда в качестве антигена оказываются культивируемые клетки, а в качестве антитела — гомологичные или гетерологичные агглютинирующие иммунные сыворотки, 3 слияния клеток с образованием гибридов [c.149]

Очень перспективным методом очистки воды от всевозможных загрязняющих ее веществ, особенно синтетических, является использование иммобилизованных (закрепленных, нерастворимых) ферментов — ферментов второго поколения . Идея закрепления ферментов на нерастворимом в воде носителе и применения таких мощных катализаторов в технологических процессах и медицине возникла давно. Еще в 1916 г. осуществлена адсорбция инвертазы на активированном угле в свежевыделенной гидроокиси алюминия. С 1951 г. для фракционирования антител и выделения антигенов используют конъюгацию белков с целлюлозой. До недавнего времени существовал единственный метод закрепления ферментов — обыкновенная физическая адсорбция. Однако адсорбционная емкость известных материалов относительно белков явно недостаточна, а силы адгезии невелики, и разрыв связи между ферментом и поверхностью адсорбента может наступать от малейших изменений условий процесса. Поэтому такой метод иммобилизации не нашел широкого применения, но, поскольку он прост и может, по-видимому, способствовать выяснению механизма действия ферментов в живых системах, илах и почве, а в некоторых случаях применяться на практике, некоторые исследователи занимаются изучением адсорбции ферментов, поиском новых, эффективных носителей и т. д. [104, 206]. [c.176]

Ограниченные запасы витаминов и гормонов в- животных привели к развитию механизмов адсорбции, транспорта и консервации этих веществ в следовых количествах. В таких процессах важную роль играют специфические транспортные или связывающие белки, предотвращающие быстрое выведение витаминов и гормонов с мочой, которое происходило бы, если витамины и гормоны не были бы связаны в плазме в соответствующих комплексах. Связывающие белки присутствуют в очень низких концентрациях. Например, белки, прочно связывающие витамин В12, траноко баламины I и И, находятся в плазме крови человека в концентрациях соответственно 80 и 20 мг на 1000 л. Однако они обычно имеют высокое сродство к комплементарным витаминам и гормонам. Константы диссоциации этих комплексов находятся в интервале от 10 до 10 моль/л [35]. Из-за низких концентраций эти белки нельзя выделить классическими методами очистки наличие специфических взаимодействий с высоким сродством позволяет использовать аффинную хроматографию, которая допускает работу с большими объемами исходного материала. Как и для взаимодействий антитело — антиген, трудности заключаются в последующем выделении белка из комплекса с аффинными сорбентами. [c.124]

Оптимальные значения pH для физической адсорбции антигенов на ВАС в 0,15М фосфатно-цитратных буферных растворах (табл. 7.4) определены Робинсом и сотр. [79]. Антиген (300— 500 мг) растворяют в таком буферном растворе, в котором адсорбция оптимальна, и к полученному раствору добавляют 1 г (сухая масса) ВАС. Суспензию интенсивно перемешивают 30 мин магнитной мешалкой при комнатной температуре. После центрифугирования (10 мин при 1000 ) реакционную массу суспендируют в 30 мл 0,1М натрийбикарбонатного буфера, pH 8,9, и оставляют при 4 °С на 24 ч, периодически перемешивая. При этом значении pH происходит химическое связывание антигена и ВАС. Суспензию вновь центрифугируют 10 мин при 10 000 g [c.39]

Антиген, связанный с целлюлозой pH физической адсорбции иа ВАС Количество связанного антигена, мг/г сорбента Количество адсорбированных и элюированных антител, мг/г со рбснта Среднии выход. % [c.41]

Другие доказательства того, что антитело специфично по отношению ко всему пептиду, были получены при адсорбции антисыворотки. При этом вначале проводится реакция антисыворотки с гетерологичным гаптеном до тех пор, пока не перестает образовываться преципитат, а затем уже такая адсорбированная сыворотка используется для реакции с гомологичным гаптеном. После адсорбции антисыворотки против —ГГЛ ГГ соответствующими антигенами остаются антитела, которые реагируют с гомологичным гаптеном, но не со сходными гантенами. Исключение составляет слабая реакция с —ЛЛГ. Проведенные для сравнения опыты с разбавленной антисывороткой показали, что эти изменения в реактивности не обусловлены одним лишь уменьшением общего содержания антител. [c.56]

Гейдельбергер и его сотрудники, адсорбируя комплемент преципитатом антиген — антитело и определяя содержание азота в преципитате до и после адсорбции комплемента, нашли, что [c.348]

Специфическая адсорбция протеина ионитами. Последние исследования Ислайкера [41, 42] по приготовлению и свойствам комплексов ионит -антиген представляют значительные и многообещающие перспективы разделения и очистки антител и некоторых антигенов. Катиониты и аниониты превратились в уникальные специфические адсорбенты для изоаглютининов человека, КЬ-антител, антител вируса инфлуэнцы и антител к альбумину сыворотки человека путем придания им высокой специфичности, проявляющейся при реакциях антитело-антиген. Эта специфичность обеспечивается химическими реакциями или физической адсорбцией в любом случае специфический антиген соединяется с ионитом, образуя нерастворимый комплекс, который легко реагирует со своим специфическим антителом, удаляя его таким образом из раствора. [c.618]

А-вирус инфлюэнцы вместе с кислыми хлоропроизводными ионитов при некоторых условиях регулируемой конверсии образовывал комплекс ионит-антиген, способный адсорбировать А-антитела этой болезни из очищенных гамма-глобулиновых фракций человеческой плазмы. Десорбция антител из этих комплексов, видимо, так же трудна, как из обычных комбинаций анти-ган-ант Итело. Количественную десорбцию не удалось осуществить канцентри-рование обычно лостигалось за счет потери материала, необратимо связанного с антигеном. Низкий выход (10—20"/о) адсорбированного антитела из комплексов с ионитом стимулировал развитие исследований новых путей разрушения комплекса антиген-антитело вытеснением полиэлектролитами. После диазотирования проводилась адсорбция сульфированных ароматических ионитов связывание антигена с ионитом также использовалось как средство получения специфических комплексов ионит-антиген. [c.619]

К вопросу, какой полимер следует считать химически реакционноспособным, можно подходить с различных точек зрения. Если прибегнуть к образному сравнению, то эти точки зрения взаимосвязаны, подобно полимерным цепям в сшитом полимере. Так, исходя, например, из поливинилгидрохинонов, путем аналогий соотношений между обобщенной кислотно-основной к обобщенной окислительно-восстановительной химией, мы возвращаемся к области поликислот, полиоснований и вообще ионообменников= Но может возникнуть также вопрос, как прочно реакционноспособная группа должна быть связана с полимерной цепью, чтобы полимер мог называться химически реакционноспособным, в отличие, например, от адсорбции или даже своего рода раствора активной группы в отдельной мицелле, образованной свернувшейся в клубок цепью полимера. Поиски ответа на такой вопрос, как и на любой другой, относящийся к пограничной области химического и физического взаимодействия, вводят нас непосредственно в область химии природных соединений — энзимов, витаминов, антигенов и антител — и в то же время в исследование соединений включения, молекулярных комплексов и во всю увлекательную область исследования влияния сочетания модельной группы (или, в общем, реакционноспособной группы) с субстратом на ее свойства. [c.239]

Наиболее простой метод заключается в предварительной обработке планшетов или пробирок из полистирола или поливинилхлорида водным раствором глутарового альдегида. Добавляемые затем антитела ковалентно связываются с активированным носителем. Механизм активации пластика альдегидом детально не изучен. Не исключено, что глутаровый альдегид, в основном существующий в форме олигомеров, просто прочно адсорбируется на поверхности полимера. Это согласуется с данными о минимальной фиксирующей способности мономерной формы альдегида. В связи с этим употребляемый в литературе в данном случае термин ковалентная иммобилизация является некорректным, так как ковалентная связь образуется только между белком и сшивающим антигеном, но не между белком и носителем. Однако экспериментально показано, что прочность связывания антител с полимером в результате подобной процедуры возрастает. Например, при адсорбции антител против HBs-антигена на планшетах ИЗ поливинилхлорида в процессе инкубации с сывороткой крови десорбируется до 43%, а при связывании через глутаровый альдегид— до 12% ангител соответственно. [c.207]

Аффинная иммобилизация антител, выделение специфических антител из сыворотки включает стадию их адсорбции на иммобилизованном антигене и последующую элюцию путем разрушения связи антиген — антитело при сильно кислых или щелочных значениях pH либо концентрированными растворами солей (например, ЫН4СЫ5). Выделение в столь экстремальных условиях может неблагоприятно сказываться на аффинности антител, а последующее ковалентное или адсорбционное закрепление молекул на носителе в ряде случаев приводит к дальнейшему снижению способности эффективно связывать антиген. [c.210]

В ряде случаев прямая адсорбция антигена на поверхности полимерных носителей невозможна или нежелательна. Чаш,е всего с подобной ситуацией приходится встречаться, когда антигенами являются низкомолекулярные соединения, имеюш,ие одну антигенную детерминанту, например лекарственные препараты, пестициды, некоторые стероидные и тироидные гормоны и т. д. [c.213]

Концентрация фракции антител с высоким эффективным значением константы связывания, как правило, значительно ниже, чем с низким. Для разработки суперчувствительных систем детекции бывает необходимо выделять наиболее высокоаффинную фракцию и использовать в анализе только ее. Это может достигаться путем адсорбции антител на иммобилизованном антигене и последующей их элюцией линейным или ступенчатым градиентом pH, что [c.220]

Используемый для калибровки стандартный препарат представляет собой раствор очищенного антигена определенной концентрации в той биологической жидкости, которая подлежит анализу. В тех случаях, когда это возможно, применяемая для приготовления стандарта биологическая жидкость (например, сыворотка крови) предварительно должна быть очищена от эндогенного антигена. Способ очистки зависит от природы антигена. Многие гормоны могут быть удалены из сыворотки адсорбцией на угле. Более универсальным путем, пригодным для удаления нз сыворотки любых антигенов, является иммуноадсорбция. После приготовления стандарты чаще всего лиофилизуют и хранят до использования при низкой температуре. [c.257]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология