Ферменты и ферментативные реакции

Исследования кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме — один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия ферментов. Это определяется рядом особенностей ферментативных реакций и прежде всего тем, что для ферментативных реакций стационарное состояние устанавливается весьма быстро. Для простейшей схемы ферментативного процесса с участием одного промежуточного соединения (схема Михаэлиса — Ментен) [c.171]

Ферментативная реакция — это, как правило, многостадийный процесс, в котором на первой стадии образуется комплекс между ферментом и субстратом (комплекс Михаэлиса), Чаще всего эта стадия представляет собой сорбцию субстрата на ферменте, обусловленную, например, их гидрофобным, полярным и (или) ионным взаимодействием (см, гл. I), На образование комплекса Михаэлиса, предшествующее химическому взаимодействию, указывают многочисленные экспериментальные данные, в том числе и кинетические (см, гл. V и VI) некоторые фермент-субстратные комплексы были выделены в чистом виде [1]. Возникает вопрос, в какой мере способствует (и способствует ли) образование фермеит-субстратного комплекса ускорению катализируемой реакции. [c.34]

И, наконец, обратим внимание еще на один аспект моделирования, имеющий важное прикладное значение, — это создание высокоактивных и высокоспецифичных катализаторов, действующих по принципам ферментативного катализа. В настоящее время, однако, в этом направлении делаются лишь первые шаги, по которым трудно судить о реальных перспективах в этой области. В качестве примера можно указать на успехи в моделировании нитрогеназы — фермента, катализирующего реакцию восстановления молекулярного азота [7, 8]. Не исключено, что с помощью систем, моделирующих нитрогеназу, можно будет решить важную прикладную задачу — фиксацию азота в мягких условиях. [c.72]

Данный простой пример приводит к интересным предположениям относительно механизмов ферментативных реакций. Происходит ли конформационное изменение субстратного тетраэдрического интермедиата пли остатка активного центра фермента Очевидно, для решения этой проблемы необходимы биоорганические модели. Такие модели, которые еще только будут созданы, дадут возможность определить механизм действия протеаз исходя из тетраэдрического интермедиата с относительно фиксированной конформацией. [c.252]

Каким образом такое ограниченное число функциональных групп участвует в разнообразных ферментативных реакциях и каким механизмом можно объяснить огромную скорость ферментативных реакций Такие фундаментальные вопросы должны быть поставлены при проектировании биоорганической модели фермента [130]. [c.264]

Монометрические датчики на основе ферментов отличаются высокой селективностью, обусловленной уникальной специфичностью ферментов по отношению к ферментативной реакции и к субстрату. Каждый фермент катализирует лишь определенный тип реакции. Поэтому создание ферментных электродов откры- [c.57]

Катализируемая ферментом (ферментативная) реакция протекает на особом участке его белковой цепи такой участок называется активным центром фермента. Вещества, вступающие в реакцию на этом участке, называются субстратами. Кроме субстрата в ферментативной реакции могут участвовать и другие необходимые вещества, называемые кофакторами, или коферментами. Например, для действия фермента иногда необходимо присутствие иона Mg или другого металла или участие какой-либо небольшой органической молекулы. [c.450]

Под действием различных ферментов или энзимов с исключительной избирательностью в животных и растительных организмах проходят многочисленные реакции. Ферменты являются органическими катализаторами белковой природы и обладают свойствами, переходными между гомогенными и гетерогенными катализаторами, приближаясь, однако, к свойствам гетерогенных. По этой причине в настоящее время ферментативные реакции называют микро-гетерогенными. [c.22]

Обратим внимание, что образование промежуточного фермент-субстратного комплекса (комплекса Михаэлиса) само по себе вовсе не оказывает влияния на ускорение ферментативной реакции (в кинетическом режиме второго порядка, т. е. при [НУ] С Кз)- Дело в том, что концентрация стабилизированного пере- [c.40]

Наиболее очевидный способ, с помощью которого фермент увеличивает скорость бимолекулярной реакции,— способствовать простому сближению реагирующих молекул в активном центре фермента. В этой связи возникают два важнейших вопроса во-первых, какого увеличения скорости можно ожидать при таком сближении реагентов и, во-вторых, каков механизм этого увеличения скорости. В настоящей главе мы постараемся прояснить эти вопросы. Изменение степени сольватации также способно вызвать значительный эффект увеличения скорости как в меж-молекулярных, так и в ферментативных реакциях. Неполярная внутренняя область фермента напоминает своей низкой диэлект- [c.202]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Практически во всех процессах, происходящих в биологических системах, участвуют ферменты. Биохимию можно даже охарактеризовать как химию ферментативных реакций. [c.274]

Как видно из анализа, проведенного в этом параграфе, в ферментативных реакциях, протекающих при избытке концентрации фермента по сравнению с субстратом [см. условие (5.21)], стационарное состоя- [c.184]

Использование ферментного электрода не ограничивается определением продуктов ферментативной реакции. В принципе возможно определение любого вещества, участвующего в этой реакции, в том числе и активности самого фермента, концентраций активаторов и ингибиторов и т.д. [c.58]

Вторая часть книги посвящена кинетическим закономерностям ферментативных реакций. В теоретическом и методическом плане рассматривается ряд подходов как нестационарной, так и стационарной кинетики, наиболее полезных для выяснения механизма действия ферментов и топографии их активных центров. [c.2]

В итоге уже сейчас накопилось Достаточно данных, из которых следует, что ферментативные реакции при всей сложности протекают в полном соответствии с общими закономерностями химических превращений [1—6], и, следовательно, некоторые общие принципы действия ферментов могут найти объяснение на основе теории абсолютных скоростей реакций [5]. [c.3]

Вообще говоря, возможны четыре типа факторов, определяющих каталитическую активность фермента. Во-первых, необходим химический аппарат в активном центре, способный деформировать или поляризовать химические связи субстрата, что делает последний более реакционноспособным, во-вторых,— связывающий центр, иммобилизующий субстрат в правильном положении к другим реакционным группам, участвующим в химическом превращении, в-третьих,— правильная и точная ориентация субстрата, благодаря которой каждая стадия реакции проходит с минимальным колебательным или вращательным движением вокруг связей субстрата, и, наконец, в-четвертых, способ фиксирования субстрата должен способствовать понижению энергии активации ферментсубстратного комплекса в переходном состоянии. Соответствующее распределение зарядов в активном центре и геометрия активного центра входят в число факторов, определяющих снижение суммарной энтропии переходного состояния. Все эти факторы в той или иной степени влияют на структуру активного центра фермента, и их нельзя рассматривать изолированно, вне связи друг с другом. В совокупности они увеличивают скорость ферментативной реакции и позволяют ферменту выступать в роли мощного катализатора [77]. [c.209]

Кинетические закономерности ферментативных реакций с участием двух промежуточных соединений. Кинетика трехстадийной реакции с равновесной первой стадией. Детальный кинетический анализ действия ряда ферментов обнаруживает участие в механизме катализа по крайней мере двух промежуточных соединений. [c.190]

М раствора триса, объем доводят до 10 мл водой, pH 8,3). Реакционная смесь в 1 мл содержит 50 мМ трис, pH 8,3, 4 мМ глюкозо-6-фосфат. Пробы инкубируют 1—2 мин при 37° С, после чего реакцию начинают добавлением глюкозофосфатизомеразы (в объеме 25— 50 мкл). Останавливают реакцию добавлением 8 н. НС1. Контрольную пробу инкубируют без фермента. Ферментативную реакцию измеряют в различные промежутки времени с интервалом 30 с. [c.233]

Природные оптически активные соединения в большинстве случаев получаются в результате высокоспецифичных дифференцирующих реакций, протекающих в живых системах под действием ферментов. Ферментативные реакции часто рассматриваются как особый тип реакций, однако нет принципиальной разницы между ферментативной реакцией и обычной стереодифференцирующей реакцией, так что ферментативные реакции также могут быть подразделены на шесть типов реакций, которые рассматривались в предыдущем разделе. Главным характерным различием между ферментативными реакциями и обычными стерео-дифференцирующими реакциями является то, что ферментативные реакции часто сочетаются с другими видами стерео-дифференцирующих процессов. Так как был опубликован полный обзор [8] работ по ферментативным реакциям прохиральных соединений, осуществляемых на обычных системах, в качестве примеров в этом разделе с точки зрения стерео-дифференциации будут рассмотрены лишь несколько ферментативных реакций. [c.191]

Каталитическая активность ферментов проходит через максимум при изменении pH. В сильнокислых и сильнощелочных средах ферменты теряют каталитическую активность вследствие денатурации белка. В области 0- 40° С скорости реакций, катализируемых ( рмен-тами, при повыщении температуры возрастают в соответствии с уравнением Аррениуса. Энергия активации ферментативных реакций лежит в пределах 20 80 кДж/моль. При температурах 60—70 С белки денатурируются и полностью теряют каталитическую активность. [c.633]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

Применение импульсного фотолиза для исследования ферментативных реакций. Созданле светочувствительных материалов на основе ферментов предусматривает образование активного фермеп-Тс1 под действием света. Общая схема реакции может быть представлена следующим образом [c.197]

Г/,е Епеапт И Еапт —фермент в активном и неактивном состоянии 5 — субстрат (Е5) — субстрат-ферментный комплекс (комплекс Михаэлиса) Р —продукт ферментативной реакции. [c.197]

Так, например, при неупругих столкновениях обшивок ракет и самолетов с молекулами воздуха, за счет накопления энергий неупругих соударений, обшивки могут оплавляться, а молекулы азота и кислорода вступать в каталитические реакции с образованием окислов азота и другие [25-27]. Поэтому, если в каталитических и ферментативных реакциях для их ускорения необходимо повышать частоту и энергию неупругих соударений, то для снижения сопротивления трения газов и жидкостей на твердой поверхности требуется снижать частоту и энергию неупругих соударений. Автором монографии разработаны и внедрены в промышленность принципиально новые и более экономически эффективные способы повышения частоты и энергии неупругих соударений реагирующих веществ с катализаторами, которые способны повышать активность всех имеющихся в мире промышленных катализаторов [17], а также экономически эффективные способы снижения частоты и энергии неупругих соударений обтекающих газов и жидкостей о твердую поверхность, в результате которых снижается сопротивление их трения до 20% , а следовательно, сокращают расход топлива на единицу мощности двигателя, также на 20% [28]. Эти же методы повышения или понижения частоты неупругих соударений можно применить и для повышения нли понижения скоростей ферментативных реакций в клетках животных и растений, так как термодесорбируемые субстраты неупруго соударяются внутренними поверхностями "кармана" (щелей) глобул ферментов, а изотермически десорбируемые субстраты (химически превращаемые вещества ферментом) неупруго соударяются с поверхностью глобул фермента [15]. Отметим, что полярные С и М-концевые и боковые группы белковой части ферментов расположены на поверхности глобул ферментов [29-31], их вращательные и колебательные движения совершаются с целью повышения частоты и энергии неупругих соударений субстратов с поверхностью глобул ферментов. Поэтому скорость ферментативных реакций в 10 " раз превышает скорости химических [29]. [c.46]

В разных случаях гидролиз амидной связи может также ускоряться. В приведенном ниже примере каталитический эффект оказывает пиридиновое кольцо. Первая скоростьлимитирующая стадия (медленная) приводит к образованию промежуточного ацилпиридиния(1-11), напоминающего ацильиое производное фермента, обнаруживаемого во многих ферментативных реакциях. Это промежуточное соединение затем быстро гидролизуется водой. [c.18]

В качестве моделей ферментов, как правило, используют синтетические органические молекулы, обладающие характерными особенностями ферментативных систем. Они меньше ферментов по размеру и проще по структуре. Следовательно, моделирование ферментов — это попытка воспроизвести на гораздо более простом уровне некий ключевой параметр ферментативной функции. Выявление определенного фактора, ответственного за каталитическую активность фермента в биологической системе, является трудоемкой задачей, требующей ясного представления о роли каждого компонента в катализе. Но, располагая подходящими моделями, мы можем оценить относительную важность каждого каталитического параметра в отсутствие других, не рассматриваемых в данный момент. Главное преимущество использования искусственных структур для моделирования ферментативных реакций состоит в том, что вещества можно создавать именно для изучения определенного конкретного свойства. Структура модели в дальнейшем может быть усовершенствована путем сочетания таких особенностей, которые дают наибольший вклад в катализ, и создания таких моделей, которые по своей эффективности действительно приближаются к ферментам. Таким образом, с помощью методов синтетической химии становится возможным создание миниатюрного фермента , который лишен макромоле-кулярного пептидного остова, но содержит активные химические группы, правильно ориентированные в соответствии с геометрией активного центра фермента. Этот подход называют биомимети-ческим химическим подходом к изучению биологических систем . Биомиметическая химия — это та область химии, где делается попытка имитировать такие характерные для катализируемых ферментами реакций особенности, как огромная скорость и селективность [350, 351]. Хочется надеяться, что такой подход в конце концов позволит установить связь между сложными структурами биоорганических молекул и их функциями в живом [c.263]

Наряду с катализом за счет свободной энергии сорбции (см. 1—4 этой главы) ферментативные реакции находят источник ускорения в том, что молекула субстрата подвергается химической атаке не одной каталитической группой (как это происходит в гомогенно-каталитических реакциях второго порядка), а сразу несколькими. Это связано с тем, что третичная структура белка позволяет сосредоточить в активном центре фермента значительное число электрофильных и нуклеофильных групп, таких как имидазольная, карбоксильная, сульфгид-рильная, аммонийная, фенольная и др. (см. гл. I), которые, как известно из гомогенного катализа, представляют собой общекислотные и общеосновные катализаторы. Именно поэтому в промежуточных фермент-субстратных комплексах в принципе возможна атака сорбированной субстратной молекулы по механизмам общего кислотноосновного катализа. [c.61]

Проблемы и перспективы применения ферментов в анализе объектов окружающей среды рассмотрены в ряде обзоров [83-85 и монофафий 4,86) В принципе использование ферментативных реакций является частным случаем кинетических методов анализа, основанных на измерении скорости индикаторной каталитической реакции в присутствии различных количеств определяемых веществ Для правитьного применения 2ХХ [c.288]

Ферментные (энзимные) электроды представляют собой электродные устройства (ионометрические датчики), позволяющие определять концентрации веществ, участвующих в ферментативных реакциях. Для этой цепи на чувствительный элемент ионоселективного электрода или на специальный носитель, расположенный на некотором расстоянии от него, наносят спой, содержащий фермент. Обычно фермент применяют в иммобилизированном состоянии, используя один иэ методов иммобилизации ковалентное связывание с поверхностью электрода, внедрение фермента в сетку геля или полимера, ковалентную сшИвку молекул фермента между собой с помощью соответствующего полифунк-ционального реагента, [c.57]

Из уравнения (2.21) видно, что термодинамически эффективность ферментативного катализа определяется разницей свободных энергий межмолекулярного (при образовании комплекса Михаэлиса) и внутримолекулярного (в переходном состоянии реакции) образования связи Е-Я. Следовательно, в количественном отношении кинетическая роль комплексообразования Е Н в ускорении ферментативной реакции представляется несколько иной, чем в кинетическом режиме второго порядка (уравнение 2.19). Однако и здесь движущей силой катализа остается свободная энергия взаимодействия Е-Н именно в переходном состоянии реакции (а не в промежуточном комплексе). Действительно, чем более термодинамически выгодным будет внутримолекулярное взаимодействие Е-К в активированном состоянии (чем более отрицательные значения примет величина АОз внутр). тем более благоприятным должно быть отношение VI/ии для ферментативной реакции [см. (2.21)]. Это связано с тем (см. рис. 12), что барьер свободной энергии активации ферментативной реакции (ДО/. внутр) в этом случае уменьшается (по сравнению с ДОи) и, следовательно, скорость процесса [уравнение (2.20)] возрастает. Наоборот, при заданном значении ДО .ппутр термодинамически более благоприятное взаимодействиеЕ -Н в исходном состоянии реакции (фермент-субстратный комплекс ХЕ-КУ) будет тормозить ее протекание. Так, более отрицательные значения Д(3 приводят к неблагоприятным значениям VI /иц в отношении ферментативного процесса [уравнение (2.21)]. Это связано с тем, что активационный барьер Д01% утр (см. рис. 12), определяющий скорость превращения фермент-субстратного комплекса [уравнение (2.20)], при этом возрастает. [c.41]

Казалось бы в таком случае, что эффективность ферментативного катализа должна возрастать при увеличении потенциальной свободной энергии внутримолекулярного взаимодействия ( AG ,gnyrj,p ). Это действительно происходит в ферментативных реакциях второго порядка (см. 2 этой главы), однако при [RY] Ks, когда исходное состояние реакции — это фермент-субстратный комплекс, такое требование не достаточно. Из (2.32) видно, если более благоприятные условия для сорбции (при изменении, например, структуры субстрата) приводят одновременно (и в той же мере) к увеличению также и прочности образующегося комплекса XE-RY (к более отрицательным значениям AG ), эффект [c.57]

Нерешен также и вопрос о ковалентном катализе. В ряде ферментативных реакций образуются промежуточные соединения с ковалентной связью между ферментом и субстратом [29, 48, 49]. В качестве примера можно указать на протеазы, где в ходе ферментативной реакции образуется ацилфермент (см. гл. IV). Трудно сказать, почему реакция не протекает прямо, а идет через образование промежуточного соединения с ферментом (или коферментом). В этом отношении Дженкс [29] указал, что именно здесь могут быть заложены важные химические закономерности ферментативного катализа, которые в настоящее время почти или вообще не поняты . Не исключено, однако, что причина простая, а именно, что в ковалентно-связанном промежуточном соединении легче, чем в сорбционном фермент-субстратном комплексе, реализуются различного рода механизмы напряжения, которые позволяют использовать свободную энергию сорбции химически инертных субстратных фрагментов на ферменте на понижение активационного барьера скоростьлимитирующей химической стадии (см. 4 этой главы). Возможно, наличие промежуточных соединений в ферментативных механизмах отражает лишь сложную картину участия в реакции большого числа функциональных групп, многие из которых вообще склонны образовывать ме-тастабильные продукты (как, например, имидазольная группа [29]). Иными словами, образование промежуточных соединений хотя и сопровождает ферментативный катализ, но, возможно, не имеет прямого отношения к наблюдаемым ускорениям. [c.66]

Подобного рода эффекты возможны также и в ферментативных реакциях, поскольку микросреда активного центра многих ферментов обнаруживает по своей полярности или диэлектрической проницаемости свойства скорее органических растворителей, чем воды (см. гл. I). По аналогии с э ектами, наблюдаемыми в нефермента-тиБных реакциях, десольватация реагирующих групп в активных центрах ферментов может дать ускорение более чем в 10 раз [291 (если сравнивать ферментативный процесс с гомогенно-каталитической реакцией, идущей в воде). В литературе пока не описаны системы, для которых было бы строго доказано участие сольватационных эффектов или электростатической стабилизации, в ферментативном катализе. [c.67]

Зависимость скоростей реакций, катализируемых химотрипсином, от pH обнаруживает оптимум при pH 8. [42]. Механизм зависимости химотрипсино-. вого катализа от pH заключается в следующем [6—9, 13, 43, 44]. Эффективные константы скоростей химических стадий ферментативной реакции 2 и сохраняют постоянное значение при щелочных и нейтральных значениях pH, но при дальнейшем понижении pH они уменьшаются. Сигмоидальный характер этих зависимостей указывает на участие в катализе ионогенной группы фермента с рЛГа7. Многие годы полагали, что этой группой является имидазольный фрагмент His-57, однако позднее она была идентифицирована как карбоксил Asp-102 [45]. Ее протонизация разрушает водородные связи в составном нуклеофиле (рис. 32), что приводит к потере ферментом каталитической способности. [c.132]

Доминантную роль в нековалентном связывании субстрата на ферменте играет сорбционное взаимодействие с белком боковой группы К (табл. 28). Из таблицы видно, что введение углеводородной группы СбНзСНг— как в молекулу метилацетата (при переходе к метилгидро-циннамату), так и в молекулу метилацетурата (при переходе к М-аце-тил-L-фeнилaлaнинaтy) обуславливает увеличение константы сорбции К7, М ) примерно на 2 порядка. С другой стороны, наличие в молекуле субстрата достаточно объемной углеводородной группы К приводит также и к ускорению на несколько порядков химических стадий ферментативной реакции. [c.134]

Исследование ферментативных реакций в предстационарном режиме нуждается в специальной экспериментальной технике, поскольку используемые методы должны иметь достаточно высокую временную разрешающую способность. Мертвое время экспериментальной методики должно быть существенно меньше времени протекания реакции в предстационарном режиме. В качестве примера рассмотрим случай реакции с участием одного промежуточного соединения. Экспериментальную методику можно считать удовлетворительной, если ее мертвое время будет меньше величины т [см. уравнение (5.109)]. Используя наиболее характерные для ферментативного катализа значения констант скоростей, можно оценить величину т. Величина константы скорости образования фермент-субстратного комплекса ( 1) для большинства ферментативных реакций лежит в диапазоне 10 —10 М" X Хс (см. гл. VII). Типичное значение Кт, характерное для многих ферментативных реакций, равно 10 М. Если положить минимальную концентрацию субстрата равной 10" М (эту концентрацию еще можно определить чувствительным спектрофотометрическим методом), зна-чениет будет лежать в диапазоне 10 —10" с. Это показывает, что для исследования предстационарной кинетики ферментативных реакций необходима специальная экспериментальная техника, позволяющая регистрировать кинетические процессы в микро- и миллисекундном временном диапазоне. [c.204]

Использование релаксационного подхода к изучению механизмов ферментативных реакций привело к выяснению детального постадийно-го механизма катализа ряда ферментов. В качестве примера рассмотрим проведенное Г. Хаммесом исследование механизма катализа аспартатаминотрансферазой. [c.212]