Антитела аффинность к антигену

Аффинность моноклональных антител к антигену является важным параметром, мерой которого служит константа связывания /Ссб. [c.323]

Как было показано выше, целлюлоза была первым носителем в аффинной хроматографии. Обзор данных по применению целлюлозы для выделения антител и антигенов приведен в работе [81]. Данные о ковалентном связывании нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот обобщены в статье [33]. Хотя в настоящее время в аффинной хроматографии применяются и другие твердые носители, целлюлоза не потеряла своего значения. Трипсин, связанный с целлюлозой, по-прежнему ис- [c.40]

Аффинность антитела к антигену - это результирующая возникающих между ними сил притяжения и отталкивания. Высокоаффинные антитела точно комплементарны по конформации антигену, а низкоаффинные, напротив, неточно. [c.152]

Кинетически связывание антител с антигеном характеризуется константами скоростей прямой (ассоциация) и обратной (диссоциация) реакций, соответственно К, 2 (моль с ) и К2 [ (с ). В условиях равновесия отнощение этих двух констант скоростей дает константу равновесия, которая характеризует аффинность данного образца антител. Прежде считалось, что различия между антителами по аффинности проявляются в первую очередь различиями в скорости диссоциации иммунных комплексов, но совсем недавно было обнаружено, что скорость ассоциации также зависит от аффинности. [c.153]

Аффинность связывания антител с антигеном представляет не только теоретический интерес. От нее, как и от авидности, зависят физиологические и патологические эффекты антител. Высокоаффинные антитела гораздо активнее низкоаффинных в ряде биологических реакций рис. 9.14). В экспериментах на животных иммунные комплексы, содержащие низкоаффинные антитела, длительно персистируют в циркуляции и [c.155]

В дозах, недостаточных для полного подавления продукции антител, IgG повышает их среднюю аффинность в результате того, что успешно конкурировать с пассивно введенными антителами за антиген способны лишь В-клетки, обладающие высокоаффинными рецепторами. Как предполагается, регуляция по механизму обратной связи, осуществляемая антителами, играет важную роль в процессе повышения аффинности антител (рис. 13.6). [c.241]

М гуанидином-НС1], разрушающим связи в комплексе антиген-антитело. Этим методом можно получить и очищенные препараты антигенов, если использовать иммуносорбент, содержащий антитела. Аффинную хроматографию применяют также для выделения молекул других типов. Так, на поверхности частиц с пришитым лектином будут сорбироваться все молекулы, имеющие остатки определенных сахаридов эти молекулы элюируют буферным раствором, содержащим свободные сахара, которые конкурируют с адсорбированными белками за участки связывания лектина. [c.536]

Авидность. Мера прочности связывания антител с антигеном, определяемая как аффинностью взаимодействия между эпитопами и паратопами, так и валентностью антител и антигена. [c.556]

Эта теория дает также объяснение феномена созревания аффинности (сродства антитела к антигену). Образующиеся на поздних стадиях иммунного ответа антитела имеют большую аффинность, чем те, что образовались ранее (рис. 3.8). По мере того, как концентрация антигена в лимфоидной ткани падает, конкуренция за связывание с редким антигеном приводит к тому, что для размножения отбираются более успешные В-клетки. В-лимфоциты с поверхностным рецептором самой высокой аффинности (антиген связывается более прочно) будут побеждать в соревновании, и синтезируемый ими тип антител станет, в конечном счете, преобладающим. В следующей главе (рис. 5.4) мы рассмотрим этот процесс отбора, основанного на сродстве, более подробно. [c.96]

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Методы аффинной хроматографии, основанные на реакциях антиген — антитело, открыли новое направление и новые возможности применения иммуноадсорбции. Принципы и условия использования иммунной аффинной хроматографии при иммобилизации антител или антигенов описаны в литературе [70, 75]. Два варианта применения иммуноаффииной хроматографии схематически представлены на рисунке 4.10. [c.109]

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматофафии распределительнся хроматография основана на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газожидкостная матофафия) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах ионообменная хроматография — на разной способности веществ к ионному обмену адсорбционная хроматография — на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом эксклюзионная хроматография — на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ, аффинная хроматография — на специфических взаимодействиях, характерных дпя некоторых биологических и биохимических процессов. Существуют пары веществ, реагирующих в растворах с высокой избирательностью, например антитело и антиген, фермент и его субстрат или ингибитор, гормон и соответствующий рецептор, и т. п. Если одно из соединений пары удерживается ковалентной связью на [c.267]

Первоначально передо мною стояла цель сделать обзор выделенных методом аффинной хроматографии веществ, а также кратко обсудить наиболее существенные моменты, знание которых необходимо для усиеплного применения этого метода. Однако изучение литературы привело меня к мысли о том, что аффинная хроматография далеко не ограничивается выделением веществ. В связи с тем что в ее основе лежит образование специфических комплексов, например ферментов с их ингибиторами, антител с антигенами, лектинов с сахарами и гликопротеинами и т. д., аффинная хроматография является весьма полезной также и при изучении этих специфических взаимодействий. [c.7]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

Специфические сорбенты, использующие исключительные свойства биологически активных веществ образовывать специфические и обратимые комплексы, в огромной степени облегчают выделение ряда ферментов, их ингибиторов и кофакторов, антител и антигенов, лектинов, гликопротеинов, гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, жиров, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, клеток и многих других соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные группы, причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью гидрофобной или ковалентной хроматографии. [c.367]

Другой механизм связан с изменением конформации Рс-фрагмента после взаимодействия антитела с антигеном. Конфор-мационая модификация обеспечивает повышение аффинности взаимодействия и в результате — успех поглощения антигена. Этот последний механизм особенно важен при захвате молекулярных антигенов, таких, например, как токсины бактерий. [c.258]

При вторичном ответе принципиальные события, очевидно, те же, что и при первичном ответе. Однако в реакцию на антиген вс1упают уже подготовленные клетки с высокоаффинными антигенраспознающими рецепторами. Возможно, при вторичном ответе идет дополнительное повышение аффинности рецепторов, что определяет еще большее сродство антител к антигену. Это предположение строится на экспериментальных данных по последовательному повышению аффинности антител после первичной, вторичной и третичной иммунизации. [c.337]

Константа равновесия К формально определена здесь как отношение между скоростями прямой н обратной реакций в уравнении (1). Прн таком определении высокая аффинность -антител к антигену соответствует высоким численным значениям К. Если концентрация реагирующих единиц выражена в молях иа литр (как молярность М), то К выражается в литрах на моль (т. е. М" ). Прн непользоваини единиц системы СГС концентрацию выражают в молекулах на кубический сан- [c.13]

Аффинность (сродство) антитела - мера прочности связи антигенсвязывающего центра молекулы антитела с отдельным эпитопом антигена. Функциональная аффинность, или авид-ность, взаимодействия антител с антигеном определяется также числом антигенсвязывающих центров в молекуле антитела и их способностью связываться с многочисленными эпитопами данного антигена. [c.149]

Аффинностью, или сродством, антител к антигену называют силу их взаимодействия (прочность связи) — результирующую перечисленных выше сил притяжения и отталкивания (рис. 9.5). Взаимодействие антигенсвязывающего центра с антигеном можно исследовать термодинамическим методом. Для измерения аффинности отдельного антигенсвязывающего центра используют моновалентный антиген, или, точнее, изолированную антигенную детерминанту (гаптен). Поскольку нековалентные связи между паратопами и эпитопами способны диссоциировать, образование иммунных комплексов — процесс обратимый применив к нему закон действующих масс, можно определить константу равновесия К, которая собственно и представляет собой константу аффинности (сродства) рис. 9.6). [c.152]

Если судить по величине константы равновесия, поливалентное связывание антител с антигеном (функциональная аффинность, или авидность) значительно прочнее простого моновалентного связывания (собственно аффинности, константа которой принята в данном случае произвольно за 10 л моль ). Раньше этот феномен называли усиливающим эффектом поливалентности благодаря такому эффекту энергия связывания увеличивается, например, в случае IgG в 10 раз при участии в нем обоих антигенсвязывающих центров молекулы и в случае IgM в 10 раз. [c.153]

На поверхности каждой отдельной зрелой В-клетки проявляются антитела одной специфичности, т. е. для синтеза каждой молекулы Ig используется один набор генов вариабельной области антитела. Чужеродный антиген, попадающий в организм, отбирает только те В-клетки, с которыми он может связываться. Эти клетки активируются и начинают делиться (пролиферируют), образуя клон специфичных В-клеток, причем все потомки имеют идентичную специфичность. Затем этот клон может сильно размножиться некоторые потомки становятся В-клетками, секретирующими антитела, а другие — долгоживущими В-клетками памяти (которые активируются, если тот же антиген снова попадает в организм — принцип поддерживающей вакцинации). Свойства некоторых В-клеток памяти свидетельствуют о соматическом гипермутировании, т. е. об изменении в ходе иммунного ответа V-гена вариабельной области антитела по сравнению с ДНК-последовательностью, закодированной V-геном половой клетки (зародышевой линии). Антитела, продуцируемые такими мутантными В-клетками памяти, обычно имеют более высокую аффинность (сродство), чем антитела, синтезируемые клетками клона, образовавшегося в начале иммунного ответа. [c.202]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Любой из компонентов названных и им подобных биоспецифиче-ских пар можно надежно закрепить на матрице в качестве так называемого лиганда . С его помощью второй партнер пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса. Иногда это может быть не одно, а несколько родственных или схожих по своей структуре веществ, узнающих один и тот же лиганд, например изоферменты пли ряд ферментов, использующих один и тот же кофермент, различные виды антител к одному и тому же антигену и т. д. [c.339]

Использование белков-антигенов в качестве лигандов для очистки специфических антител на иммуносорбентах было описано в предыдущей книге этой серии [Остерман, 1983]. Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylo o us aureus. Обе эти системы с полным правол можно включить в перечень аффинных хроматографических систем. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы пли гаптенов. [c.362]

В сыворотке иммунизированных животных всегда накапливаются продукты, секретируемые многими клонами В-лимфоцитов. Сывороточные антитела при любых схемах иммунизации представляют собой смесь молекул антител, гетерогенных по специфичности, аффинности и классовой принадлежности, вследствие чего имеется неизбежная перекрестная реактивность иммунных сывороток с разными антигенами. Перекрестная реактивность делает трудным или невозможным идентификацию уникальных антигенов. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных, являются продуктами потомков всего лишь одной В-клетки, и поэтому препараты моноклональных антител имеют особые свойства, вытекающие из небывалой степени биохимической гомогенности моноклональные антитела высокоспецифичны. Они направлены против одной и той же антигенной детерминанты моноклональные антитела стабильны как эталоны в отношении специфичности и аффинности (прочности связи с антигеном). Исследователь может целенаправленно подобрать моноклон, вырабатывающий антитела только нужного сорта , т. е. класса, подкласса, специфичности, аффинитета. [c.309]

Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аффинных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антитело-антиген, агонист (антагонист)-клеточный рецептор, а также на основе полупроводниковых структур и мезоэлектричес-кого эффекта. Последние два биодатчика дают возможность создавать сенсоры, чувствительные к газам, что имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменения внешних воздействий. [c.102]

Б случае иммуноэлектрофореза [49 — 51] принцип электрофореза сочетается с биоспецифической аффинностью белка (рис. 3-5). Белки-антигены сначала разделяются гель-электрофоретически. При встрече с диффундированными внутрь геля антителами происходит образование комплексов антиген — антитело, наблюдаемых в виде серповидных полос преципитации. Иммуноэлектрофорез имеет особое значение в медицинской диагностике (разделение и идентификация сывороточных белков и др.). Рис. 3-6 поясняет эффективность этого метода по сравнению с другими видами электрофореза. [c.352]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Хорошо известная трудность в получении иммунных сывороток состоит в изменчивости иммунного ответа не только у отдельно взятых особей одного и того же вида, но также у одной и той же особи в ходе иммунизации [89]. Так, пробы иммунных сывороток, взятые у нескольких животных или у одного и того же животного в процессе иммунизации, представляют собой гетерогенный набор молекул с разными антигенсвязывающими центрами и различной аффинностью к антигену. Это относится даже к антителам, специфическим к отдельному эпитопу. Практически, чтобы получить достаточный запас однородной иммунной сыворотки, приходится делать смеси сывороток, полученных разными отборами их у иммунизированных животных. [c.96]

Было разработано несколько аффинных меток. Среди них - глутатионтрансфераза, белок, связывающий мальтозу, и короткие аминокислотные последовательности - антигенные детерминанты, которые связываются соответственно с глутатионом, мальтозой и специфическими антителами. Использовали и разные сайты расщепления, специфичные для тромбина, энтерокиназы и других протеиназ. Аффинная метка и сайт расщепления могут находиться как на N-, так и на С-конце рекомбинантного белка и использоваться в прокариотических системах экспрессии, а также в системах экспрессии на основе клеток насекомых, млекопитающих или грибов. [c.149]

Важной группой аффинных сорбентов являются иммобилизованные антитела, или антигены. В первом случае сорбенты могут бьпъ использованы для специфического выделения определенных антигенов, или гаптенов, из сложных смесей. В этом случае эти сорбенты называют иммумосорбентами. Во втором случае иммобилизованные антигены способствуют выделению антител с определенной специфичностью из сложной смеси антител. [c.248]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Аффинная хроматография как метод, по-видимому, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. [21] для выделения а-амплазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Принцип аффинной хроматографии, использующий аффинанты, ковалентно связанные с нерастворимой матрицей, известен более 20 лет. Кемпбелл и др. [6] были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом [15], который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что, очевидно, об- [c.15]

И спользованне аффинной хроматографии тем не менее не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже в 1960 г. Яги и др. [22] описали определение небольших количеств антител с помощью нерастворимых носителей с привязанными антигенами. Применение нерастворимых носителей в количественном радиоиммунном анализе детально рассмотрено в ра.зд. 11.7. Иммобилизованные олигомеры полнтпмидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. [11] для количественного определения полнадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс [c.16]

Обзор аффинных лигандов, используемых для выделения ферментов, ингибиторов, кофакторов, антител, антигенов, агглютининов, гликопротеинов и гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, липидов, клеток, вирусов и других веществ дан в гл. 11 (табл. 11.1). [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология