Ферментативные методы определения связей

Ферментативный гидролиз гликозидов. Этот наиболее старый метод определения конфигурации гликозидов, использованный впервые Э. Фишером, основан на том, что природные ферменты, выделяемые часто, как и соответствуюш,ие гликозиды, из растительных объектов, обладают строгой стереоспецифичностью. В частности, ферменты, расщепляющие гликозидные связи (гликозидазы), разделяются на а-глико-зидазы, расщепляющие только а-гликозиды, и р-гликозидазы, расщепляющие р-гликозиды. Наиболее употребительными среди первых является а-мальтаза, среди вторых — эмульсин. Для установления кон- фигурации у гликозидного атома исследуемый гликоз.ид подвергают гидролизу тем или иным ферментом и, в зависимости от того, а- или Р-гликозидаза вызовет гидролиз, относят гликозид к тому или иному типу. [c.45]

Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь,которая расположена в а-положении к свободной а-карбоксильной группе в полипептид-ной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д. [c.1049]

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии. [c.54]

Первичная структура белков устанавливается методами химической деструкции, в основном методом ступенчатого гидролиза или ферментативной деструкции с помощью различных протеаз . Используя набор различных протеаз , селективно гидролизующих связи между конкретными аминокислотами, изменяя условия ферментативного и химического гидролиза (время, температуру и pH), можно получать различные осколки, на основании которых создается представление об исходной белковой молекуле. Очень важную роль в определении первичной структуры белков сыграли методы определения концевых групп. [c.508]

В идеальном случае ферментативный гидролиз полисахаридов следует проводить ферментами высокой степени чистоты, специфичность которых установлена по их действию на производные гликозидов и на олиго- или полисахариды с точно известной структурой. Эти условия были реализованы нри исследовании ферментативного гидролиза гликогена, амилозы, амилопектина и некоторых родственных им по структуре полисахаридов. Расщепление полисахарида специфическим ферментом может указать на присутствие в нем связи (или связей), для которой этот фермент специфичен. В случае полисахарида, содержащего не один тип связей, а более, можно провести избирательный гидролиз определенной связи, и полученный остаток проанализировать физическими, химическими или иммунологическими методами, либо для получения дополнительной структурной информации подвергнуть дальнейшей деструкции, действуя другими специфическими ферментами. [c.299]

Как видно из материала предыдущего раздела, задача установления первичной структуры нуклеиновых кислот является весьма сложной и разрешена пока лишь в некоторых простейших случаях. В связи с этим большое значение для исследований связи структуры и реакционной способности, а также биологической активности приобретают модельные олиго- и полинуклеотиды определенного строения. Некоторые полинуклеотиды такого типа (см. стр. 64) получены из природных объектов, однако систематическое использование модельных полинуклеотидов для решения физико-химических и биологических проблем стало возможным только после разработки методов препаративного получения подобных соединений с помощью химического или ферментативного синтеза. Химические методы синтеза имеют значение для получения олигонуклеотидных соединений для получения же полинуклеотидов применяются ферментативные и химико-ферментативные методы. [c.83]

Для определения конфигурации гликозидных связей в полисахаридах применяются химические, физические и ферментативные методы. [c.87]

Начальная скорость ферментативной реакции будет прямо пропорциональна концентрации присутствующего фермента. Любое наблюдаемое отклонение от линейной зависимости вовсе не означает изменения того очевидного принципа, что две молекулы фермента вызовут превращение в результате реакции в два раза большего (по сравнению с одной молекулой) количества вещества. Отсутствие линейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента свидетельствует о влиянии какого-то фактора, усложняющего ход реакции. Такими факторами — если мы не имеем дело со слишком быстро протекающей реакцией, в связи с чем данный метод оказывается непригодным для изучения ее кинетики, — могут быть присутствие в реакционной среде ингибитора или феномен подавления реакции ее продуктом. Обычно такое кажущееся отклонение обусловлено тем, что с помощью данного метода определения активности фермента мы на самом деле измеряем не истинную начальную скорость реакции, а лишь скорость на ранних этапах реакции. Таким образом, обнаружение нелинейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента должно прежде всего заставить исследователя критически проанализировать детали используемого метода, прежде чем пытаться строить предположения о новых принципах кинетики данной реакции. [c.104]

Микробиологический метод основан на способности миоинозита про-мотировать рост отдельных микроорганизмов и дрожжевых грибков. Известен специфический ферментативный путь определения миоинозита, основанный на его окислении в глюкуроновую кислоту с помощью ферментной системы почек. Ферментативные и микробиологические методы являются достаточно точными и специфичными, но, к сожалению, связаны с такими трудоемкими процессами, как очистка фермента, выращивание микроорганизмов и т. д. [c.217]

Кинетическое описание ферментативных реакций в нестационарном режиме связано с определенными математическими трудностями. Например, для анализа реакции, протекающей по схеме Михаэлиса — Ментен (схема 5.1), необходимо решить систему дифференциальных и алгебраических уравнений (5.2)—(5.5). Формально-кинетический анализ ферментативных реакций развивается как по пути использования численных методов интегрирования систем дифференциальных уравнений, так и по пути использования аналитических методов. Аналитическое решение имеет определенные преимущества. Поэтому важно указать, что аналитическое решение системы дифференциальных и алгебраических уравнений может быть существенно упрощено, если при использовании определенных условий систему можно трансформировать в линейную систему уравнений. Развитие методов нестационарной кинетики ферментативных реакций идет именно по этому пути. [c.175]

Все большее значение приобретают методы контролируемого ферментативного синтеза П. Оии основаны на способности протеолитич. ферментов в определенных условиях (подбор р-рнтеля, pH н др.) катализировать синтез пептидной связи с большей скоростью, чем ее гидролиз (осн. ф-ция этих ферментов). [c.471]

Конфигурацию гликозидных связей дисахаридов можно установить расчетом удельного вращения по правилу Кляйна [191]. Для определения конфигурации гликозидных связей в средних и высших олигосахаридах проводят их ступенчатое расщепление, а затем определяют конфигурацию гликозидных связей в отдельных звеньях, содержащих одну-две гликозидные связи. На основании полученных результатов вычисляют удельное вращение всего олигосахарида [99]. Определение конфигурации гликозидных связей может быть осуществлено также исследованием продуктов ферментативного гидролиза. Отношение данной гликозидной связи к ферменту с известной субстратной специфичностью позволяет сделать заключение о конфигурации этой связи. Сложность определения конфигурации связей этим методом состоит в трудности получения [c.126]

В связи с этим необычайно важно понять, как работают ферменты. В этой главе мы попытаемся охарактеризовать ферментативный катализ с точки зрения химика-органика. Установление механизма действия определенного фермента сводится, таким образом, к проблеме определения механизма органической реакции и может, в принципе, исследоваться методами физической органической химии. Это предполагает знание структур субстратов и продуктов рассматриваемой реакции. Детальная структурная инфор- [c.449]

Как химические, так и ферментативные методы определения последовательности нуклеотидов поочередным отщеплением концевых мономеров полинуклеотидной цепи имеют свои ограничения при химическом методе это связано с неколичественным протеканием процесса и частичным расщеплением псевдоуридина под действием перйодата, при ферментативном — с отдельными разрывами фосфодиэфирных связей в середине полинуклеотидной цепи (за счет примесей других ферментов). Вследствие этого редко удается определить таким образом последовательности более 5—6 остатков нуклеотидов метод, однако, широко применяется для анализа олигонуклеотидов, образующихся при частичном расщеплении цепи РНК. [c.68]

Первичная структура целлюлозы установлена в 1930-х годах. При анализе этого полисахарида методом метилирования образуется более 90 % 2,3,6-три-0-метил-Л-глюкозы следовательно, молекулы целлюлозы в основном линейны. Поскольку при частичном гидролизе целлюлозы образуется целлобиоза (6), этот полисахарид содержит р-(1->4)-связи, р-Конфигурация внутримолекулярных гликозидных связей подтверждена ферментативным анализом. Определение длины цепи по содержанию концевых групп в случае в основном линейных молекул неточно и дает очень низкие значения (- 200 моносахаридных звеньев) из-за деструкции в ходе анализа. Длина молекулы целлюлозы, определенная физическими методами, составляет до 10 000 остатков D-глюкозы. Изучение кинетики гидролиза целлюлозы показало, что свыше 99 % связей в ее молекулах имеет один и тот же характер (р-1,4-связи) [94]. Существование в молекулах целлюлозы связей другого типа не доказано. [c.239]

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия иротеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин-аргинина и лизина, хпмотрипсин-триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах. [c.56]

Другой метод определения конфигурации гликозидных связей — ферментативный гидролйз (см. также стр. 208) —будет рассматриваться в следующем разделе. [c.446]

Ферментативный гидролиз. Наличие а- или Р-связей в олигосаха-ридах, как и в гликозидах, можно обнаружить при помощи специфических а- и р-гликозидаз. Так, содержащаяся в эмульсине горьких миндалей Р-гликозидаза расщепляет Р-гликозидные связи, а находящаяся в дрожжах а-гликозидаза — а-гликозидные связи. Ферментативный гидролиз значительно отличается от кислотного он протекает при низкой температуре (20, 30, 40°) легко расщепляющиеся кислотой фуранозидные связи не гидролизуются многими гликозидазами, за исключением специфичных к этим связям (как, например, инвертаза). Известные трудности применения ферментативного гидролиза связаны с тем, что в природных источниках часто содержатся одновременно как а-, так и Р-гликозидазы и необходима тщательная очистка ферментных препаратов. Приходится также считаться и с субстратной специфичностью иногда а-гликозидаза, легко расщепляющая один олигосахарид, не действует или медленно действует на другой, также содержащей а-гликозидные связи, но имеющий другое строение. При всех этих трудностях ферментативный гидролиз относится к надежным методам определения конфигурации гликозидных связей. [c.22]

Химическая характеристика высокомолекулярных соединений путем исследования продуктов деструкции основывается на особенностях строения полимеров. В некоторых случаях продукты распада определенного строения получаются уже при сухой перегонке, для многих полимеров деструкция протекает вплоть до образования мономеров. При облучении ультрафиолетовыми лучами и при размоле в шаровой мельнице также происходит деструкция полимеров, но большей частью только до низкомолекулярных полимеров (например, при размоле полистирола в шаровой мельнице происходит деструкция до степени полимеризации около 100). Направленная деструкция, сопровождающаяся разрывом определенных связей в макромолекуле, позволяет сделать конкретные выводы о строении полимера. Такая реакция имеет место при расщеплении озонидов каучука (см. стр. 81), а также при гидролитическом расщеплении полисахаридов (см. стр. 86, 87 и 91) и идентификации осколков макромолекул известными методами, используемыми для низкомолекулярных соединений. Исследования продуктов распада белков и нуклеиновых кислот также дали возможность сделать предварительные выводы о их строении и о строении структурных единиц (об анализе аминокислот см. стр. 97). О специфических методах ферментативного расщепления было уже упомянуто выше (см. стр. 92). Для установления строения поливинилового спирта, полученного из поливинилацетата, наряду с отсутствием янтарной кислоты в продуктах разложения (как показали Штаудингер и Штарк, см. стр. 107) решающим явился тот факт, что этот полимер не деструктируется или очень незначительно деструктируется такими реагентами, как йодная кислота, расщепляющая 1,2-гликоли (Мар-вел и Деноон). [c.182]

В 1935 г. в статье [196], посвященной теоретическому рассмотрению метода, предложенного в 1931 г., был введен целый ряд определений и обозначений, прпменявшихся в предыдущих разделах настоящей статьи. Дальнейшая разработка метода в связи с его применением к каталитическим (ферментативным) реакциям была сделана в 1949 г. [76]. В цитированной статье были впервые описаны матрица распределения и ориентированные схемы. В ней также рассмотрен вопрос о времени, требуемом для установления стационарного состояния . [c.178]

В заключение следует отметить, что все способы введения метки в нуклеиновые кислоты, кроме медленного водородного обмена, связаны с определенными химическими модификациями этих биополимеров. Учитывая строго детерминированную химическим составом матричную функцию большинства НК, такие модификации,должны, как правило, приводить к нарушениям этой функции (в отличие от белков, где даже у ферментов есть балластные участки полипептидной цепи). В связи с этим для введения метки в НК in vitro в последние годы повсеместное распространение приобрели ферментативные методы, позволяю-ш,ие включать из нуклеозидтрифосфатов и нуклеозиддифос-фатов с очень высокой УА. [c.254]

Помимо химических методов определения КНг-концевых остатков применяют также ферментативный метод. Используемый при этом фермент лейцинами-нопептидаза функционирует при наличии у пептида свободной концевой а-ами-ногруппы. Следовательно, от пептида, имеющего последовательность NHz—A-B- -D..., где А, В, С, D — различные остатки, под действием этой ами-нопептидазы будут последовательно отщепляться свободные аминокислоты. В любой момент времени количество отщепленной аминокислоты А больше, чем В, а количество В больше, чем С, и т. д. Таким образом, по скорости отщепления аминокислот можно постулировать последовательность ЛВС. Лейцинамино-пептидаза наиболее быстро отщепляет концевой остаток лейцина, однако она действует также и на все другие остатки, имеющиеся в белках, и не расщеп ляет лишь связь X—Pro (табл. 6.3). [c.175]

В качестве моделей ферментов, как правило, используют синтетические органические молекулы, обладающие характерными особенностями ферментативных систем. Они меньше ферментов по размеру и проще по структуре. Следовательно, моделирование ферментов — это попытка воспроизвести на гораздо более простом уровне некий ключевой параметр ферментативной функции. Выявление определенного фактора, ответственного за каталитическую активность фермента в биологической системе, является трудоемкой задачей, требующей ясного представления о роли каждого компонента в катализе. Но, располагая подходящими моделями, мы можем оценить относительную важность каждого каталитического параметра в отсутствие других, не рассматриваемых в данный момент. Главное преимущество использования искусственных структур для моделирования ферментативных реакций состоит в том, что вещества можно создавать именно для изучения определенного конкретного свойства. Структура модели в дальнейшем может быть усовершенствована путем сочетания таких особенностей, которые дают наибольший вклад в катализ, и создания таких моделей, которые по своей эффективности действительно приближаются к ферментам. Таким образом, с помощью методов синтетической химии становится возможным создание миниатюрного фермента , который лишен макромоле-кулярного пептидного остова, но содержит активные химические группы, правильно ориентированные в соответствии с геометрией активного центра фермента. Этот подход называют биомимети-ческим химическим подходом к изучению биологических систем . Биомиметическая химия — это та область химии, где делается попытка имитировать такие характерные для катализируемых ферментами реакций особенности, как огромная скорость и селективность [350, 351]. Хочется надеяться, что такой подход в конце концов позволит установить связь между сложными структурами биоорганических молекул и их функциями в живом [c.263]

Поставленные задачи решаются на основе современных методов исследования ферментов. Практическая направленность занятий связана с освоением различных методов регистрации скоростей ферментативных реакций, включающих использование сопряженных ферментных систем и метода радиоактивного анализа. С целью определения активности мембранных ферментов осваиваются техника получения различных субклеточных структур и приемы работы с различными типами детергентов. Проблемы структурного анализа ферментов решаются с привлечением методов избирательной химической модификации белков, флуоресцентных методов, а также методов ковалентной и адсорбционной иммобилизации на различных носителях, включая искусственные фосфолипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс- [c.329]

Методы выделения, очистки и аналитические характеристики пептидов описаны подробно в разд. 3.3. Изучение связи между строением и биологической функцией пептидов ведет к познаванию молекулярного механизма их действия. При этом главное внимание обращается на выяснение активного центра и определение аминокислотной последовательности, которая ответственна за рецепторное связывание, транспорт и иммунологическое поведение. Большой практический интерес имеет также модификация природных пептидов для пролонгирования их действия и расширения практического применения. Такого рода исследования можно проводить только тогда, когда соответствующий природный пептид имеется в достаточном количестве. Необходимые для изучения пептиды можно получать путем частичного ферментативного расщепления экзопептидазами или эндопептидазами или же с помощью специфических химических методов расщепления (бромцианом или Ы-бромсукцинимидом) можно также использовать замещение, элиминирование или превращение функциональных групп соответствующих пептидов. Возможности модификации природных пептидов ограничены тем, что часто исследователь располагает лишь нанограммо-выми количествами этих веществ. [c.90]

Установление строения. Для установления строения гликозидов, содержащих один моносахаридный остаток, необходимо установить природу моносахарида, строение агликона, размер окисного цикла моносахаридного остатка и конфигурацию гликозидной связи. Для решения первой задачи проводят гидролиз гликозида, после чего идентифицируют образовавшийся моносахарид (см. гл. 14) и производят установление строения или идентификацию агликона методами, принятыми в соответствующих разделах органической химии. Для полифункциональных агликонов задача осложняется тем, что при этом возникает необходимость выяснения места присоединения углеводного остатка к агликону. Кроме того, некоторые природные агликоны (например, агликоны сердечных гликозидов) лабильны в кислой среде, что затрудняет получение неизмененного агликона при гидролизе. В таких случаях прибегают к ферментативному гидролизу (см. стр. 208) или используют некоторые специальные приемы (см., например, " ). Многие природные гликозиды содержат несколько моносахаридных остатков, соединенных друг с другом О-гликозидными связями. Установление строения таких соединений включает помимо решения перечисленных задач установление строения олигосахаридной цепи (или цепей) методами, применяемыми в химии олигосахаридов (см. гл. 16). Для определения размера окисного цикла моносахаридного остатка применяют два метода метилирование и перио-датное окисление. Первый метод заключается в получении метиловых эфиров гликозидов и их последующем гидролизе метилированию подвергаются все спиртовые гидроксилы моносахаридного остатка, за исключением того, который принимал участие в образовании окисного цикла исходного гликозида. Поэтому установление положения метоксильных групп в полученном при гидролизе метилированном моносахариде позволяет установить, который из спиртовых гидроксилов участвовал в образовании цикла. [c.206]

Смотреть страницы где упоминается термин Ферментативные методы определения связей: [c.250] [c.228] [c.401] [c.41] [c.164] [c.17] [c.305] [c.403] [c.403] [c.490] [c.180] [c.207] [c.46] [c.236] [c.100] [c.20] [c.40] [c.739] [c.45] [c.561] [c.138] [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология