Белки исследование в ультрацентрифуге

Убеждение, что молекулы всех глобулярных белков являются в основном идентичными (которое в этой книге было впервые высказано, исходя из рассмотрения рентгеноструктурных данных в разделе 4), таким образом, исторически возникло тогда, когда при исследованиях белков в ультрацентрифуге были получены [c.433]

В 1922 г. он пришел к мысли использовать для нахождения функции распределения центрифугу. В следующем году совместно с Г. Ринде он сконструировал небольшую центрифугу, дающую ускорение, равное всего лишь 150 (я — ускорение свободного падения), которая была названа им ультрацентрифугой. Прибор этот, естественно, оказался недостаточным для исследования золей, растворов белков и высокомолекулярных соединений. В 1925 г. был построен прибор с ускорением [c.258]

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярной массы и размеров молекул белка выполняется с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. [c.510]

В 1935 г. в химии полимеров начали применяться физические методы измерения молекулярных весов применение этих методов к целлюлозе и ее производным рассмотрено в обзоре Кремера и Лансинга [12]. Ультрацентрифуга оказалась особенно ценной при исследовании белков, однако в то время этих приборов было очень мало. Для определения молекулярных весов было также предложено измерение осмотического давления, однако измерения по этому методу занимают много времени. [c.100]

Ультрацентрифуга, разработанная Сведбергом, развивает центробежную силу, превышающую приблизительно в 500 ООО раз силу земного притяжения. Центробежная сила пропорциональна радиусу вращения и квадрату скорости вращения. Если на белковый раствор воздействовать очень большой центробежной силой, то процесс седиментации белка будет протекать гораздо быстрее, чем процесс диффузии. Первоначально белковые молекулы равномерно распределены в растворителе, но под действием центробежной силы они удаляются от оси вращения и между водой и белковым раствором образуется довольно четкая граница. В области границы заметно изменяется показатель преломления, и это позволяет следить зг движением границы во время центрифугирования с помощью различных, специально сконструированных оптических систем. При исследовании однородных молекул наблюдается одна-единствен-ная граница. Если же присутствуют два белка и они достаточно различаются по размерам молекул, то образуются две границы. Скорость движения границы выражается формулой [c.15]

Быстрое развитие техники исследования макромолекул в сильных гравитационных нолях привело к существенному улучшению методов определения молекулярного веса полимеров. Первая ультрацентрифуга была построена в 1925 г. Сведбергом и его сотрудниками. Ультрацентрифуга состоит из следующих основных частей ротора, в котором находятся кюветы, содержащие исследуемый материал охлаждаемой вакуумной камеры, в которой вращается ротор скоростного электромотора оптической системы, позволяющей в процессе вращения ротора измерять концентрацию белка или другого вещества в каждой точке кюветы. На фиг. 15 показано сечение ультрацентрифуги с электрическим приводом. Скорость вращения ротора [c.64]

Исследование в ультрацентрифуге. Форма, ширина и скорость расширения пика белка при седиментации в ультрацентрифуге позволяют судить о чистоте белкового препарата. Примеси обнаруживаются по возникновению дополнительных пиков, появлению плеч на главном нике, по асимметрии главного пика или по увеличению ширины пиков (в сравнении с их шириной, соответствующей коэффициенту диффузии чистого белка). Такие исследования желательно проводить при различных значениях pH и ионной силы. [c.83]

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярных масс и размеров белков было выполнено с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью анализа отдельных компонентов (см. упражнение 20-23), измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных, очень больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. Сведения о форме молекул получают, измеряя скорости молекулярной релаксации после электрической поляризации, исследуя изменения в оптических свойствах (двойное лучепреломление), возникающие в струе жидкости, непосредственно с помощью электронной микроскопии и, что имеет, быть может, наиболее важное значение, исследуя интенсивность рассеяния света и рентгеновского излучения как функцию угла рассеяния. Применение всех этих методов часто встречает трудности вследствие высокой степени гидратации белков, а также в результате того, что многие белки вступают в обратимые реакции ассоциации, образуя димеры, три-меры и т. д. Молекулярные массы, молекулярные параметры и изоэлектрические точки ряда важных белков приведены в табл. 20-2. [c.125]

