Стационарная кинетика ферментативных реакций

Исследования кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме — один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия ферментов. Это определяется рядом особенностей ферментативных реакций и прежде всего тем, что для ферментативных реакций стационарное состояние устанавливается весьма быстро. Для простейшей схемы ферментативного процесса с участием одного промежуточного соединения (схема Михаэлиса — Ментен) [c.171]

Другой важный фактор, способствующий развитию стационарной кинетики ферментативных реакций, — простота экспериментальных методов исследования этих реакций в стационарном режиме. Существенную роль играет также и то, что формально-кинетический анализ уравнений стационарной кинетики, основанный на решении систем линейных алгебраических уравнений, достаточно прост и хорошо разработан (см. [2—4]), а также гл. VI). [c.174]

Стационарная кинетика ферментативных реакций зачастую отличается от кинетики Михаэлиса—Ментен (с. 178). На кривой зависимости скорости реакции V от концентрации субстрата. 5 или (и) концентрации модификатора наблюдаются перегибы, максимумы, плато. На рис. 6.13 для примера показана кривая [c.199]

Стационарная кинетика ферментативных реакций с двумя субстратами [c.66]

Детальное исследование стационарной кинетики ферментативной реакции может дать важную информацию о механизме действия фермента. Рассмотрим особенности и логику исследования механизма реакций в стационарном режиме на примере изучения гидрогеназы — фермента, образующего и активирующего молекулярный водород. [c.36]

Во второй части книги, посвященной ферментам, рассматриваются как традиционные вопросы биокинетики (уравнение Миха-элиса — Ментен, различные виды ингибирования, влияние pH на скорость ферментативных реакций и т, д.), так и новые, не нашедшие пока отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант из данных стационарной кинетики, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений, кинетический анализ систем со взаимным истощением, анализ нетривиальных типов ингибирования, применение теории графов в ферментативной кинетике и др.). Требования систематизации курса способствовали созданию новых методов обработки кинетических данных ферментативных реакций, описываемых в главах 5—8, 10, 11. [c.4]

Мы рассмотрели лишь два крайних случая ингибирования. Зачастую приходится иметь дело с более сложными типами торможения (или, напротив, активации, когда модификатор ускоряет реакцию), например, со смешанным конкурентным и неконкурентным ингибированием и т. д. Эти процессы даже при стационарных условиях требуют решения более сложных уравнений. Математические методы стационарной кинетики сложных ферментативных реакций описаны в 7.6. [c.366]

Стационарная кинетика ферментативных реакций является обширной и хорошо изученной областью. Здесь мы остановимся на рассмотрении только некоторых основных характеристик кинетических систем. Более подробно эти вопросы изложены в литературе, приведенной в конце главы. [c.48]

Наука о ферментативном катализе (как и наука о любых химических реакциях) имеет две стороны — это представления о механизме и формальное описание его кинетических (или термодинамических) закономерностей. В первой части книги рассмотрен именно первый (механистический) аспект проблемы вторая часть посвящена формальной (практической) кинетике ферментативных реакций. При этом раздельно проведен кинетический анализ реакций, протекающих в нестационарных условиях (гл. V) и в стационарном режиме (гл. VI). [c.4]

Наиболее полную информацию о кинетике ферментативных реакций дает изучение их протекания в нестационарном режиме (см. гл. V). Исследование стационарной кинетики ферментативных процессов имеет ограниченное значение для понимания многостадийного механизма действия ферментов. Это связано прежде всего с тем,что в общем случае невозможно однозначно приписать экспериментально определяемые значения констант скоростей индивидуальным химическим стадиям (см. 1 гл. V и VI). Тем не менее кинетические параметры типа = = У/(Е](,и Кт.каж, которые, следуют из основного уравнения стационарной кинетики — из уравнения Михаэлиса (6.8), как показал Альберти с сотр. [1], позволяют оценить нижний предел константы скорости любой индивидуальной стадии ферментативной реакции [типа (6.9) или даже более сложного обратимого процесса (5.16)]. [c.268]

В недалеком будущем нужно ожидать осуществления попыток интерпретации поведения даже весьма сложных химических реакций, а типы колебаний будут классифицированы более систематически. В этом контексте, вероятно, будут пересмотрены некоторые из ранних работ. Так как колебательные реакции со всей очевидностью близки к биологическим системам, подчиняющимся кинетике ферментативных реакций, химические реакции в дальнейшем будут исследоваться не только в условиях стационарных состояний, но и с точки зрения их динамики с поиском решений (как устойчивых, так и неустойчивых). [c.83]

Первое систематическое изучение кинетики реакций с участием одного субстрата по схеме 1 провели Михаэлис и Ментен [10], однако рассмотрение кинетики ферментативных реакций по методу стационарных состояний, развитое Бриггсом и Холдейном 11], является более гибким и лучше согласуется с трактовкой нестабильных реакционноспособных промежуточных веществ в других типах реакций. Согласно этой трактовке, концентрация промежуточного комплекса быстро достигает стационарной величины. Выражения для скоростей реакций также упрощаются при допущении, что концентрация фермента намного меньше, чем концентрация субстрата, что несомненно справедливо для всех практически важных случаев. [c.116]

Как уже указывалось, любая ферментативная реакция представляет собой цепь последовательных процессов, каждое звено которой характеризуется собственной константой скорости, значениями энергии активации и пространственного фактора. Поэтому, определяя экспериментально стационарную скорость ферментативной реакции при разных температурах и вычисляя по этим данным энергии активации, исследователь часто получает фиктивную величину — значение кажущейся энергии активации, которое трудно отнести к какой-то определенной стадии реакции. По этим причинам при изучении температурной зависимости результирующей скорости ферментативного процесса оказывается невозможным вычисление предэкспоненциального множителя и пространственного фактора. Все это приводит к настоятельной необходимости разработки специальных методов ферментативной кинетики, позволяющих вычислять константы скорости отдельных стадий процесса и на основе изучения их зависимости от температуры рассчитывать другие кинетические константы. [c.24]

Стационарная скорость ферментативной реакции при наличии среди всех стадий одной, существенно более медленной, чем все остальные, определяется именно этой, наиболее медленной стадией. При соизмеримых скоростях отдельных стадий стационарная скорость всей реакции определяется соотношением констант скорости всех ступеней реакций. При этом, чем сложнее механизм реакции, тем это соотношение оказывается сложнее. Ввиду того, что одна из самых важных задач ферментативной кинетики — изучение механизма отдельных стадий реакции, перед исследователями возникает необходимость вычисления кинетических констант этих стадий. Эта проблема, к сожалению, пока может быть решена достаточно точно лишь для относительно простых по механизму реакций. В случаях сложных процессов стационарная кинетика может дать лишь приближенные решения. Однако и эти приближенные решения позво- [c.36]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Уонг [11] недавно также рассмотрел вопросы, связанные с математическим описанием кинетики ферментативных реакций, обратив особое внимание на гипотезу стационарности. Он отмечает, что существенным условием применимости гипотезы стационарности является быстрое образование фермент-субстратного комплекса — условие, которое, несомненно, выполняется при достаточно большом избытке субстрата по отношению к ферменту. Практический вывод, к которому он приходит (распространяя его и на двухсубстратные реакции), состоит в том, что принцип стационарности может быть использован в условиях, обеспечивающих линейную зависимость U0 от Ео. [c.53]

Это трехпараметрическое уравнение. Такого типа уравнения достаточно часто встречаются в стационарной кинетике ферментативного катализа. Помимо субстратного торможения трехпараметрическое уравнение описывает рН-зависи-мости ферментативных реакций, акти- [c.22]

Если нестационарный режим протекания реакции может выходить на стационарный режим, продолжительность которого зависит от начальной концентрации субстрата, то в таком случае кинетику ферментативных реакций рассматривают в предстационарном режиме. [c.109]

Довольно сложной проблемой в изучении кинетики трехстадийных ферментативных реакций является определение значений индивидуальных констант 2, 3 и К (схема 7.1). Как видно из уравнения (7.4), кинетический анализ трехстадийной реакции в стационарном режиме ее протекания не позволяет в общем случае раздельно определять значения индивидуальных констант. Однако в ряде случаев значения кг, кз и Кз можно определить путем селективного воздействия каких-либо эффекторов на отдельные стадии (ацилирования или деацилирования) стационарной ферментативной реакции. [c.145]

В последнее время широкое применение получили также релаксационные методы исследования кинетики ферментативных реакций. Они основаны на принципе, предполагающем, что при быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, электрического поля) время, необходимое системе для достижения нового стационарного состояния, зависит от скорости химической реакции (или иногда от скорости диффузии реагентов). Переход системы к новым стационарным концентрациям реагентов называется химической релаксацией . Если отклонение от равновесия, вызванное внешним воздействием, невелико, то кинетику релаксации можно описать с помощью дифференциальных уравнений с постоянными коэффициентами. Релаксационные методы, используемые для исследования быстрых химических реакций в растворах, имеют высокую разрешающую способность. Так, например, метод поглощения ультразвука обнаруживает время разрешения вплоть до наносекундного диапазона. Именно поэтому релаксационная кинетика широко используется при исследовании механизмов ферментативных реакций. [c.109]

В случае, когда Кгл.к ж [S], т. е. когда кинетика ферментативной реакции подчиняется уравнению первого порядка, имеем следующее выражение для стационарной скорости ферментативной реакции [c.103]

Может показаться, что те преимущества, которые дает изучение быстрых стадий, сделают исследования стационарной кинетики ненужными. Однако по ряду причин эти исследования, по-видимому, еще многие годы не потеряют своей актуальности. Прежде всего теория для стационарных стадий ферментативной реакции намного проще, а для измерений стационарных скоростей не требуется дорогостоящего оборудования. Кроме того, для проведения измерений в стационарной области нужны лишь незначительные количества фермента. Хотя это обстоятельство мон ет обернуться недостатком, если при зтом условия опреде- [c.214]

Это трехпараметрическое уравнение. Такого типа уравнения достаточно часто встречаются в стационарной кинетике ферментативного катализа. Помимо субстратного торможения трехпараметрическое уравнение описывает рН-зависимости ферментативных реакций, активацию и ингибирование ионами металлов и некоторые другие задачи. При определении численных параметров в случае, если параметры и / K s < Л, достаточной степенью [c.103]

Вторая часть книги посвящена кинетическим закономерностям ферментативных реакций. В теоретическом и методическом плане рассматривается ряд подходов как нестационарной, так и стационарной кинетики, наиболее полезных для выяснения механизма действия ферментов и топографии их активных центров. [c.2]

Поскольку на практике соотношения (5.18) соблюдаются довольно часто, стационарная кинетика находит широкое применение при исследовании механизмов ферментативных реакций. [c.174]

Превращение субстрата под действием фермента проходит обычно через ряд короткоживущих промежуточных соединений, изучение реакционной способности которых помогает выяснить механизм ферментативного катализа. К настоящему времени рав работаны такие методы, которые позволяют определять значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативных реакций при изучении кинетики их протекания в стационарном режиме (см. гл. 7). Однако наиболее прямую и надежную информацию о кинетике промежуточных стадий можно получить, изучая ферментативные реакции в нестационарном режиме их протекания (с применением методов изучения быстрых реакций в растворах). [c.186]

В табл. 33 приведены эффективные константы скорости второго порядка каж, найденные из стационарной кинетики ряда ферментативных процессов. Несмотря на большие различия в химическом механизме катализируемых реакций (гидролиз, элиминирование или присоединение воды, окислительно-восстановительные процессы), наблюдаемые константы скорости обнаруживают удивительное однообразие, приближаясь для лучших (наиболее реакционных) субстратов того или другого фермента к одному и тому же пределу порядка 10 —10 Это наво ит на мысль, что скоростьлимитирующая стадия всех этих разнообразных химических механизмов одна и та же. [c.269]

Исследование кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме — один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия ферментов. При исследовании реальных ферментативных систем условие стационарности выполняется лишь приблизительно. Например, если механизм реакции включает несколько промежуточных соединений, то кинетика в строгом смысле не может быть стационарной, т. е. ни в какой момент времени не может быть достигнуто условие г бр = = Грасп- Более детальную информацию о механизме ферментативной реакции с участием ряда промежуточных соединений дает изучение процесса в нестационарном режиме. Именно поэтому в последнее время исследо- [c.108]

Из проведенного анализа следует, что стационарная скорость реакции (6.1) при [S](, [E]q должна гиперболически зависеть от начальной концентрации субстрата и линейно от начальной концентрации фермента. Эти закономерности действительно характеризуют кинетику большинства ферментативных реакций. Дело в том, что уравнение Михаэлиса — Ментен [c.217]

Соответственно из кинетических данных получают в этом случае на один кинетический параметр меньше, чем для реакций с упорядоченным присоединением субстратов. Кинетическая схема (6-37) для ферментативной реакции, протекающей по механизму типа пинг-понг, содержит 12 кинетических констант. Это соответствует минимальному числу стадий, которые необходимо рассмотреть, чтобы описать кинетические свойства фермента, функционирующего согласно механизму типа пинг-понг. Ясно, что из данных стационарной кинетики можно определить только часть этих констант для оценки всех их необходимо использовать другие подходы. [c.22]

Наше рассмотрение ферментативной кинетики до сих пор ограничивалось реакциями, протекающими в стационарных условиях. Несмотря на очень высокие константы скоростей ферментативных реакций, обычно удается измерить скорость реакции, работая при очень низких концентрациях фер- [c.455]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

Выражение для скорости реакции (13.1) имеет вид дробно-рационального выражения, числитель которого содержит 8 слагаемых, а знаменатель — 32 слагаемых. Обработка подобной системы (кстати, далеко не самой сложной для реакций, катализируемых ферментами) по методу стационарных концентраций— довольно трудная задача. Значительное упрощение таких схем может быть достигнуто с помощью теории графов, применение которой к анализу кинетики ферментативных реакций было разработано главным образом в работах М. В. Волькенштейна [1—8], а также в работах Кинга и Альтмана [9—10], Фромма [11], Орси [12], Келети [13]. [c.285]

Дальнейщие подробности, относящиеся к применению теории графов в стационарной и предстационарной кинетике ферментативных реакций, изложены в цитированных выще оригинальных )аботах, в приложении 1 в [33] и в работе Гольдщтейна [115]. 3 кинетике ферментативных процессов метод направленных графов является удобным алгоритмом. Вместе с тем он позволяет выявить глубокую аналогию, существующую между процессами в сложных электронных цепях и ферментативными реакциями. Системы обоих типов работают на сигналах, связанных сходными функциональными зависимостями. В электронных цепях сигналами являются напряжения и токи, в ферментативных реакциях — концентрации и скорости стадий. Аналогом закона Ома служит закон действующих масс. Однако закон Ома требует учета разности напряжений на концах двухполюсников, а закон действующих масс учитывает концентрацию ферментного комплекса (аналог напряжения) лищь на входе двухполюсника (ветви графа). Это отличие определяет неприменимость графических правил, разработанных для электрических цепей, непосредственно к ферментативным реакциям и затрудняет прямое электрическое моделирование реакций [120, 121]. [c.473]

Анализ кинетических схем может быть существенно упрощен за счет применения теории графов. Данный подход был предложен М.В. Волькенщтейном во второй половине 60-х гг. и развит в работах Б.Н. Гольдщтейна, Е. Кинга, К.А. Альтмана, Х.Дж. Фромма и др. В настоящее время разработаны методы теории графов как для анализа стационарной скорости ферментативной реакции, так и для анализа нестационарной кинетики. В настоящей книге ограничимся рассмотрением применением теории графов только для анализа стационарной скорости ферментативной реакции. [c.93]

При изучении кинетики гидролиза п-нитроанилида Ь-ала-нина, катализируемого аминоцептидазой М в стационарном режиме протекания реакции было найдено, что зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет вид 5-образной кривой при малых концентрациях п-нитро-анилида [19]. Предполагая, что фермент в условиях реакции претерпевает обратимую изомеризацию с образованием неактивного конформера (Е, схема 6.27), и исходя из данных табл. 16, определить значения кинетических параметров ферментативной реакции и константу равновесной обратимой изомеризации фермента [c.124]

СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ТРЕХСТАДИИНЫХ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ КОНСТАНТ СКОРОСТЕЙ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СТАДИЙ [c.144]

При изучении начального периода гидролиза /г-нитрофе-нилового эфира триметилуксусной кислоты, катализируемого эластазой (см. рис. 91), было найдено, что разность оптической плотности (АО) между наблюдаемой кинетической кривой и экстраполированным участком прямой, отвечающим стационарному периоду реакции, уменьшается со временем согласно кинетике первого порядка [12]. Было показано, что значение эффективной константы скорости реакции первого порядка зависит от начальной концентрации субстрата (табл. 7). Принимая, что ферментативная реакция протекает по схеме (9.8), определить значения констант кц и кг. [c.194]

Гидролиз метилового эфира N-aцeтил-L-фeнилaлaнинa, катализируемый а-химотрипсином, изучали методом остановленной струи, используя методику вытеснения профлавина из комплекса его с ферментом [6]. Было найдено, что уменьшение оптической плотности раствора при длине волны 465 нм (соответствующей максимуму поглощения комплекса фермент-профлавин) описывается кинетикой первого порядка (табл. 12). Из независимых экспериментов нашли, что константа диссоциации комплекса фермент-профлавин при условиях опыта равна 1 - Ю- М. Значение каталитической константы, найденное в стационарном режиме проведения реакции ферментативного гидролиза, равно 0,03 сек-. Найти значения индивидуальных констант 2, кз и /Сз (схема 9.7) при условии к2 >кз для изучаемой реакции. [c.197]

В целях упрощения обработки кинетики квазиравновесных ферментативных реакций с помощью метода графов, М. В. Воль-кенштейн с сотрудниками разработали так называемый диаграммный метод анализа ферментативной кинетики [5—8]. Согласно данному методу, дальнейшее упрощение анализа графов достигается тем, что для обратимых стадий ферментативного процесса выписываются не константы скорости, а константы равновесия. В этом случае линии, соединяющие вершины графа, называют дугами (аналоги ветвей в графах стационарных реакций). Величина дуги равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакции (по отношению к ориентации дуги). Дуги ориентируются от входа, за который обычно принимают состояние свободного фермента. Наконец, выходом диаграммы называют вершину, из которой получается продукт ферментативной реакции и свободный фермент. В этом случае из выхода ведет не дуга, а ветвь, величина которой равна константе скорости стадии образования продукта. [c.292]

В полиферментных системах, примером которых является цел-люлазная (см. схему 117), установление стационарного состояния по отдельным компонентам обычно происходит в двух совершенно различных временных масштабах. Первым устанавливается стационарное состояние по фермент-субстратным комплексам (на схеме 117 не показано), когда скорости их образования и распада значительно превосходят разницу между этими скоростями (здесь и далее рассматривается кинетика при избытке субстрата по сравнению с концентрациями ферментов в системе). Как правило, данное условие начинает выполняться уже в начальный период реакции (в секундном диапазоне или еще быстрее), когда система в целом еще нестационарна по промежуточным метаболитам. Переход всей полиферментной системы в стационарное состояние, в котором концентрации промежуточных метаболитов практически не меняются во времени (точнее, когда скорости их образования и распада значительно превосходят разницу между этими скоростями), происходит обычно достаточно медленно (нередко стационарное состояние вообще не достигается), для большинства изученных целлюлолитических реакций в реальных условиях в течение нескольких часов [24—26]. Это позволяет считать при анализе предстационарной кинетики полиферментных систем, что стационарное состояние по фермент-субстратным комплексам устанавливается практически мгновенно и что образование и распад промежуточных метаболитов происходит в соответствии с обычным уравнением Михаэлиса — Ментен. Тогда в условиях превраи ения исходного субстрата на небольшую глубину, принимая гомогенное распределение ферментов и субстратов в целлюлазной системе и считая превращения практически необратимыми, кинетику ферментативного гидролиза целлюлозы (см. схему 117) описывает следующая система дифференциальных уравнений [c.125]

Характерной особенностью ферментативной реакции, протекающей <по механизму типа пинг-понг, является то, что в стационарном состоянии часть фермента находится в форме Е, а часть —в форме Е. В идеаль- ом случае форма Е обладает сродством только к А и Р, а форма Е — только к В и Р. Однако во многих реальных ситуациях Р и В проявляют некоторое сродство и к форме Е (а А и Р — к форме Е ). Это легко понять, поскольку продукты и субстраты часто имеют сходную структуру. Таким образом, разумно предположить, что все четыре -реагента будут обладать определенным сродством как к форме Е, так и к форме Е. Иногда способность ферментов, чья кинетика следует механизму типа пинг-понг, образовывать непродуктивные (так называе-Тк1ые абортивные) комплексы, имеет регуляторное значение. Изменим схему (6-37) таким образом, чтобы показать, что продукт Р обычно агретерпевает ряд дальнейших превращений [c.23]