Активность раствора фермента

Структурные и термодинамические предпосылки механизма сближения и ориентации в ферментативном катализе. Итак, для эффективности катализа важно, чтобы замораживание реагирующих центров X и Y, которое происходит в комплексе XE-RY (и сопровождает образование связи E-R), как можно больше приблизило реакцию к переходному состоянию X...Y. Для этого необходимо, чтобы строение активного центра в высшей мере было комплементарным по отношению к той структуре молекулы субстрата, которую она должна принять в переходном состоянии реакции. Именно поэтому активный центр ферментов расположен обычно в складках полипептидных цепей, образующих как бы щель . Где-то в глубинных участках этой щели расположены аминокислотные остатки, взаимодействующие с субстратом. Благодаря такой структуре активного центра при переходе молекулы субстрата из свободнодвижущегося состояния (из раствора) в сорбированное состояние (когда она, образно говоря, втискивается в активный центр) происходит необходимое для реакции замораживание вращательных степеней свободы и сближение ее с каталитически активными группами белка. [c.56]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

МИД, возникают положительно заряженные поверхности, образованные катионными головками ПАВ. Под действием кулоновских сил притяжения ионы брома собираются вблизи четвертичных атомов азота. Вокруг мицеллы формируется так называемый слой Штерна, где и проявляются наиболее интересные особенности химии мицелл. Внутри мицелла содержит очень мало молекул воды и образует углеводородное ядро. Именно это различие в полярности между внутренней частью и поверхностью делает мицеллы сходными с глобулярными белками. Полярность мицеллярных поверхностей в общем случае близка к полярности белков и занимает промежуточное положение менаду водой и этанолом. Поскольку активный центр фермента, очевидно, вовсе не полярен, даже когда фермент растворим в воде, весьма полезно и необходимо изучение мицелл [154, 155]. [c.284]

Один из наиболее интересных выводов, к которым приводит модель ключа и замка , объясняющая механизм ферментативного действия, заключается в том, что определенные молекулы способны ингибировать фермент. Допустим, что некоторая молекула способна притереться к активному центру фермента, но по какой-либо причине не обладает реакционной способностью. Если такие молекулы присутствуют в растворе наряду с субстратом, они конкурируют с ним за связывание с активными центрами. Это препятствует образованию необходимых фермент-субстратных комплексов и понижает скорость образования продукта. Металлы с высокой токсичностью, например свинец и ртуть, по-видимому, действуют как ингибиторы ферментов. Ионы тяжелых металлов особенно прочно связываются с серусодержащими группами белковых боковых цепей. В результате образования прочных комплексов с этими центрами белков они препятствуют нормальным реакциям ферментов. [c.454]

Механизмы метаболических процессов очень напоминают механизмы реакций, проводимых в лабораторных условиях, с тем отличием, что если в лаборатории часто работают прн повышенных температурах и давлении, с безводными (часто ядовитыми) растворителями, с сильными кислотами и основаниями и с нетипичными для природы реагентами, то метаболические процессы протекают при весьма умеренных условиях в разбавленных водных растворах в интервале температур от 20 до 40 °С при pH от 6 до 8 и с участием чрезвычайно эффективных катализаторов — ферментов. Можно сказать, что каждая ступень метаболического процесса катализируется специфическим ферментом. Ферменты представляют собой вещества белковой природы их каталитическое действие оказывает влияние не на положение равновесия реакции, а на ее скорость, которая очень сильно увеличивается — часто на несколько порядков по сравнению со скоростью реакции, проводимой в лабораторных условиях. В состав некоторых ферментов входят коферменты, имеющие небелковый характер. Подвергающийся превращению субстрат сначала связывается с активным центром фермента, поблизости от которого расположен кофер-мент. При этом реагирующая группа субстрата и кофермент так сориентированы в пространстве, что реакция между ними протекает практически мгновенно. Затем прореагировавший субстрат отделяется от активного центра фермента, а измененный кофермент регенерируется под действием другого субстрата. Если в ферменте нет кофермента, то два субстрата непосредственно взаимодействуют в активном центре. [c.180]

Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитов сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. [c.88]

Перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий завершает цитохромоксидаза (цитохром сЮг-оксидоредуктаза, комплекс IV), катализирующая реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды. Донором электронов для фермента служит ферроцитохром с. Реакция специфически блокируется цианид- и азид-ионами, а также окисью углерода. Цитохромоксидаза прочно связана с внутренней мембраной митохондрий и является интегральным мембранным белком в раствор фермент может быть высвобожден лишь после растворения мембраны высокими концентрациями детергентов. В нативной мембране, а также в растворах неионных детергентов (тритон Х-100, твин-80, Emasol-1130) цитохромоксидаза присутствует в виде высокоактивного димера. Некоторые воздействия (рН>8,5, высокие концентрации солей и неионных детергентов) вызывают появление мономерных форм фермента. Каталитическая активность цитохромоксидазы зависит от степени агрегации молекулы фермента. [c.432]

При воздействии кавитационного ультразвука происходит необратимая инактивация лизоцима [64], вызванная, видимо, разрушением какой-либо важной для каталитической активности функциональной группы активного центра фермента. В роли такой лабильной группы могут выступать, например, остатки триптофана 62, 63 или 108 активного центра лизоцима, модификация которых приводит к потере ферментативной активности [66—69]. Умень-ше(гие ферментативной активности лизоцима ирй озвучивании раствора фермента следует кинетике первого порядка [64]. [c.160]

Реакции- синтеза и гидролиза АТФ катализируются АТФ-синтетазным комплексом, локализованным во внутренней мембране митохондрий. Обе реакции сопряжены с трансмембранным переносом Н+. Н+—АТФаза митохондрий сердца быка состоит из фактора и мембранного компонента / о- Фактор Р может быть отделен от мембраны и катализировать гидролиз АТФ в растворе. Реакция синтеза АТФ, сопряженная с трансмембранным переносом Н+, протекает только в том случае, когда фактор Р связан с мембраной. Мембранный компонент АТФ-синтетазного комплекса образует протонный канал , обеспечивая транспорт Н+ с внешней стороны митохондриальной мембраны к фактору Р, где находится активный центр фермента. [c.474]

Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение кислых и основных молекул белков по их заряду в электрическом поле. Ферменты при достаточной степени очистки их раствора можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжает увеличиваться активность фермента. [c.203]

Под действием ультразвука происходит необратимая инактивация фермента а-химотрипсина. В табл. 7 приведены значения ферментативной активности при различных временах озвучивания раствора фермента. Найти порядок реакции и константу скорости инактивации. [c.11]

Из данных таблицы следует, что в процессе очистки удельная активность гиалуронидазы увеличивается в 8 раз, кроме этого, и общая активность препарата возрастает в 2 раза за счет, вероятно, удаления ингибиторов фермента. Наименьшая кратность очистки наблюдалась при пропускании раствора фермента через сорбент без остановки. Оптимальное время связывание препарата с сорбентом — 20 минут. [c.97]

Растворы ферментов при длительном хранении теряют активность, поэтому их необходимо готовить из расчета на 3—5 дней. Для приготовления рабочего раствора навеску фермента растирают с небольшим количеством холодной воды до получения равномерной увлажненной массы, затем прибавляют при перемешивании еще некоторое количество воды и после этого - отдельно приготовленную остальную часть раствора. [c.222]

Ферменты представляется возможным прикрепить к поверхности носителя путем сорбции к ионитам — катионитам (содержащие активные кислотные группы) или к анионитам (содержащим преимущественно основные группы). В качестве сорбентов — носителей ферментов часто используют гель гидроокиси алюминия или фосфата кальция, диатомит, модифицированный крахмал, бентониты, кизельгуры и др. Сорбцию ферментов осуществляют либо в колонках путем пропускания раствора фермента с определенной скоростью через слой ионитов, либо в реакторах, в которых сорбент определенное время перемешивают с раствором фермента. Полученный продукт затем используют как иммобилизованный ферментный препарат. Адсорбция фермента к носителю не обеспечивает их длительную стабилизацию. Более длительную стабилизацию обеспечивает ионообменное связывание фермента, например на модифицированных ионообменных целлюлозах. [c.205]

В сущности, согласно гипотезе Кошланда, повышение скорости реакции образования лактонов во внутримолекулярной реакции вызвано тем, что нути сближения реагирующих групп ограничены некоторыми вполне определенными направлениями в противоположность статистической ориентации, наблюдаемой при бимолекулярной реакции. Кошланд считает, что орбитальное управление способно объяснить, почему ферменты столь эффективны. Вероятно, ферменты выстраивают связывающие орбитали реагирующих молекул и каталитических групп с точностью, невозможной при обычном бимолекулярном столкновении в растворе. Фермент не только сближает субстраты, (эффект сближения Брюса) существует еще фактор ориентации, связанный с формой электронных орбиталей реагпиюнноспособных атомов. Это-то и должно вызывать уникалы, ю каталитическую активность ферментов. Удивительная каталитическая активность ферментов, следовательно, вытекает не только из их способности приблихоть реагирующие атомы, но также и направлять орби- [c.212]

Принимая, что механизм реакции согласуется со схемой (9.8), рассчитать начальную концентрацию активных центров фермента в растворе. [c.195]

Холинэстеразы с высокой скоростью гидролизуют холиновые и тиохолиновые эфиры. Возможность аналитического применения холинэстераз обусловлена тем, что их активность в заметной мере зависит от присутствия в растворе токсичных веществ (ингибиторов) [83,84], причем некоторые из них действуют необратимо, а другие - обратимо. К необратимым ингибиторам холинэстераз относятся эфиры фосфорной, фосфо-новой и пирофосфорной кислот, в том числе и фосфорорганические пестициды, многие из которых являются суперэкотоксикангами. Действие этих соединений на холинэстеразы специфично они ковалентно связываются с активным центром фермента и дезактивируют его. Из обратимых ингибиторов интерес представляют ионы ртути, свинца и других тяжелых металлов. Высокая чувствительность холинэстераз к присутствию токсичных веществ обусловливает и область их применения сельское хозяйство, экология, токсикология и др. [c.289]

Если повысить концентрацию субстрата, сохраняя постоянной концентрацию фермента, то скорость возрастает пропорционально концентрации субстрата но если увеличивать все больше и больше концентрацию субстрата, то настанет такой момент, когда скорость не будет меняться с ростом концентрации субстрата. Действительно, когда все активные центры фермента заняты, дальнейшее повышение концентрации 3 в растворе не приводит к увеличению скорости реакции. [c.152]

Пируваткиназа. Раствор фермента разводят трис-НС1 буфером непосредственно перед определением активности. [c.270]

Полимолекулярные пленки белков позволяют изучать некоторые ферментативные реакции, устанавливать структурные особенности белковых молекул, научать иммунохимические явления и др. В частности, для изучения влияния линндных слоев на активность ферментов на гидрофильную и гидрофобную, т. е. смачиваемую и несмачиваемую водой, поверхности стекла наносили слои стеариновой кислоты различной кратности, а затем на эти поверхности из объема раствора наносили каталазу. Схема строения слоев стеариновой кислоты н фермента (Ф) показана на рис. 18. Оказалось, что большей активностью обладает фермент, адсорбирующийся на четном числе слоев стеариновой кислоты, если поверхность стекла вначале была гидрофильной. Такой же результат был получен при адсорбции фермента на нечетном числе слоев, нанесенных на гидрофобную поверхность. Это означает, что гидрофильная поверхность карбоксильных групп не инактивирует фермент. [c.47]

Лля приближенных расчетов может быть использована более простая формула определения активности (в международных единицах — мкмоль/мин на 1 г ферментного препарата или 1 мл раствора фермента) [c.147]

Определение. 4 мл раствора КМЦ (15 г/л) в 0,1 М ацетатном буфере помещают в пробирку с пробкой, прогревают 5 мин и вносят прогретый раствор фермента в количестве 0,02-2 мл (в зависимости от активности). Общий объем реакционной смеси [c.147]

Ферменты разводят на трис-НС1 буфере непосредственно перед определением ферментативной активности. Растворы ферментов, АТФ, НАДФ до внесения в реакционную смесь хранят на льду. [c.217]

Так как величины Кт я V могут по-разному зависеть от pH, исследование, проводимое при ненасыщающих концентрациях субстрата, дает информацию, которую трудно интерпретировать. Поэтому необходима постановка экспериментов по определению влияния pH на Кт. и V. Следует помнить, что концентрация субстрата, являющаяся насыщающей при одном значении pH, при другом может йе быть ею. Выбирая буфер, нужно учитывать, чтобы его рК был по возможности близок к оптимуму pH реакции, а также иметь в виду, что при одном и том же pH в разных буферах каталитическая активность может различаться. Отдельные ионы могут оказывать активирующее или ингибирующее влияние на фермент. Поливалентные анионы (фосфат, сульфат, цитрат) могут конкурировать с отрицательно заряженным субстратом, вызывая ингибирование реакции. Отдельные компоненты буфера, например ЭДТА, гистидин, цитрат, могут связывать ионы металлов, важные для активности некоторых ферментов. Следует иметь в виду, что ионная сила раствора оказывает влияние на активность фермента. Поэтому, изменяя состав реакционной среды, необходимо обеспечивать постоянство ионной силы. [c.211]

Очистка препарата тяжелого меромиозина осаждением сернокислым аммонием. Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40—60% насыщения Следует, однако, соблюдать два условия во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать pH последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме (3—6 мл) бидистиллята и диализуют при О—4 °С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов 5042- с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует отцентрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1—10 мг/мл. [c.395]

К активированной сефарозе добавляют равный объем раствора фермента (1 мл на 1 г сефарозы) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2,5—3,0 ч при перемешивании. К суспензии добавляют сухой глицин до конечной концентрации 50 мМ и оставляют при перемещивании в холодной комнате на ночь. Сефарозу отмывают в колонке или на стеклянном фильтре буфером А от неспецифически адсорбировавшегося белка и глицина до исчезновения в элюате поглощения при 280 нм и прекращения активности фермента. [c.298]

При сорбции активным центром молекула субстрата переходит из водного окружения в окружение, созданное аминокислотными остатками. Субстрат оказывается в окружении с малой диэлектрической проницаемостью, в котором могут осуществиться сильные электрические взаимодействия между реагентами и полярными группами ферл1ента. Развивая идею фермент — растворитель , Перутц приходит к заключению о том, что электростатические взаимодействия дают главный вклад в энергетику ферментативного катализа, т. е. в понижение энергии активации, вызываемое ферментом. Отличие фермента от водного раствора состоит в том, что в активном центре фермента располагаются диполи с фиксированной ориентацией по отношению к заряженным группам субстрата, даже если поле этих зарядов мало. Вследствие такой ориентации ферменты могут стабилизировать пары ионов и другие распределения зарядов значительно больше, чем вода. В водных растворах электростатическое притяже- [c.192]

Измерение сукцинатдегидрогеназной активности. В кювете спектрофотометра составляют смесь, состоящую из 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,8), 10 мМ сукцината, бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и 2 мМ феррицианида калия. Регистрируют оптическую плотность при 420 нм (коэффициент молярной экстинкции феррицианида равен ЫО М.- -см ). В кювету добавляют раствор фермента (около 0,1 мл) и регистрируют сукцинат феррицианид-редуктазную активность, отмечая показания спектрофотометра через каждые 30 с. [c.418]

Трудно сейчас представить, что не только Р. Вильщтеттер еще в 1926 г. отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо известному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались сомнения на этот счет. Поводом для сомнений являлись опыты, в которых хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется это тем, что концентрация фермента даже при высокой удельной активности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на белок. [c.118]

Смотреть страницы где упоминается термин Активность раствора фермента: [c.122] [c.147] [c.206] [c.282] [c.160] [c.515] [c.726] [c.395] [c.434] [c.418] [c.418] [c.32] [c.45] [c.51] [c.120] [c.140] [c.515] [c.148] [c.149] [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология