Замораживание белковых растворов

Структурные и термодинамические предпосылки механизма сближения и ориентации в ферментативном катализе. Итак, для эффективности катализа важно, чтобы замораживание реагирующих центров X и Y, которое происходит в комплексе XE-RY (и сопровождает образование связи E-R), как можно больше приблизило реакцию к переходному состоянию X...Y. Для этого необходимо, чтобы строение активного центра в высшей мере было комплементарным по отношению к той структуре молекулы субстрата, которую она должна принять в переходном состоянии реакции. Именно поэтому активный центр ферментов расположен обычно в складках полипептидных цепей, образующих как бы щель . Где-то в глубинных участках этой щели расположены аминокислотные остатки, взаимодействующие с субстратом. Благодаря такой структуре активного центра при переходе молекулы субстрата из свободнодвижущегося состояния (из раствора) в сорбированное состояние (когда она, образно говоря, втискивается в активный центр) происходит необходимое для реакции замораживание вращательных степеней свободы и сближение ее с каталитически активными группами белка. [c.56]

Эритроциты человека (и других млекопитающих) не содержат ядер и митохондрий, а следовательно, белков и других веществ, характерных для этих органелл. Около 90% белков эритроцита приходится на долю НЬ. По этой причине получать чистые препараты НЬ довольно легко, достаточно отделить от плазмы эритроциты центрифугированием и разрушить клеточную оболочку. Это может быть достигнуто несколькими способами, например неоднократным замораживанием и размораживанием эритроцитов в дистиллированной воде либо действием растворов детергентов, способствующих удалению липидов из оболочки. [c.7]

Методы определения этих двух частей воды были самыми разнообразными. Так, в некоторых опытах количество свободной воды оценивалось по увеличению объема, которым сопровождалось замораживание раствора белка. В других эту величину пытались оценить по растворимости различных неэлектролитов (мочевина, глюкоза и т. п.) в растворах белка. Однако оба эти приема не могли дать удовлетворительных результатов, поскольку при замораживании часть свободной воды могла оставаться в виде переохлажденной жидкости, а при растворении в белковых растворах неэлектролитов последние могли [c.176]

Сухие нативные белки денатурируются при сильном растирании их порошков [164]. В этих случаях денатурация, очевидно, обусловлена механической деформацией пептидных цепей или их разрывом. Большинство белков не денатурируется, если их растворы подвергать повторному замораживанию и оттаиванию [126]. Однако растворимость липопротеидов и биологические свойства некоторых антител меняются при таком воздействии [28]. Вопрос о денатурации при замораживании имеет очень большое значение при разрешении ряда проблем, касающихся технологии замораживания пищевых продуктов [165]. [c.152]

После кристаллизации вещество растворяют в небольшом объеме воды и все ионы аммония удаляют диализом при 4° против дистиллированной воды. Оставшийся раствор замораживают, высушивают и сохраняют в виде белого порошка. При такой обработке небольшое количество белка денатурируется, поэтому раствор, приготовленный из высушенного замораживанием препарата, слегка опалесцирует. Денатурированный белок можно получить иным путем, а именно выливанием раствора белка при температуре около 90° в воду при помешивании (воды приблизительно в 5 раз больше, чем белка) или в охлажденный метанол (примерно 5 объемов). Полученные таким путем препараты фильтруют, промывают водой и этанолом и высушивают эфиром. [c.8]

Картофельный крахмал, например, полностью растворяется в холодной воде после размола в течение 120—150 ч [449]. Растворимость крахмала изменяется также после нескольких циклов замораживания — размораживания [69]. Большое число экспериментов такого рода выполнено на белках [914, 915, 918, 1157]. Гольевой порошок и желатина становятся растворимыми в воде [c.64]

Разновидность метода электронной микроскопии — замораживание—скалывание . Его применяют для изучения характера связывания белков с мембранами. Для этого образец, не требующий химической фиксации, замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают в плоскости наименьшего сопротивления холодным ножом в вакууме. Плоскость наименьшего сопротивления проходит между двумя слоями липидной фазы мембраны. Далее поверхность образца покрывается платиной и углеродом, его растворяют и отпечаток (реплику) рассматривают в элект- [c.207]

Наиболее распространена как метод концентрирования растворов белков лиофилизация. При интенсивном охлаждении (ацетон, этанол или изопропанол в смеси с твердой углекислотой) раствор замораживают и удаляют воду и летучие буферы в вакууме масляного насоса, снабженного специальной ловушкой. Ловушка заполняется щелочью, если упариваются кислые растворы концентрированная муравьиная кислота перед замораживанием должна быть разбавлена водой до 30%-ной концентрации. [c.246]

Калориметрические исследования показывают, что при замораживании раствора белка около двух молей воды на моль аминокислот (0,4 г Н2О иа 1 г белка) остаются в незамороженном состоянии. Ясно, что состояние этой воды обусловлено присутствием белка. По данным ЯМР и диэлектрической дисперсии в белковом растворе при комнатной температуре каждая аминокислота ограничивает свободу движения нескольких молекул воды. По-видимому, эти молекулы воды взаимодействуют с белком либо настолько часто, либо настолько прочно, что в результате скорость вращательного движения молекул воды уменьшается. Однако не ясно, тождественны ли эти молекулы тем, которые по данным калориметрии не кристаллизуются при охлаждении. Имеются и другие молекулы воды, связывающиеся с макромолекулами более слабо, но тем не менее вносящие свой вклад в свойства водных растворов белков. Часть воды может задерживаться в полостях или углублениях молекулы белка. Даже не будучи прочно связанной, она будет двигаться с белком, что приведет к увеличению кажущегося размера молекулы белка. Такая вода будет влиять на гидродинамические свойства, но ее нельзя выявить как связанную ни методом ЯМР, ни термодинамическими методами. [c.189]

Количественные опыты по исследованию влияния" скорости"и" продолжительности сбивания, температуры, значения pH и прибавления воды и масла, а также замораживания белка на устойчивость пены были выполнены Генри и Барбором [94]. В их работе приводятся снимки исследованных пен. При употреблении высушенного белка для приготовления растворов необходимо, невидимому, проводить легкое предварительное сбраживание белка, так как лри брожении,получаются вещества, способствую-, щне образованию устойчивой пены [95]. [c.111]

Снижение эффективной активности воды, как правило, бывает полезным для ферментов, если оно осуществляется способами, не оказывающими дестабилизирующего действия на белок. Высокие концентрации сернокислого аммония, при которых фермент осаждается, проявляют сильное стабилизирующее влияние, и фактически большинство ферментов, имеющихся в продаже, представляют собой суспензии в 2—3 М сернокислом аммонии. Кроме того, для сох ранеиия активности ферментов, а также для предотвращения бактериального загрязнения используется 50%-ный глицерин или лиофилизация. Во время очистки ферментов обычно необходимо оставлять фракции на ночь или даже на более длительное время, и в данном случае следует уделять особое внимание оптимизации условий хранения. При фракционировании сернокислым аммонием фермент нужно оставлять в системе, содержащей как можно более высокую концентрацию сернокислого аммония, например в виде осадка, а не раствора, полученного после его повторного растворения. Если нельзя избежать хранения ферментного раствора в отсутствие защитных агентов, то следует оценить относительные преимущества кратковременного замораживания этого раствора или хранения его при температуре около 0°С в присутствии протеолитических ингибитаров. Замораживание может инактивировать ферменты. Чувствительность различных ферментов к замораживанию очень сильно варьирует. Потери всегда будут меньше, если начальная концентрация белка высока. Не рекомендуется замораживать раствор с концентрацией белка ниже чем около 2 мг-мл . Следует помнить, что во время замораживания сначала заме рзает чистая вода, что сопровождается повышением концентрации белка и других растворимых веществ. Затем выпадают в осадок наименее растворимые ве- [c.259]

К физическим факторам могут быть отнесены температурный—нагревание растворов выше 50—60° С многократное чередование замораживания и оттаивания денатурация под высоким давлением в 1000 кг/см и выше так, напрнмер, ферменты трипсин и химотрипсин при pH 5,0—5,2 под воздействием давления 7750 кг см через 5 мин инактивируются на 50% денатурация при воздействии ультразвуковых волн связана с разворачиванием молекул, а при более сильном воздействии ультразвука происходит даже paзpyшefIi e ковалентных связей при образовании мономолекулярных пленок на поверхности белковых растворов наблюдается так называемая поверхностная денатурация белка ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают химические говреждеиия белковой молекулы, разрушая водородные связи, окисляя дисульфидные группировки, обусловливают исчезновение нативных третичных и вторичных структур белка. Интересными также являются наблюдения, указывающие на процессы денатурации, происходящие при старении белков. [c.209]

Эта технология текстурирования основана на явлении криоконцентрации, при которой белковый раствор замораживается, образуются кристаллы льда, а макромолекулы концентрируются в той части воды, которая остается жидкой. Количество остающейся в жидком состоянии воды зависит от условий замораживания и состава раствора, в котором диспергированы белки. В этом случае макромолекулы очень сильно сближаются (рис. 11.11), спо- [c.558]

Считается, что сефароза устойчива в области pH 4—9 с ней не рекомендуется работать при температурах иже 0°С или выше 40 °С. Сефароза устойчива к действию концентрированных растворов солей или мочевины. Куатреказас [14] указывает,, что на частицы агарозы существенно не влияет продолжительное воздействие 6М раствора гуанидинхлорида или 7М раствора мочевины. Поэтому агарозные аффинные сорбенты можно отмывать от белков этими денатурирующими растворами. В течение 2—3 ч при комнатной температуре на агарозу не действуют 0,1М гидроксид натрия или 1М хлорная кислота. Ни 50%-ный (по объему) водный диметилформамид, ни 50%-ный (по объему) водный этиленгликоль не меняют структуру агарозы. Эти растворители полезны при аффинной хроматографии относительно плохо растворимых в воде соединений, например тироксина и стероидов. Аффинные сорбенты на основе сефарозы можно хранить при 4° С в виде водной суспензии с до бавкой антибактериального агента. Длительность хранения определяется лишь стабильностью связанного аффинного лиганда. Однако агарозные аффинные сорбенты полностью разрушаются при высушивании или замораживании. Согласно данным Аксена и Эрнбека )[3], эти сорбенты можно лиофилизовать, если добавить к ним декстран, глюкозу и сывороточный альбумин. Химическая стабильность биогеля А такая же, как у сефарозы. [c.16]

Опыты показали, что в состоянии переохлаждения, т. е. без образования льда, растения без вреда переносят такие низкие температуры, которые их неизбежно губят, если начинается замерзание. И если растения часто выносят низкие температуры, перезимовывают, то этому способствует ряд фaктqpoв. Одним из них является понижение точки замерзания клеточных и тканевых соков благодаря тому, что в них растворены различные электролиты и неэлектролиты. Среди последних значительную роль играет глюкоза (виноградный саха р), количестто которой под влиянием понижения температуры увеличивается за счет гидролитического распада крахмала. Но сахар действует не только тем, что понижает температуру замерзания. Как показали исследования, сахар оказывает запщтное действие, так как при замораживании предохраняет белки растительных соков от коапуляции. [c.294]

Как правило, процессы очистки большинства белков не удается завершить в течение одного рабочего дня. Поэтому возникает необходимость кратковременного хранения (до 1— 2 недель) промежуточных препаратов. Лучше всего хранить их взамороженном состояни и — при —10- —20° и ниже. Следует, однако, учитывать, что сам процесс замораживания ведет к неравномерному распределению влаги, солей и белка в замороженной массе, что не всегда безразлично для состояния белка. В частности, при замораживании происходит распад некоторых липопротеинов. Для многих белков вполне возможно кратковременное хранение при 0 4-4°. При этом лучше сохраняются концентрированные белковые растворы и осадки с высоким содержанием нейтральных солей (хлориды, сульфаты, ацетаты, фосфаты и карбонаты натрия, калия и аммония). [c.12]

Извлечение белков из геля связано с известными затруднениями. При замораживании и оттаивании геля образуется губчатая масса, из которой можно отсосать раствор, содержащий белок, но более высокий выход получают центрифугированием при умеренной скорости. При продолжительном хранении геля в замороженном состоянии происходит необратимая адсорбция некоторых белков. Гордон [20] описал остроумный метод, согласно которому белки из ломтиков геля удаляли путем вторичного электрофореза и улавливали их в небольшой объем раствора по одну сторону барьера из целлофановой пленки. Этот метод дает хорошие результаты в опытах с белками сыворотки, за исключением у-глобулпна. [c.257]