Растворы белков обладают многими свойствами, которые характерны для лиофильных коллоидных растворов. Молекулы белков не проходят через полупроницаемые мембраны, и это используется для их очистки от низкомолекулярных примесей при помощи диализа. Представляет большой интерес определение размеров, формы белковых молекул и молекулярных весов белков. Для этой цели используется целый ряд физико-химических методов. Так, белки в растворах седиментируют в ультрацентрифугах при ускорениях до 200 ООО g , величины констант седиментации колеблются от 1 Ю до 90—100 сек. Коэффициенты диффузии — в пределах от 0,1 10 до 10- 10 средний удельный объем — около 0,75 см г. Размеры и форму (асимметрию) частиц белка определяют, кроме того, методами светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, измерениями вязкости, коэффициента вращательной диффузии, но, по-видимому, наиболее точно — прямым наблюдением в электронном микроскопе в тех случаях, когда молекулы белка достаточно велики и когда удается преодолеть технические затруднения. Молекулярные веса, кроме названных выше способов, определяют методами осмометрии, гель-фильтрации, исследованием монослоев белков на поверхности жидкой фазы, светорассеяния и др. [c.30]

До недавнего времени наиболее надежным средством разделения белков с разными молекулярными весами являлось скоростное центрифугирование в ультрацентрифугах, применявшееся как для определения констант седиментации (осаждения) белка в аналитических исследованиях, так и для препаративного получения некоторых белков. [c.55]

При очень малых частицах, близких по величине к большим молекулам (например, белки), надо принимать ео внимание еще одну силу — силу диффузии, препятствующую оседанию частиц. Сведберг дал подсчеты и для этого случая. Начиная с 1930 г. Сведберг и его сотрудники с помощью ультрацентрифуги предприняли исследование молекулярных весов белков и целлюлозы и получили гораздо более достоверные величины, чем дали прежние физико-химические методы. В табл. 4 приведены некоторые из найденных величин [c.29]

Самым медленным компонентом является у-глобулин. Методами иммунохимии показано, что этот белок, или по крайней мере значительная часть его, является ответственным за иммунитет организма и состоит из смеси различных антител. Естественно, что у-глобулин не является индивидуальным белком. О его электрофоретической негомогенности уже говорилось негомогенность проявляется и при исследовании другими методами, например в ультрацентрифуге. С функцией у-глобулина связано, очевидно, малое содержание его в крови новорожденных, а также то обстоятельство, что его количество возрастает при многих инфекционных заболеваниях. Обновляется у-глобулин, как и следовало ожидать, исходя из его физиологической роли, значительно медленнее, чем альбумин, — в течение 30 дней у человека. [c.101]

Обычные методы не приложимы для определения молекулярного веса белков. Для этой цели наиболее подходящим оказался метод, предложенный Сведбергом и основанный на измерении скорости оседания частичек вещества в ультрацентрифугах (центрифугах, делающих от 40 ООО до 60 ООО оборотов в минуту). Исследования показали, что молекулярный вес белков колеблется в очень широких пределах, достигая 300 000 (эдестин из семян конопли) и выше. [c.338]

Ультрацентрифугирование. В ультрацентрифугах при ускорениях порядка 100 000—500000 g происходит довольно быстрое осаждение подавляющего большинства белков. Скорость осаждения зависит преимущественно от молекулярного веса белка. Теория ультрацентрифугирования белков и приложения этого метода для исследований размера и формы белковой молекулы будут рассмотрены в гл. VI. Здесь отметим только, что метод может быть использован и в препаративных целях. Теоретически эффективность такого разделения должна быть значительной. На практике, однако, возникают труднопреодолимые препятствия. Максимальная дистанция, которую проходят белки в кювете ультрацентрифуги, невелика, в результате чего удается обособить лишь крайние фракции. Нелегко предотвратить перемешивание участков жидкости в кювете при остановке центрифуги. Для этого прибегают, например, к разде- [c.21]

Аналитическая ультрацентрифуга широко используется при исследовании вновь выделенных белков и других макромолекул. Она служит также для проверки качества препаратов, полученных установившимися методами. В обоих случаях исследователь ставит перед собой такие вопросы [c.201]

Скорость седиментации суспензий под влиянием силы тяжести уже давно использовалась рядом исследователей для установления размеров частиц суспензий. Формула "Стокса, связывающая скорость падения сферической частицы с ее радиусом, давала возможность приблизительно определить размеры частицы. В 1923 г. Сведберг и Никольс применили центрифугу для увеличения действующей силы и для ускорения седиментации с целью измерения размеров частиц . Дальнейшее развитие техники ультрацентрифуги привело к тому, что в настоящее время этот прибор является наиболее мощным орудием физического исследования белков и других коллоидных молекул. [c.333]

Для исследования фильтрующихся вирусов были сконструированы и применены оригинальные препаративные ультрацентрифуги. Фильтрующиеся вирусы почти количественно отделяются от раствора и уже при относительна невысоких eKt poe ix (30 000 об/мин) оседают в виде прозрачного шарика на дне пробирки, в то время как менее растворимые белки еще остаются в находящейся над осадком жидкости. Если выделяемый вирус является единственным белком с крупными молекулами, то для получения чистого Препарата нужно только обеспечить надежное центрифугирование гари подходящей скорости [282—285]. Успешное применение этого метода, если пользоваться только им одним, основано на предположении о том, что в растворе нет других молекул таких же размеров. Справедливость этого предположения во многих случаях ставилась рядом исследователей под сомнение [286—288]. [c.67]

Ультрацентрифуга была применена при многочисленных исследованиях белков, растворов полистирола, метилцеллюлозы, целлюлозы и других веществ. [c.31]

Наконец, в последней главе обсуждается вопрос об исследованиях высокомолекулярных веществ с помощью ультрацентрифуги. Ультрацентрифугирование позволяет получить надежные данные о среднем молекулярном весе и о распределении молекул по молекулярным весам, а также о форме удлиненных молекул (отношение длины к поперечнику). Важность получения этих сведений не приходится доказывать, особенно ввиду того значения, которое приобрело исследование белков и синтетических высоко-полимеров за последние десятилетия. [c.8]

ЧТО господствовавшие представления были неправильны. В результате множества более поздних исследований было окончательно доказано, что растворы природных растворимых белков являются монодисперсными или слабо полидисперсными, т. е. содержат лишь несколько видов молекул вполне определенной массы и формы. Хотя первоначально эти выводы были сделаны на основании измерений седиментационного равновесия, они были затем подтверждены в результате исследований, проведенных при наивысшей разрешающей способности седиментационно-скоростной ультрацентрифуги. Рис. 140 показывает приведенные в статье Сведберга [68] снимки [c.538]

Исследования с помощью ультрацентрифуги могут в принципе дать наиболее подробные сведения о молекулярных свойствах синтетических и природных высокополимерных соединений, но практическое применение ультрацентрифуги ограничено вследствие трудности проведения опытов с чрезвычайно разбавленными растворами, а также из-за недостаточной разработанности теории поведения растворов цепных молекул в центробежном ноле и трудоемкости обработки эмпирических данных (стр. 471). Последние теоретические работы (стр. 481) указывают, однако, что методы ультрацентрифугирования, несомненно, займут в онределении молекулярных свойств высокополимерных соединений такое же место, какое они занимают сейчас в исследовании белков. [c.551]

Овомукоиды, полученные из яичных белков И различных видов птиц адсорбцией и элюированием с колонок, наполненных КМ- или ДЭАЭ-целлюлозой, приблизительно в тех же условиях, какие применялись для получения овомукоидов курицы (см. стр. 25), имели близкую величину общего азота (11—13%) и содержали очень мало триптофана (менее 1%) [12]. Однако по своей ингибиторной активности по отношению к трипсину и химотрипсину они очень резко различались, и на этой основе овомукоиды можно было разделить на следующие четыре класса овомукоиды курицы, фазана, индюка и утки. Физические и химические свойства (включая молекулярный вес) овомукоида утки очень сходны со свойствами овомукоида курицы. Исследование на ультрацентрифуге овомукоидов индюка и фазана показало, что молекулярный вес их также, по-видимому, близок к весу овомукоидов курицы и утки. Исследования, проведенные с учетом весовых взаимоотношений, привели к классификации различных видов овомукоида по количеству фермента, которое ингибируется соответственно одним молем овомукоида [c.38]

Процедура сукцинилирования (на примере каталазы [54]) следующая к 15—18 мг каталазы в 1 мл 67 мМ фосфатного буфера pH 7,6 добавляют 10 мг твердого сукцинового ангидрида через 10—30 мин добавляют еще 10 мг сукцинового ангидрида. При этом раствор непрерывно перемешивают, а pH поддерживают в интервале от 7,6 до 8 добавлением 0,5 н. NaOH. После двух часов инкубации при комнатной температуре раствор диализуют против фосфатного буфера. Аналогичное исследование белка в ультрацентрифуге показывает, что при достаточном количестве сукцинового ангидрида в растворе присутствует только компонент, соответствующий полипептидной цепи (рис. 12). При [c.418]

Разработаны химические методы определения величины полинептидных цепей белковой молекулы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной а-амино-грунной аминокислотного остатка, стоящего на конце нолипептидной цепи, с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу на составляющие его аминокислоты (в том числе и на конечную аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, лизоцим, белок, содержащийся в слезах и яичном белке и обладающий свойством уничтожать бактерии, имеет, как было установлено ири помощи ультрацентрифуги, молекулярный вес около 14 ООО и состоит примерно из 125 аминокислотных остатков. Применение описанного метода позволило показать, что имеется лишь одна свободная а-аминогруппа, и на этом основании был сделан вывод, что данная молекула состоит из одной нолипептидной цепи. Если эта полипептид-ная цепь была бы растянута, то ее длина составляла бы около 450 А. Однако, как установлено при помощи ультрацентрифуги, дифракцией рентгеновских лучей и другими методами исследования, молекула лизоцима по форме близка к шару с диаметром около 25 А. Отсюда следует, что нолипептидная цепь не может быть вытянутой, а должна быть скрученной, ибо только тогда молекула приобретет сферическую форму. [c.487]

Высокомолекулярная фракция была сконцентрирована в нативном состоянии с помощью сефадекса приблизительно в 30 раз, и при исследовании ее в ультрацентрифуге ФИВЕ на диаграмме седиментации был обнаружен один пик с константой седиментации ( 20,ж), равной 5,94 5. Таким образом, из секрета печеночных митохондрий выделено два усиливающих фактора, из которых один оказался адениннуклеотидом, а другой — белком. По-видимому, в первую очередь, когда гиалоплазма еще лишена коэнзимов гликолиза, действует аденнннуклеотид. Это действие дает гликолизу первый импульс. Затем, после насыщения ферментов коэнзимами, наступает действие белкового фактора это действие вызывает дальнейший подъем гликолиза. [c.115]

Впервые идея о применении значительной центробежной силы для осаждения и определения размеров коллоидных частиц была высказана и опробована на практике еще в 1913 г. Думан-ским. Однако потребовались долгие годы теоретических и практических изысканий, прежде чем Сведбергрм (1940 г.) были разработаны теоретические основы данного метода и создана первая ультрацентрифуга со скоростью вращения ротора до 65 ООО об1мин. К настоящему времени методы аналитического и препаративного ультрацентрифугирования получили широкое применение в исследованиях белков и нуклеиновых кислот и при изучении структурных элементов клетки. [c.142]

Более четверти века тому назад в самой первой статье замечательной серии — Успехи энзимологии — Булл назвал ультрацентрифугу наиболее важным из всех известных к тому времени инструментов, используемых для физических исследований белков . С тех пор появилось много новых ценных приборов, однако среди методов исследования биологических макромолекул уль трацентрифугированию по-прежнему принадлежит главная роль. Как хорошо известно сейчас почти каждому образованному человеку, даже если он и не ученый, рентгеноструктурные исследования ДНК, выполненные Уилкинсом, и их интерпретация Уотсоном и Криком в 1953 г. вывзали в биологии революцию. Огромный объем современных знаний об этих макромолекулах— носителях наследственности, а также о процессах биосинтеза белка в клетках получен в значительной мере благодаря многочисленным тонким исследованиям, проведенным с помощью ультрацентрифугирования. [c.7]

При помощи ультрацентрифуги возможно определение молекулярного веса и степени полидисперсности различных высокомолекулярных соединений. До сих пор при помощи ультрацентрифуги широко изучались протеины. При этом было найдено, что многие природные белки в основном являются полп-дисперсными, а величина частиц, выраженная в единицах молекулярного веса, составляет число, кратное 17 600. При исследовании. полистиролов было обнаружено, что молекулярные веса, найденные с помощью ульграцентрифуги, вполне совпадают с молекулярными весами, найденными осмотическим методом для тех же препаратов. [c.59]

Физические и химические свойства белков, Р-ры Б. обладают рядом свойств, характерных для лиофильных коллоидных р-ров. Частицы Б. не проходят через полупроницаемые мембраны, что используется для их очистки от низко-молекулярных соединений диализом. Наличие на поверхности частиц Б. многочисленных полярных групп обусловливает их значительную гидратацию. Так, количество гидратационной воды, связанной с альбуминами и глобулинами, составляет 0,2—0,6 г на 1 г сухого веса Б. В определенных условиях Б. образуют гели (студни). Во многих случаях Б. удается получить в кристаллич. виде. Б. в р-рах седимен-тируют в ультрацентрифугах при ускорении порядка 200 000 константы седиментации (s) Б. находятся в пределах от l-10 i до lOO-lO i сек. Коэфф. диффузии Б. О,МО —10-10 см /сек средний удельный объем 0,75 см г. Эти физико-химич, характеристики используются для определения мол. веса Б., а также степени асимметрии их молекул е/а, где в и а — продольная и поперечная полуоси гидродинамически эквивалентного эллипсоида, приближенно принимаемого за форму молекулы Б. Мол. вес Б. — от 5000 до нескольких миллионов, в/а — от 1 до 200. Для определения мол. весов и размеров молекул Б. широко применяется метод светорассеяния. Мол. веса могут быт1> определены также методом осмометрии, методом исследования монослоев на поверхности жидкой среды. Размеры молекул Б. определяются методом двойного лучепреломления в потоке, измерением коэфф. вращательной диффузии. Макромолекулы некоторых Б. наблюдались в электронном микроскопе. Для изучения структуры Б. широко применяется метод рентгеноструктурного анализа и электронографии. [c.193]

К 40-м годам относятся также первые работы в области исследования растворов полимеров, проведенные С. Е. Бреслером и И. Я. Под-дубным с сотрудниками. Так, еще в 1944 г. С. Е. Бреслером и Д. Л. Талмудом были выполнены работы по исследованию структуры глобулярных белков и их конформационным переходам [28]. В дальнейшем для изучения белков были применены современные методы (ультрацентрифуга, оптическая активность), в результате чего получено много новых результатов по конформационным переходам в белках [29—33]. [c.320]

Наилучшим примером применения ультрацентрифуги для изучения химического изменения белка может служить исследование влияния этерйфикации на молекулярную агрегацию инсулина. Моммертс и- Нейрат [152] получали метиловый эфир инсулина, обрабатывая инсулин метанольным раствором кислоты при 0 или 25° в течение различных промежутков времени. Процесс этерйфикации изучался при помощи ультрацентрифугирования в растворах с рН 3,7 и ионной силой 0,1 и 0,2. В отличие [c.342]

Развитие ж усовершенствование ультрацентрифуги Сведбергом и его сотрудниками [1] , начавшими свою работу с 1923 г. [2], привели к создакию ряда методов определения размеров частиц, молекулярных весов и распределения частиц по размерам, являю-ш,ихся наиболее надежными и совершенными при исследовании степени дисперсности коллоидных растворов и таких органических макромолекул, как белки и вирусы в растворах. [c.461]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология