Денатурация гуанидином

При высокой концентрации мочевины или гидрохлорида гуанидина в водном растворе происходит полная денатурация, которая в ряде случаев обратима после удаления денатурирующего вещества с помощью диализа. Отмеченные денатурирующие агенты находят широкое применение, поскольку можно достичь их высоких концентраций в водных растворах. Неупорядоченность вызывают также некоторые соли [23] и (в ограниченной степени) детергенты, например додецилсульфат [24]. Более широкие обобщения в этой области вряд ли возможны, поскольку для ряда аминокислот с функциональными группами в боковых радикалах наблюдались неожиданности, например, пoли(l-бeнзил- -ги тидин) в растворах, содержащих небольшие количества простых минеральных кислот, принимает неупорядоченную конформацию, тогда как в присутствии стехиометрического количества хлорной кислоты он существует в виде а-спирали. Кроме того, сообщалось [26], что присутствие додецилсульфата увеличивает упорядоченность фермента эластазы, начиная с довольно низкого уровня удаление детергента диализом приводит к глобулярному белку в предпочтительной р-форме. [c.433]

В некоторых случаях денатурацию вызывает весьма незначительное изменение pH среды. Одни белки стабильны при кислых значениях pH (например, пепсин), другие — при щелочных (щелочные протеиназы), третьи — при нейтральных. Часто для денатурации белков используют 8М раствор мочевины или 6М раствор гидрохлорида гуанидина. [c.104]

Необратимое свертывание белка яиц при нагревании — явление хорошо известное. Подобное изменение в состоянии указанного белка может быть вызвано и действием ряда других физических и химических агентов сильным встряхиванием, облучением ультрафиолетовыми лучами, действием ультразвуковых волн, кислот, щелочей, органических растворителей, солей тяжелых металлов, мочевины, гуанидина, салицилатов и многих других веществ. При всех этих воздействиях белок теряет свою первоначальную растворимость и в большинстве случаев становится нерастворимым при изоэлектрической точке. В отличие от других белков коллаген при нагревании в воде растворяется. Измененные под влиянием всех указанных воздействий нативные белки получили название денатурированных белков. часто сопровождается потерей биологической активности белков. Так, например, ферменты теряют свою каталитическую активность, гормоны — физиологическую функцию, антитела — способность соединяться с антигеном. Эти изменения не всегда протекают параллельно изменениям физико-химических свойств белков. Денатурация, очевидно, представляет собой комплексное явление. Вряд ли можно думать, что действие столь различных соединений, как мочевина и серная кислота, а также влияние нагревания обусловливают одно и то же изменение белков. Нельзя поэтому просто говорить о денатурации белков, например яичного альбумина необходимо всегда указывать, какой именно агент вызвал денатурацию. [c.147]

Денатурирующими агентами могут быть различные химические факторы кислоты и щелочи, изменяющие реакцию среды белковых растворов, выходящую за пределы значения pH от 3 до 10, т. е. лежащего вне зоны устойчивости белковых молекул разные легко гидратирующиеся соли, которые могут не только высаливать белки, по и денатурировать их в этом отношении остается справедливым лиотропный ряд для анионов Гофмейстера, в котором роданид и близлежащие к нему анионы вызывают денатурацию, в противоположность сульфатному концу ряда органические растворители, например ацетон, этиловый и метиловый спирты и др., снимающие водную оболочку у белков соответствующие окислители, производящие разрыв дисульфидных мостиков в белковой молекуле гуанидин и карбамид (мочевина), изменяющие количество водородных связей и, следовательно, конфигурацию белка (как бы производят плавление его комплексной спиральной структуры) и др. [c.209]

Физически денатурация может быть вызвана механическими (сильное перемешивание, встряхивание) нли физическими воздействиями (нагревание. ультрафиолетовое, рентгеновское и радиоактивное облучение, обработка ультразвуком и абсорбция иа границе раздела). Химическая денатурация достигается прежде всего с помощью соединений, разрывающих" водородные связи (6 — 8 М раствор мочевины, 4 М раствор гидрохлорида гуанидина), обработкой кислотами и щелочами (3 > pH > 9), а также воздействием поверхностно-активных веществ, например, 1%-ным раствором додецилсульфата иатрия. Чувствительность отдельных белков к денатурирующим средствам различна. [c.359]

Этот метод был использован также для исследования нативного и денатурированного додецилсульфатом натрия гемоглобина [117], а также для изучения реакционной способности сульфгидрила в сывороточном альбумине до и после денатурации солянокислым гуанидином [135] и после окисления сульфгидрильных групп ферри-цианидом [134]. Если оказывается, что прямое титрование денатурированных белков дает заниженные результаты, то к альбумину сначала добавляют избыток титрующего вещества. По окончании периода денатурации измеряют ток после добавления ряда последовательных порций реагента. Прямую линию зависимости тока от общего количества добавленного реагента продолжают до линии, соответствующей нулевому току, точку пересечения с которой принимают за конечную точку титрования. [c.393]

Денатурация белков может быть произведена, кроме нагревания (и других форм энергии, как, например, ультрафиолетового излучения или высоких давлений), некоторыми химическими веществами. Различают три категории подобных денатурирующих агентов вещества, вызывающие ионизацию (кислоты, основания), вещества, денатурирующие белки в их изоэлектрической точке (мочевина, гуанидин, салицилаты, тиоцианаты и различные детергенты, причем последние действуют в небольших концентрациях) и некоторые органические растворители (снирт, ацетон). [c.439]

На рис. 1 показано два типа остатков тирозина в трипсине [6]. Кривые бив, снятые сразу и спустя 3 ч после добавления щелочи, свидетельствуют о мгновенной ионизации при pH 10,0 (т = 1) 6 остатков тирозина из 10 и медленной ионизации оставшихся 4 остатков при pH выше 11,4. Кривая д, полученная путем вычитания кривых в п г, дает для этих медленно ионизующих остатков значение рК = 10,8 (т = 2). После денатурации трипсина 3,2 М гуанидином все 10 остатков характеризуются рК [c.347]

Особенный интерес у исследователей в течение длительного времени вызывало изучение действия на ДНК денатурирующих агентов (мочевины, гуанидина, салицилата натрия и др.), разрушающих водородные связи между комплементарными основаниями, поскольку водородным связям ранее приписывалось решающее значение в стабилизации структуры ДНК. Однако эксперименты Малера по термической денатурации обычной ДНК (Н-ДНК) и дейтерированной (В-ДНК), которые характеризуются различной прочностью водородных связей, показали, что процесс денатурации для обоих видов ДНК идентичен. Кроме того, оказалось, что некоторые вещества, не влияющие на водородные связи, вызывают денатурацию ДНК. Это позволило прийти к заключению, что в поддержании вторичной структуры ДНК участвуют не только водородные связи. [c.424]

С печенью, в ряде случаев удоОно предварительно отделить цитоплазму от ядер и использовать только цитоплазму. Это можно осуществить путем экстрагирования гомогенизированной ткани 0,14 М раствором Na l, приводящего к отделению цитоплазматических рибонуклеопротендов от содержащего ДНК ядерного материала. Рибонуклеонротеид осаждают затем из экстракта при pH 4,5 и вновь растворяют его в растворе бикарбоната натрия. Продолжительное встряхивание с несколькими последовательно сменяемыми порциями хлороформа, содержащего небольшое количество октилового спирта, приводит к удалению белка нуклеиновую кислоту, остающуюся в водном растворе, осаждают в виде натриевой соли при добавлении спирта. Можно поступить и иначе вызвать спиртом денатурацию рибонуклеопротеида и экстрагировать нуклеиновую кислоту 10%-ным раствором хлористого натрия, из которого затем осадить ее добавлением двух объемов спирта [1—4]. Примерно аналогичный метод существует и для выделения РНК из животных тканей [5]. В этом случае нуклеиновую кислоту осаждают из раствора солянокислого гуанидина, в котором белок нерастворим для удаления белка можно использовать также додецилсульфат натрия [6, 7]. [c.40]

Денатурация может быть вызвана добавлением кислоты (в количестве более 1 вкв), что приводит к разрыву водородных связей и расталкиванию положительно заряженных оснований в гидрофобном ядре . Уменьшение ионной силы раствора до величин менее 10 М или добавление щелочных соединений, мочевины, солей гуанидиния, неводных растворителей или же нагревание также вызывают денатурацию. Факторы, вызывающие денатурацию, взаимосвязаны например, при возрастании концентрации мочевины тепловая денатурация происходит при более низких температурах. [c.320]

Наряду с сульфгидрильными и дисульфидными группами при денатурации белков наблюдается увеличение реактивности и других химически активных групп. Так, в нативном яичном альбумине с динитрофторбензолом реагируют 3 е-аминогруппы лизина, тогда как при денатурации число таких групп увеличивается до 9. В случае -лактоглобулина было найдено, что все 31 е-аминогруппы лизина ацетилируются кетеном, но лишь 19 реагируют с динитрофторбензолом. При денатурации нагреванием, спиртом и солянокислым гуанидином все е-аминогруппы становятся реактивными. Тот факт, что все е-аминогруппы могут ацетилироваться и что только некоторые из них реагируют с динитрофторбензолом, указывает на экранирование части этих групп складками полипептидных цепей. [c.189]

Ароматические эффекты Коттона исчезают при кислотной денатурации и в растворах гидрохлорида гуанидина [72, 76, 77]. По данным работы [73], после удаления денатурированного агента (или после возвращения к нейтральному pH) наблюдавшиеся ранее хорошо выраженные полосы эллиптичности в ближней ультрафиолетовой области полностью уже не восстанавливаются. Однако в одном из последующих сообщений говорится о возможности восстановления исходной конформации при правильном выборе условий и при использовании гидрохлорида гуанидина [77]. Причины возникновения этих полос эллиптичности подробно обсуждаются в работах [72—76]. [c.574]

НИЯ этого факта всеобщее мнение довольно резко качнулось в сторону той точки зрения, в соответствии с которой образование таких водородных связей не может служить движущей силой поддержания белковой структуры в водном растворе или денатурации белков мочевиной и гуанидином. Это мнение получило дальнейшее подтверждение, когда было обнаружено, что мочевина и гуанидин увеличивают растворимость (т. е. понижают коэф- [c.262]

Эксперименты по повторному свертыванию выявляют быстро и медленно свертывающиеся цепи. Подразделение несвернутых цепей на два класса, быстро и медленно свертывающихся, было-установлено при исследовании рибонуклеазы [440, 447, 448]. В опытах по повторному свертыванию рибонуклеазы, денатурированной без нарушения системы дисульфидных связей, было обнаружено, что 20% цепей повторно свертываются в пределах 0,1 с (быстро свертывающиеся цепи.) Процентное содержание таь их цепей не зависит от способа денатурации (гуанидин гидрохлорид [449], нагревание-[450] и т. д.). Остальные 80% цепей (медленно свертывающихся) превращаются за время от 10 до 100 с в быстро свертывающиеся, которые затем укладываются моментально. Имеется сообщение об-аналогичном, хотя и менее количественном наблюдении в отношении ингибитора трипсина поджелудочной железы быка (BPTI), в котором 15% цепей свертывались значительно медленнее, чем остальные [451]. Это явление пока еще не объяснено. Согласно одной из гипотез [449, 452], в быстро свертывающихся цепях все пептидные-связи представлены правильными цис-транс-тоы 1 аш, тогда как медленно свертывающиеся цепи содержат неправильные изомеры . [c.184]

Наблюдается также увеличение реактивности некоторых химических групп в белке, которые до денатурации не обнаруживались или определялись в меньших количествах. К таким замаскированным группам могут быть отнесены фенольные группы тирозина, имидазольные кольца гистидина, сульфгидрильные группы цистеина и т. п. Может происходить также освобон<дение групп белковых цепочек так, например, в нативном р-лактоглобулине имеется 12 е-аминогрупп лизина, а после денатурации их обнаруживается 31 или, например, нативный яичный альбумин, предварительно обработанный гуанидином, дает более интенсивную окраску с раствором нитропруссида натрия в силу разрыва дисульфидных связей и увеличения количеств свободных 5Н-групп. [c.210]

Работы Тенфорда и его школы [2, 20] специально посвящены исследованию денатурации белков различными физическими методами. Денатурированный белок приобретает конформацию статистического клубка в таком растворителе, взаимодействие которого со звеньями полимерной цепи сильнее, чем внутримолекулярные взаимодействия. Найти такой растворитель непросто, так как одна и та же молекула белка содержит и гидрофильные, и гидрофобные группы. Тенфорд с сотрудниками показал, что среди различных денатурирующих растворителей концентрированные водные растворы гуанидин-хлорида обычно приводят к максимальным изменениям физических и химических свойств белка для некоторых белков в той же степени эффективна также мочевина. Для. разрушения дисульфндных связей и предотвращения их образования использовали умеренные концен- [c.144]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

С повышением темпердтуры падает вязкость подвижной фазы, а следовательно, и гидродинамическое сопротивление столбика сорбента соответственно сокращается время достижения равновесия. Теоретически верхним пределом температуры в колонке служит та величина, при которой наступает тепловая денатурация белков. На практике приходится работать при более низкой температуре, в особенности при наличии в исследуемой смеси протеаз и других гидролаз. В ряде случаев, в частности при обработке тканевых экстрактов, рекомендуется работать при температуре близкой или ниже О °С и в буфере, содержащем несколько процентов изопропанола. В этом нет необходимости, если рн среды не совпадает с оптимальной областью действия гидролаз, или в среде присутствуют ингибиторы протеаз, или выделение ведут в присутствие денатурирующих агентов, таких, как солянокислый гуанидин или мочевина, наконец, когда исследуемый белок отделяют с помощью специфического сорбента (например, при аффинной хроматографии) [1]. [c.422]

Денатурацию вызывают различные агенты и факторы тепло, ультрафиолетовое излучение, органические растворители, мочевина, солянокислый гуанидин, бромистый литий, детергенты, кислоты, щелочи и т. д. Состояния, к которым приводит вызванная этими агентами денатурация, могут быть весьма различными. Так, например, полная денатурация нагреванием часто оказывается необратимой, а денатурация под действием лгочевины обычно обратима — при удалении мочевины нативная форма белка восстанавливается. Совершенно очевидно, что состояния, в которых оказывается молекула белка при обратимой и необратимой денатурации, должны существенно различаться. [c.115]

К способам денатурации преимущественно химического типа относятся действия а) органических растворителей (ацетона, метилового, этилового и иных спиртов, пиридина, диоксана, эфира и др.) б) амидов, как например, мочевины, солей гуанидина, формамида, уретана и иных подобных веществ в) ионных детергентов, в частности анионных (алкил-сульфатов и т. п.) г) сали-цилата натрия и иных органических анионов, например трихлоруксусной кислоты д) минеральных солей, таких как СаС 2, Mg l2, K NS, которые при большой концентрации в растворе могут денатурировать белки е) солей тяжелых металлов. Кроме того, в качестве денатурирующих агентов обычно рассматривают протеазы, которые, по-видимому, могут вызывать денатурацию молекулы белка перед ее расщеплением. [c.160]

Предохранение от постденатурационной агрегации, кажущуюся, или внешнюю , стабилизацию, когда растворы денатурированных белков сохраняются прозрачными и как бы неизменными, можно вызвать действием а) анионов жирных кислот и детергентов (при больших их концентрациях) б) формальдегида в) сульфгидрильных реагентов, йодуксусной кислоты г) солей тимонуклеиновой кислоты. Кроме того, предохранение от последенатурационных явлений (агрегации, коагуляции, но, естественно, не денатурации ) можно получить при действии ряда денатурирующих веществ мочевины, солей гуанидина, ацетилтриптофана, фенилацетата, уретана, солей миндальной кислоты или щелочи. [c.163]

Доказательства существования водородных связей в белках могут быть получены при изучении скорости изотопного обмена имидного водорода с водой, содержащей дейтерий или тритий. Этот прием был использован в лабораториях Линдерштрём-Ланга и Бреслера. Известно, что в низкомолекулярных пептидах этот атом водорода обменивается с водой крайне быстро. В высокомолекулярных полипептидах с большим числом водородных связей обмен имидного водорода сильно замедлен. Например, у по-лиаланина с 28 пептидными связями только 5—6 имидных водо-родов обмениваются быстро. Это говорит о том, что почти все пептидные группы соединены водородными связями, а сама цепь свернута в упорядоченную спираль. У инсулина из 49 имидных водородов 30 обмениваются медленно, т. е. степень спирализации составляет примерно 60%. Другим подтверждением существования водородных связей в белках является их деструкция и денатурация под влиянием агентов, обладающих значительной способностью к образованию водородных связей с амидной группой (концентрированные растворы мочевины, гуанидина, трифтор-уксусная и муравьиная кислоты и др.). [c.91]

Денатурация может быть вызвана при помощи ряда органических веществ и растворителей. К таким органическим веществам относятся прежде всего мочевина, соли гуанидина, уретан и аналогичные амиды. Их действие связано с наличием амидной группировки, благодаря чему они способны конкурировать с пептидными группировками белка в отношении образования водородных связей, переключая их на себя. Это приводит к распаду некоторых белков на отдельные субъединицы или к переходу полипептидных цепей из спирализованной формы в статистический клубок. Для максимального проявления действия амиды должны присутствовать в больших концентрациях — например, для мочевины она может достигать 8 М. [c.185]

Вместе с тем число определяемых групп зависит и от природы денатурирующего агента. Так, при тепловой денатурации яичного альбумина в коагулированном белке удается определить только половину SH-rpynn, тогда как мочевина и солянокислый гуанидин освобождают соответственно 80 и 100% тиоловых групп. Следовательно, для оценки количества скрытых SH-rpynn необходимо правильно подобрать метод определения и тип денатурирующего агента. Тем не менее в результате этих многочисленных исследований удалось не только доказать, что в денатурированном белке обнаруживается больше сульфгидрильных групп по сравнению с нативным, но и оценить количество замаскированных групп для ряда белков. Аналогичные данные были получены и для дисульфидных групп белков. [c.189]

Это значит, что такие денатурирующие агенты взаимодействуют в растворе с тетрапептидом, моделирующим амидные группы полипептидной цепи, понижая его энергию. Следовательно, можно ожидать, что они будут способствовать денатурации белка, аналогичным образом взаимодействуя с его амидными группами. Этот эффект уменьшается при замощении атомов водорода денатурирующего агента алкильными группами, и тетралкилмочевина и гидрохлорид тетраметилгуанидина вызывают уже уменьшение растворимости ЭЭАТГ. Так как алкилирование приводит к возрастанию солюбилизирующей способности мочевины и гидрохлорида гуанидина по отношению к неполярным молекулам [33], то их взаимодействие с пептидом не может быть по своей природе гидрофобным. Денатурация бычьего сывороточного альбумина денатурирующими агентами этого типа также требует наличия незамещенных атомов водорода [32], Проще всего это можно объяснить тем, что денатурирующий агент взаимодействует с пептидными группами с образованиел водородных связей. [c.262]

Все 4 структуры могут быть изучены разнообразными физическими и химическими методами. Нарушения нативной вторичной и третичной структуры белков, вызываемые весьма разнообраз-ньвп факторами, как-то повышением температуры, резкими сдвигами pH, добавлением некоторых агентов, разрывающих водородные связи между СО—NH-группами (мочевина, соли гуанидина, трифторуксусная кислота, дпхлоруксусная кислота), называются общим термином — денатурацией белков. [c.36]

Таким образом, отсутствуют надежные доказательства, подтверждающие широко принимавшуюся до сих пор гипотезу о том, что водородные связи между амидными группами обеспечивают энергию стабилизации, необходимую для поддержания нативной структуры белков, и о том, что денатурирующие агенты типа мочевины и гидрохлорида гуанидина вызывают денатурацию, конкурируя с карбонильным кислородом и амидным водородом за образование водородной связи внутри пептидной цепи [27]. После осозна- [c.261]

В гл. 6 было отмечено, что денатурация белка мочевиной и гидрохлоридом гуанидина заключается в энергетически благоприятном взаимодействии этих соединений с амидными и пептидными группами. Энергия этого взаимодействия понижается при замещении атомов водорода в молекулах денатурирующих агентов алкильными группами. Однако мочевина и гидрохлорид гуанидина также способствуют денатурации белков по гидрофобному механизму, облегчая контакт неполярных групп с растворителем [31]. Это доказывается их солюбилизирующим действием на углеводороды и на гидрофобные боковые цепи аминокислот, а также дестабилизирующим влиянием мочевины на ионные и неионные мицеллы [32, 33]. Упомянутые два разных механизма действия обеспечивают высокую эффективность этих соединений как денатурирующих агентов на различные типы макромолекул. Их можно различить при исследовании влияния алкилирования на денатурирующую способность мочевин и гуанидинов, так как алкилирование увеличивает эффективность этих соединений при солюбилизации неполярных молекул и оснований нуклеиновых кислот [8, 34, 35]. [c.310]

Изменение устойчивости нативной конформации с изменением природы растворителя позволяет объяснить относительное значение различных факторов, определяющих третичную структуру белков. Стремление неполярных сорастворителей к денатурации водных растворов белков является сложным процессом. Когезия неполярных остатков в водной среде, с одной стороны, стабилизует спиральную конформацию, а с другой стороны, может быть основной причиной образования многих изгибов, посредством которых спиральные участки полипептидной цепи складываются в компактную структуру глобулярных белков в нативном состоянии. Уменьшение полярности среды может поэтому привести к уменьшению содержания спиральных конформаций [381, 390, 391] до того, как они разрушатся окончательно. Действие мочевины или солей гуанидина лишь частично объясняется разрушением гидрофобных связей. Было показано, что водный раствор мочевины является лучшим растворителем для неполярных веществ, чем сама вода [392]. Однако было также обнаружено, что водный раствор мочевины или солянокислого гуанидина оказывает специфическое сольватирующее действие па скелет полипептидной цепи, которое имеет совершенно другие характеристики, чем солюбилизация углеводородных остатков [393]. Наконец, уменьшение устойчивости нативной формы глобулярных белков с увеличением температуры доказывает, что разрушение третичной структуры является эндотермическим процессом, в то время как разрыв гидрофобных связей должен протекать экзотермически. Это приводит к выводу [394] о том, что знак измененля энтальпии определяет какой-то другой процесс,— возможно, разрыв водородных связей, сопровождающий разворачивание полипептидной цепи. [c.137]

Большинство белков содержит тиольные группы цистеиновых остатков. Такие группы, присоединенные к малым молекулам, легко окисляются под действием большого количества окислителей. Однако в нативных глобулярных белках такие тиольные группы часто настолько замаскированы , что их реакционная способность проявляется лишь при денатурации белка. Обширная литература, посвященная этому эффекту, была рассмотрена Барроном [1026]. Типичным примером таких исследований является исследование Гринштейна [1027], который обнаружил, что яичный альбумин не восстанавливает типичный тиольный реагент — краситель порфиридин, пока белок не будет денатурирован такими реагентами, как мочевина или солянокислый гуанидин. Число тиольных групп, доступных для реакции, увеличивается со временем воздействия денатурирующих агентов и достигает четко оиределенного предела, который зависит от концентрации этих реагентов. В миозине [1028] некоторые тиольные группы реакционноспособны даже в нативном белке, однако число реакционноспособных тиольных групп после денатурации возрастает на 150%. [c.346]