Самый лучший способ длительного хранения белковых растворов состоит поэтому в том, чтобы хранить их в замороженном состоянии, примерно при —10°. Так как при этой температуре бактерии не могут размножаться, то стерилизация раствора становится излишней. В лаборатории автора растворы антител и ферментов хранятся в замороженном состоянии в течение многих месяцев, а некоторые — в течение многих лет без какой-либо заметной потери биологической активности. Однако из этого общего правила имеются исключения например, некоторые из испытанных растворов антител теряли свою активность прн повторном оттаивании и замораживании, несмотря на то, что температура никогда не поднималась выше 0° [4]. Липопро-теины также денатурируются при замораживании и оттаивании [2]. Наоборот, при замораживании и последующем оттаивании зимазы наблюдается увеличение ее активности, обусловленное, по всей вероятности, дезагрегацией частичек фермента в растворе [5]. С другой стороны, было найдено, что растворы яичного альбумина при старении мутнели в результате агрегации молекул альбумина, тогда как способность белка к кристаллизации при старении не изменялась [6]. [c.9]

Перевод белков ткани в раствор. Гомогенизация — перевод исследуемого материала в гомогенное состояние. При этом используются ступки, ножевые, пестиковые гомогенизаторы, ультразвук, замораживание — оттаивание и прочие способы для разрушения структур тканей. Экстракция белков проводится обычно параллельно с гомогенизацией. Ввиду того что большинство белков тканей хорошо растворимы, для экстракции применяют 8-10% растворы солей (Na l, K l и др.) буферные растворы органические растворители и детергенты, "нарушающие гидрофобные взаимодействия сахарозу, глицерин. Осветление гомогената (экстракта) осуществляется [c.49]

Определите выход антител, измерив содержание белка в диализованном растворе с помощью биуретовой реакции или измерив поглощение при 280 нм. Поглощение при 280 нм, равное 1,4, соответствует концентрации IgG 1 мг/мл. Храните IgG в 0,02%-ном растворе NaNs при —20 °С, разлив их на аликвоты. Избега йте повторного замораживания. [c.167]

Изнутри к клеточной стенке примыкает избирательно прони -цаемая плазматическая мембрана — плазмалемма, окружаю -щая всю цитоплазму н состоящая из белков и фосфолипидов Отдельные органеллы, например хлоропласты (центры фотосинтеза) и митохондрии (в которых протекает процесс дыхания)у. также окружены мембраной. Почти все части клетки пронизывает система взаимосвязанных секреторных м мбран — эндо-плазматический ретикулум. Стопки мембранных дисков — аппарат Гольджи или диктиосомы, — принимают, по-видимому участие в образовании вакуолей, также ограниченных мембра ной (тонопластом) и содержащих раствор различных органи ческих и неорганических веществ. Внутреннюю структуру мембран изучают методом замораживания — травления. Клетк№ прн этом замораживают и раскалывают тупым ножом. Раскалываются они вдоль естественных поверхностей, обычно вдоль мембран. После этого лед удаляют возгонкой под вакуумом и обнажившиеся участки напыляют углем или металлом. [c.78]

Левит объяснил гибель растительных клеток в процессе замораживания следующим образом. Избирательно проницаемая плазматическая мембрана (2) растительной клетки (рис. 23) располагается под жесткой, хорошо проницаемой для разных веществ клеточной оболочкой (У) и частично связана с ней. Поэтому в гипертоническом растворе, когда клетка обезвоживается, область Л плазматической мембраны, не связанная с клеточной стенкой, подвергается растяжению. Растяжение мембраны, по мнению Левита, влечет за собой появление разрывов в липидном слое, вследствие чего оказывается возможным контакт белков, расположенных по обе стороны этого слоя, и образование прочных дисульфидных связей зиежду ними. Если таковые возникают, то после оттаивания аномальные связи между белками, которые находятся во внешнем и внутреннем монослоях мембраны, сохраняются, а целостность липидного слоя не восстанавливается. Этим объясняется утрата плазматической мембраной свойства избирательной проницаемости после замораживания. Кроме того, в соответствии с указанными представлениями в процессе замораживания образуются прочные дисульфидные связи между белками мембран и прилегающими к ним белками плазмы, что ведет к необратимому повышению жесткости поверхности мембраны. Из-за этого при реаккумуляции воды клетками мембрана растягивается хуже, чем в процессе обезвоживания, что может привести к ее разрыву на этапе отогрева. В пользу выдвинутой Левитом гипотезы свидетельствует понижение содержания 5Н-групп в растениях, подвергнутых ХОЛОДОВОЙ закалке , по сравнению с незакаленными . [c.54]

К первому типу относятся такие явления, как 1) чрезмерное осмотическое обезвоживание клеток, в результате которого уве-ллчивается концентрация внутриклеточных веществ, приводящая к высаливанию и необратимой денатурации растворимых белков или к повреждению мембранных структур из-за потери обеспечивающей их нормальное состояние доли воды 2) разрушение клетки за счет контакта с омывающей кристаллы льда средсгй., концентрация растворенных веществ в которой из-за превраще -ния части растворителя в лед непрерывно увеличивается вплоть до эвтектической области 3) резкое изменение кислотности иг ионной силы растворов вне и внутри клеток в процессе замораживания 4) повреждение клеточной мембраны вследствие до<-стижения клеткой минимального объема. [c.57]

Согласно методике Спакмена и сотр. [41], впервые использованной при изучении рибонуклеазы А, 0,17о-ный раствор белка в 0,05 М Ыа-цитратном буфере (pH 1,0) инкубируют с пепсином при соотношении фермент субстрат 1 50 при 25 °С в течение 16 ч. Последующие модификации методики включают увеличение концентрации фермента, проведение инкубации при 37 °С, уменьшение времени гидролиза, применение других растворителей, например 5%-ной муравьиной кислоты и 0,03 М НС1 [30, 34, 42, 43]. Гидролиз останавливают замораживанием, в случае необходимости раствор лиофилизируют. Полезную информацию можно найти в разд. 3.6.3. [c.170]

Определение активности сукцинатдегидрогеназы проводили в суспензиях митохондрий печени крысы. Суспензии митохондрий подвергали замораживанию и оттаиванию с последующим отмыванием части балластных белков гипотоническим буферным раствором (0,01 М К—Ыа-фосфатный буферный раствор, pH 7,4). В таких суспензиях активность сукцинатдегидрогеназы составляла 82,1 3,5 нмоля окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка (В. 3. Горкин, Р. С. Кривченкова, 1971). [c.46]

Зависимостью а от [Е]о характеризовались препараты НАД-киназы из скелетных мышц кролика (рис. 2). Принимая во внимание то обстоятельство, что активность определяли в растворе, в условиях, при которых нельзя исключить взаимного перехода молекулярных форм, не представляется возможным судить об удельной активности каждой из них. Тем не менее форма кривой, представленной на рис. 2 Л, позволяет констатировать, что наиболее диссоциированные и наиболее ассоциированные в данных условиях формы фермента (левая и правая ветви кривой) способны осуществлять синтез НАДФ с заметно большей скоростью,, чем промежуточные формы. Форма кривой а от [ ] упрощалась, если ферментный препарат подвергался многократному замораживанию и оттаиванию в процессе его хранения. Изменение концентрации субстрата в среде инкубации также изменяло форму кривой а от [Е]о, что могло быть обусловлено его влиянием на равновесие между олигомерными формами белка [22], [c.142]

Хранение белков в замороженном виде. Если температура достаточно низка, все деградационные процессы прекращаются, и образец можно хранить в течение неопределенно долгого времени. Рекомендуется поддерживать температуру ниже —50 °С. Обычные температуры глубокого замораживания (но не выше —15°С), как правило, подходят для хранения белковых растворов в течение одной ночи. Однако не следует замораживать разбавленный раствор белков весьма вероятно, что в разбавленных растворах (<2 мг-мл ) белки будут денатурировать при замораживании и последующем их оттаивании (кроме того, такие растворы занимают больше места в морозильнике). Перед замораживанием необходимо измерить pH и убедиться, что раствор хорошо забуферен. Замораживать растворы следует в пластиковых контейнерах (стеклянные контейнеры трескаются, когда при образовании льда объем раствора увеличивается). Оттаивание замороженных растворов нужно производить быстро, погружая контейнеры в теплую воду. При проведении крупномасштабных работ для этой цели можно применять, соблюдая осторожность, микроволновую печь. Необходимо помнить, что пластики являются плохими проводниками тепла, и даже если снаружи температура воды составляет 50 °С, внутренняя поверхность контейнера будет иметь температуру не выше 30 °С если же раствор во время оттаивания перемешивать, мало вероятно, что произойдет тепловая денатурация. [c.269]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология