Разделение в градиенте плотности

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

Использование золей кремнезема в качестве среды для получения градиента плотности при разделении клеток и других биологических компонентов методом центрифугирования рассматривалось в гл. 4. Кроме того, при проведении биологических исследований кремнезем может применяться в качестве носителя нли подложки культуральной среды. Такую кремнеземную подложку можно стерилизовать предварительной автоклавной обработкой, а при необходимости ее можно изготовлять в очень чистой форме, свободной от других неорганических или органических загрязнений. [c.1089]

Хотя известно, что частицы стекла можно сортировать по цветам путем магнитного разделения, тем не менее в настоящее время еще не существует окончательно разработанного экономичного метода разделения, основанного на этом принципе. Были также проведены попытки, оказавшиеся безуспешными, проводить магнитное разделение с использованием парамагнитных жидкостей для создания градиентов плотности, чувствительных к магнитному полю. [c.103]

Остановимся на трех современных методах, с помощью которых с большей или меньшей полнотой решаются рассмотренные здесь задачи. Ультрацентрифуга позволяет развить еще один интересный метод, который сводится к измерению удельного объема полимера в растворе [25]. Идея его заключается в том, чтобы создать в кювете ультрацентрифуги градиент плотности. Это осуществляется выбором бинарного растворителя и притом такого, который составлен из более легкого и более тяжелого комнонентов (например, бензола и хлороформа). Ультрацентрифугирование приводит к быстрому (в течение 3—4 часов) установлению седиментационного равновесия в растворителе. Строго говоря, к этому случаю нельзя применить закон Больцмана, так как концентрации обоих компонентов одного порядка, т. е. раствор никак нельзя считать идеальным. Однако оценку величины разделения можно все же произвести по Больцману [c.168]

По второму методу, называемому иногда методом обратного потока, осуществляют противоток нагретого и холодного вещества, в результате чего значительно увеличивается степень разделения. Обратный поток обычно возникает и поддерживается за счет градиента плотности, [c.619]

Центрифугирование в градиенте плотности используют для разделения компопептов смеси нолимеров па дискретные зоны (т. наз. зонное центрифугирование). В аналитич. УЦ возможно обнаружение микрогеля, оценка его мол. массы, определение различия в плотностях компонентов в р-ре, получение распределения гю мол. массам и химич. составу, оценка средних мол. масс (включая М ), изучение избирательной сорбции одного из растворителей полимером. Метод не чувствителен к наличию примесей, даже если они высокомолекулярны или присутствуют в больших количествах. [c.200]

Основные результаты экспериментальных исследований разделительных процессов в импульсных плазменных центрифугах с частично ионизованной плазмой сводятся к следующему. Наблюдаются изотопические разделительные эффекты, качественно описываемые центробежным механизмом. Они сопровождаются значительными радиальными градиентами плотности при скоростях вращения плазмы порядка нескольких километров в секунду (2-10 10 м/с). Разделительный эффект быстро возрастает при уменьшении массы разделяемых изотопов так, что коэффициент разделения для изотопов гелия и водорода может достигать 5 -ь 10, в то время как для смеси изотопов ксенона Хе- Хе он составлял величину порядка 1,2. [c.329]

Седиментационный анализ включает следующие три основных экспериментальных метода скоростную С., изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к равновесию. Скоростная С. позволяет определить константу С. полимера и полидисперсность образца изучение седиментационного равновесия — мол. массу различных типов усреднения изучение приближения к равновесию — мол. массу (менее надежно, но и с меньшей затратой времени, чем в предыдущем методе) и неоднородность состава полимера. Процесс С., состояние равновесия и приближение к нему м. б. исследованы также в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности центрифугирование в градиенте плотности — важный метод определения мол. массы, наличия неоднородности и ее типа служит также для разделения. [c.198]

Разделение ДНК в градиенте плотности. Центрифугирование в щелочном сахароз- [c.892]

Градиент плотности широко применяется для стабилизации среды при электрофокусировании. По завершении опыта такой раствор можно собрать на коллектор для последующего анализа. Поэтому такое разделение может применяться как для аналитических, так и для препаративных целей. [c.302]

Б. Разделение тех же РНК путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и сбора проб в пробирки, как указано в подписи к фпг. 8. [c.41]

Если частицы осаждаются в градиенте плотности, составленном с таким расчетом, чтобы он включал и плотность исследуемого вещества, то после установления равновесия они образуют слой, положение которого определяется их плавучей плотностью. В тщательно контролируемых условиях удается получать очень узкие слои, или полосы, и это обеспечивает эффективное разделение частиц, одинаковых по размерам и по форме, но несколько различающихся по плотности. [c.250]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Параллельно с электрофорезом развивался и метод центрифугирования в градиенте плотности, который оказался очень полезным для препаративного разделения веществ с большим молекулярным весом. Многие проблемы, касающиеся стабильности в поле тяжести, введения образца и т. д., являются общими для электрофореза и центрифугирования и обсуждаются в работах, [c.65]

Электрофорез в градиенте плотности сочетает в себе многие преимущества как фронтального метода, так и зонального электрофореза на инертном носителе, и в то же время не имеет некоторых их недостатков. В градиенте плотности можно разделять как крайне малые, так и значительные количества вещества. В первом случае особенно важно отсутствие опасности адсорбции, которой невозможно избежать, если применяется твердый носитель. Применяя для анализа радиоактивную метку или измерения биологической активности, можно работать с субмикрограммовыми количествами вещества. Метод вполне пригоден для разделения низкомолекулярных веществ. [c.66]

В отличие от фронтального метода, где уменьшение концентрации исследуемого вещества ниже определенного предела приводит к нестабильности границ, разделение в градиенте плотности тем лучше, чем меньше эта концентрация, поскольку стабильность обеспечивается независимым способом. Мы начнем рассмотрение, предполагая, что количество разделяемого вещества мало. Дополнительные проблемы, связанные с разделением больших количеств, будут рассмотрены позднее. [c.66]

Движение зоны. Изменение состава жидкости по высоте ячейки влечет за собой изменение других свойств. Так, при использовании градиента сахарозы с глубиной растет вязкость, что приводит к уменьшению подвижности ионов, уменьшению электропроводности и увеличению напряженности поля. Возрастание напряженности лишь частично компенсирует уменьшение подвижности крупных ионов (например, белка), так как последняя сильнее зависит от вязкости. В результате движение нисходящих зон постепенно замедляется, а восходящих — ускоряется по мере их перемещения. Эту нелинейность можно скомпенсировать и даже изменить ее знак, создавая вместе с градиентом плотности градиент электропроводности в ячейке. Для этого в смеситель заливают растворы, отличающиеся не только плотностью, но и электропроводностью. Такую возможность удобно использовать при разделении сложных смесей с различными соотношениями подвижностей компонентов. Если, например, разделяется смесь трех веществ с соотношением подвижностей 1 2 4, то расстояния между зонами при равномерном движении будут относиться [c.68]

Радикальный способ борьбы с нестабильностью исходной зоны — создание идеальной треугольной формы уже в момент ее введения. Было предложено устройство, позволяющее ввести зону одновременно с градиентом плотности [14]. Оно может оказаться очень полезным при препаративном разделении больших количеств вещества. Устройство состоит из трех последовательно соединенных сосудов, первый из которых открыт, а два последних закрыты и снабжены мешалками. Образец вводится в самый маленький последний сосуд, а первый и второй заполняются буферным раствором с сахарозой. При соответствующих размерах сосудов и концентрациях сахарозы можно добиться распределения плотности, хотя и нелинейного (экспоненциального), но достаточно близкого к идеальному . Понятно, что если применяется подобное устройство, возможен только нисходящий [c.77]

Выше были описаны только основные электрофоретические методы. Кроме них, существует огромное множество их модификаций, приспособленных для специальных целей препаративного разделения в растворе, разделения микроколичеств вещества на ацетат-целлюлозных волокнах, непрерывный электрофорез, электрофорез в сочетании с хроматографией и т. д. Электрофорез является очень щадящим методом на его результаты сравнительно слабо влияют неконтролируемые изменения условий разделения pH, температуры, ионной силы раствора растворы разделяемых веществ практически не разбавляются. Несомненно, что метод находится еще в стадии развития. Особенно это относится к электрофорезу в градиенте плотности и в гелях. [c.106]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Изоэлектрическое фокусирование [42 — 45] в линейном градиенте pH позволяет разделить белки, характеризующиеся различными изоэлектрическими точками. Для создания градиента используют носители с цвнттер-ионными свойствами — алифатические полиаминополикарбоновые кислоты, имеющие М 200 — 700. При движении в градиенте pH суммарный заряд белка постоянно меняется, и в области pH, близких к изоэлектрической точке, становится равным нулю. Соответствующий белок фокусируется , образуя узкую зону. При препаративном фокусировании в колонке стабилизация градиента pH осуществляется с помощью градиента плотности используемого буферного раствора, однако чаще работают с плоскими слоями полиакриламидного или гранулированного геля. Опубликовано краткое сообщение о непрерьтном электрофокусировании без носителя [46]. Эффективность электрофокусирования высока. Так, возможно, например, разделить белки, различающиеся по ИЭТ лишь на 0,01 единицы pH. При разделении сыворотки образуется более 40 белковых полос. [c.351]

Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и pH. Градиент pH достигают прибавлением ам.-фолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлект-рических точек (р1). В результате в колонке создается градиент pH от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его р1. [c.145]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Денатурация нуклеиновых кислот сводится к разрушению двойной спирали (ДНК) илп двуспиральных участков (РНК). Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спиралп па две цени, сворачивающиеся в статистические клубки, Нри этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность поглощения в области 260 нлг. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей N, в градиенте плотности s l (ср. с. 82). Клетки Е. сой, выращенные в среде, содержащей i, переносились в среду с обычным N. При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N, другая — N. До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см отвечающий двойным спиралям N — N. После денатурации появляются два пика — 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие одноиптчатым клубкам соответственно с и., с 4, Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль. М. м. ДНК уменьшается при денатурации вдвое. Образование клубков наблюдается в электронном микроскопе. [c.233]

Нагревание раствора нативной ДНК при некоторых значениях pH и ионной силы вызывает разделение двойной спирали на две цепи, сворачивающиеся в статистические клубки. При этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность полосы поглощения в области 2600 А (см. стр. 498) [75]. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей в градиенте плотности СзС (см. стр. 153). Клетки Е. соН, выращенные в среде, содержащей переносились в среду с обычным При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N , другая — До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см , отвечающий двойным спиралям —N . После денатурации появляются два пика, а именно 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие однонитевым клубкам соответственно с и Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль [76]. Прямые определения молекулярного веса ДНК показывают, что при денатурации он уменьшается вдвое [75, 77]. Образование клубков при денатурации непосредственно наблюдается в электронном микроскопе (рис. 8.15). [c.507]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

С целью выяснить, какая из этих трех возможностей соответствует действительности, Меселсон и Сталь провели эксперименты с использованием метки и последующим разделением меченой ДНК в градиенте плотности (рис. 2.14). [c.37]

Гейдушеком и др. [26]. Используя в качестве затравки ДНК из бактериофага Т2, синтезировали РНК, меченную по фосфору, и выделили ее центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. К ней добавили ДНК из фага Т2. Затем смесь нагревали в течение 10 мин до 100°, чтобы вызвать разделение двух цепей ДНК. Потом ее медленно охлан дали и оставили при 40° на 12 час. Об образовании гибрида в ходе отншга говорили результаты центрифугирования в градиенте плотности. Была получена всего одна полоса этот факт подтверждается как данными оптических измерений, так и измерениями радиоактивности. В контроле на холоде (12 час при 0°) была обнаружена только [c.233]

Фиг. 83. Разделение различных клеточных РНК центрифугированием в градиенте плотности s l.

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

Метод седиментации в градиенте плотности СзС1 применяют, в частности, для разделения Н - и М -ДНК. В результате центрифугирования получают два отдельных пика, соответствующих разности в плотностях, равной всего 0,014 г/см . Относительные количества ДНК каждого типа определяют посредством фотографирования в ультрафиолете (интенсивность поглощения рассчитывают по степени почернения фотопластинки). Метод седиментации в градиенте плотности позволяет также изучать нуклеотидный состав ДНК из разных источников, поскольку различия в нуклеотидном составе приводят к различиям в плотности. (Препараты ДНК, содержащие большое количество пар гуанин — цитозин, обладают более высокой плотностью, чем препараты с высоким содержанием аденина и тимина.) Эти работы будут рассмотрены более подробно в разд. 3 и 4 гл. ХУП1. Применение описанного метода к белкам встречает ряд затруднений, связанных с тем, что молекулярный вес белков составляет всего 1% от молекулярного веса ДНК и они образуют в растворах с таким же градиентом плотности очень широкие полосы (в 10 раз шире, чем ДНК). Такая полоса может занять всю ячейку. Осаждение белков с помощью сульфата аммония, добавляемого в небольших количествах, позволяет заметно сузить полосы. [c.196]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]