Рентгеноструктурный анализ исследование субстрата

Поразительная специфичность действия ферментов привела к созданию теории замка и ключа, согласно которой для протекания реакции необходимо точное структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. Проведенные эксперименты убедительно доказали адекватность этой идеи, однако сама теория претерпела существенное изменение. Считается, что если фермент — это замок , а субстрат — ключ , то введение ключа в замок часто индуцирует конформационные изменения в молекуле белка. Имеется множество работ, в которых показано, что фермент укладывается вокруг субстрата, обеспечивая более точное соответствие подгоняемых структур. В пользу этого говорят данные по изменению спектров кругового дихроизма, спектров поглощения в УФ-области и констант седиментации, а также результаты исследования структуры комплексов ферментов с ингибиторами методом рентгеноструктурного анализа. Как мы уже видели ранее (гл. 4, разд. Д, I), идея индуцированного соответствия оказывается весьма плодотворной и при обсуждении взаимодействий субъединиц. [c.42]

В предыдущих разделах были кратко рассмотрены причины значительно более поверхностного описания деталей стереохимии при рентгеноструктурном анализе белков по сравнению с описанием малых низкомолекулярных соединений. Однако для успешного исследования зависимости между структурой и активностью требуется более высокая точность структурных данных. Поскольку мы стремимся к более глубокому пониманию поведения активного центра или функциональных областей этих биологических макромолекул, необходимо повысить разрешающую способность дифракционных методов. Малые изменения конфигурации аминокислотных остатков в области центра связывания металла и изменения стереохимии комплексов металла в ходе каталитического процесса должны быть тщательно изучены, в особенности при исследовании ферментов, требующих участия иона металла. Как указывалось в разд. 1.2.1, описание этих структурных изменений позволяет определить стереохимическую природу электронных перестроек, происходящих при взаимодействии молекул субстрата и фермента и ответственных за каталитическое действие. [c.24]

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

Каталитическую активность а-химотрипсина нельзя приписать исключительно наличию системы переноса зарядов. Из рентгено структурных исследований следуют многие другие факторы, от ветственные за каталитический процесс. Было обнаружено де вять видов специфических ферментсубстратных взаимодействий которые повышают эффективность а-химотрипсина. Например стабилизация тетраэдрического интермедиата, а следовательно понижение энергетического барьера переходного состояния, со провождается образованием водородной связи между карбониль ной группой субстрата и амидным атомом Ser-195 и Gly-193 В химотрипсиногене эта водородная связь отсутствует. Действи тельно, уточнение структур химотрипсиногена и а-химотрипсина с помощью рентгеноструктурного анализа показывает различия в расположении каталитической триады в зимогене и ферменте. Это конформационное изменение в общей трехмерной структуре фермента, возможно, вызывает значительные изменения химических свойств каталитического центра, что может играть важную роль в увеличении ферментативной активности при активации зимогена. [c.221]

На основе рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением проведено сравнение стереохимических свойств трех типов взаимодействий металл—белок. Для установления структурных и электронных факторов, ответственных за регуляцию активности иона металла, рассмотрены координационные центры металл — лиганд в белках и прослежена связь между молекулярной структурой, стереохимией и электронной структурой и биологической ролью функции иона металла. Гидро( бное взаимодействие порфиринового кольца гемоглобина и миоглобина рассмотрено по данным измерений магнитной восприимчивости, спектроскопии парамагнитного резонанса и исследования поляризационных спектров поглощения монокристаллов. С точки зрения электронной конфигурации (1-орбиталей и геометрии координации обсуждается взаимодействие замещенных ионов металлов в карбоксипептидазе А с карбонильной группой субстратов при гидролизе пептидов. Предполагается, что спектральные изменения, зависящие от pH и наблюдаемые в спектре электронного поглощения, замещенного иона Со(П), каталитически активного в карбоангидразе, обусловлены образованием упорядоченной структуры растворителя вблизи иона Со(И), Корреляция между молекулярной структурой, определенной методами рентгеноструктурного анализа, и электронной структурой координационного центра металл — лиганды, оцененной из спектроскопических данных, указывает на происхождение структурной регуляции реакционной способности иона металла в белках и ферментах. [c.123]

В отношении акцепторного субстрата реакции некоторые сведения могло бы дать изучение пуромицина и его аналогов. Так, известна конформация пуромицина в кристалле, определенная рентгеноструктурным анализом (рис. 104). Она подтверждается исследованиями пуромицина в растворе. Так как пуромицин — хороший акцепторный субстрат в реакции транспептидации, знание его структуры может навести на некоторые суждения о стереохимии аминоацильного и аденозинЬвого остатков в пептидилтрансферазном центре. Далее, известно, что аналог с более фиксированной конформацией, типа изображенного на рис. 105, тоже может служить в качестве акцепторного субстрата в реакции транспептидации, и даже более активен, чем пуромицин. Здесь фиксирована ориентация пуринового кольца относительно рибозы (так называемая анти -ориентация), и это позволяет думать, что именно она [c.191]

Следует тем не менее подчеркнуть, что структура кристаллической решетки играет определенную роль, нанример, в эффекте связывания лизоцимом ионов металлов. Так, после вымачивания тетрагонального лизоцима в растворе Gd (III) в течение 20 часов степень заполнения активного центра ионами металлов составляла 24—38%, а в случае триклинного лизоцима эта величина составила 1,6—3,6% после вымачивания в течение 4 недель [33]. Это говорит о различной межмолекулярной упаковке белков в двух данных полиморфных формах кристаллического лизоцима. Тем не менее результаты исследования методами ЯМР [46] и рентгеноструктурными методами [2] в целом показали, что кон- формация лизоцима и ориентация функциональных групп его активного центра весьма близки (если не идентичны) в растворе и кристалле [46]. В цитируемой работе [46], однако, ие обсуждается, что рентгеноструктурный анализ был выполнен при низких или комнатных температурах, а изучение ЯМР — ири 54° С [46]. Иначе говоря, эти исследования выполняли по разные стороны от температуры конформационного перехода фермента (25—30° С 47—54]) и, следовательно, с различными конформациями лизоцима, которые заметно различаются по эффективности связывания фрагментов субстрата и, возможно, по конформации активного центра. Вопрос этот остается пока открытым в литературе, но требует более критического анализа при сопоставлении экспериментальных данных, полученных при различных условиях (в особенности, данных по изучению структуры фермента в растворе и кристаллическом состоянии). [c.158]

Третья причина развития теоретической энзимологии за последние десятилетия главным образом в терминологическом и популяризационном планах связана с рядом ограничений самого рентгеноструктурного анализа. Во-первых, несмотря на уникальность и ценность этого метода как практически единственного источника информации о трехмерных структурах белков, получаемые им результаты касаются только статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечают на вопрос о динамических конформационных и электронных характеристиках активной конформации, что представляет первостепенный интерес в изучении биокаталитического процесса. Выявление потенциальных возможностей объектов исследования и предсказание их поведения - прерогатива теоретического подхода. Во-вторых, рентгеновский метод позволяет расшифровать трехмерные структуры комплексов ферментов, но комплексов не с субстратами, а с ингибиторами. Могут быть получены структурные данные о целой серии ингибиторных комплексов одного фермента, которые в той или иной мере (но всегда неявной) соответствуют химическим элементарным стадиям каталитического акта. Однако в таком наборе все ингибиторы отличаются по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не зная продуктивной ориентации субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими конформационных перестроек и имея дело со сложной системой, трудно составить полное и объективное представление о причинах спонтанного протекания каталитической реакции. Предпринимаемые здесь попытки представляют собой стремление воссоздать механизм каталитического акта, располагая структурными данными, одна часть которых отвечает реальному, исходному состоянию фермента, а другая, большая часть, фермент-ингибиторным комплексам, которые в чем-то (в чем именно, неизвестно) отличаются от промежуточных продуктивных комплексов истинного многостадийного процесса. [c.106]

Важно также быть уверенным в том, что трехмерная структура, определенная для кристалла, сильно не отличается от структуры фермента в растворе. Два типа данных показывают, что это именно так. Кристалл белка содержит большое количество кристаллизационной воды, и в некоторых случаях субстраты могут диффундировать через кристалл, нормально реагируя по мере диффузии. Аналогичным образом прямые структурные исследования белков в растворе методом ЯМР показывают там, где сравнение возможно (например, в случае лизоцима [48]), близкое соответствие структуре, полученной методом рентгеноструктурного анализа. [c.485]

Для каждого класса субстратов (3, 5 -динуклеотид, 2, 3 циклофосфат, 3 -нуклеотид) реакция включает бимолекулярную стадию образования первичного комплекса (стадии 1,1 , 1 "), за которой следует его изомеризация (стадии 2,2, 2"). Кроме того, исследование свободного фермента показало, что фермент существует в двух конформациях (стадия 3). Эти кинетические результаты были сопоставлены с данными рентгеноструктурного анализа, что позволило постулировать детальный механизм действия фермента. [c.185]

Для получения синтетических пептидных аналогов наиболее короткого фрагмента нуклеазы-Т с целью выяснения природы боковых цепей аминокислот, необходимых для связывания, был проведен синтез пептидов [303] в твердой фазе [304, 305]. Эти исследования опирались на тот факт, что синтетический фрагмент нуклеазы-Т-(6—47) при смешении с нуклеазой-Т-(48, 49—150) образует активный комплекс. Строгие стереохимические требования к связыванию катиона, необходимые для присоединения и гидролиза субстрата, могут быть определены из совокупности результатов рентгеноструктурного анализа [33] и результатов, по- [c.117]

В последние годы наблюдается новый подъем в развитии химии комплексных соединений. Существенную роль в пробуждении интереса к области комплексных соединений, несомненно, сыграл прогреве физических методов исследования, в частности ИК-, ПМР- и ЭПР-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и особенно то исключительно важное практическое значение, которое приобрело комплексообразование как своеобразный метод активации простых молекул, функционирующих в качестве лигандов. Комплексообразование позволяет также осуществить перенос металла из одного участка биологического субстрата в другой или вывести из организма металл, обладающий токсическими свойствами [1]. Во все возрастающем темпе развивается новая ветвь органической химии, основанная па модификации органической молекулы путем координации с металлом, и внимание исследователей концентрируется вокруг органической части комплекса между тем ранее их интересы почти исключительно были направлены на изучение свойств координированного иона металла. Ряд относящихся сюда вопросов рассмотрен в обзорах и монографиях [2—7]. [c.155]

Какова структура активных центров Благодаря кристаллографическим исследованиям мы можем неиосредственно увидеть , как устроено все большее и большее их число. Однако рентгеноструктурный анализ обычно не позволяет получить четкого представления о конформацион-ных изменениях, обеспечиваюш их индуцированное соответствие. Кроме того, кристаллографические исследования с высоким разрешением проведены лишь для относительно небольшого числа ферментов. Поэтому для выяснения структуры активного центра энзимологи продолжают широко использовать традиционные химические методы картирования , измеряя константы связывания ингибиторов, структуру которых последовательно изменяют, и исследуя, как влияют изменения структуры субстратов на связывание и скорость реакции. Хорошим примером исследования такого рода может служить работа Мейстера (Meister) и его сотрудников, исследовавших глутаминсинтетазу из мозга овцы. Субстратами фермента являются как D- и L-глутаминовая кислоты, так и а-аминоадипиновая кислота. В то же время из десяти монометильных производных D- и L-глутаминовой кислот субстратами глутаминсинте-тазы могут служить только три. Если допустить, что субстраты связываются в полностью вытянутой конформации, то все атомы водорода, замена которых не приводит к исчезновению активности, лежат с одной стороны остова молекулы (за плоскостью рисунка на следующих двух схемах) [c.43]

Успехи, достигнутые в области рентгеноструктурного анализа, кинетики переходных процессов и химического катализа за последние 20 лет, в корне изменили наши представления о ферментативном катализе и механизме действия ферментов. Данная монография представляет собой краткий обзор последних достижений в этой сфере и адресована студентам и аспирантам, уже прослушавшим соответствующие курсы по химии и биохимии. В книге в теоретическом и методологическом аспектах рассматриваются два вопроса природа взаимодействия между ферментом и его субстратами, обусловливающего ферментативный катализ и специфичность действия фермента, и взаимосвязь между структурой фермента и механизмом ферментативного процесса. Обсуждаются экспериментальные подходы, позволяющие проводить прямые исследования ферментов на молекулярном уровне. Большое внимание уделяется, например, исследованию ферментативных реакций в предстационарных условиях, когда ферменты используются в концентрациях, сопоставимых с концентрациями субстратов, и можно непосредственно наблюдать за промежуточными фермент-содержащими соединениями. Кратко освещены проблемы взаимодействия ферментов с несколькими субстратами в стационарных условиях, а также некоторые вопросы химии коферментов и кофакторов. [c.9]

Например, рентгеноструктурный анализ превратился в жизненно важный инструмент при исследовании специфических механизмов действия лекарственных средств. Изучение строения субстратов, ингибиторов и антибиотиков дает информацию об особенностях геометрии рецептора, на котором связывается препарат. Это первый шаг при создании новых лекарственных средств. Примером может служить недавно проведенное определение способа связывания лекарственного препарата триостина А с фрагментом ДНК. [c.231]

Такой субстрат бьш найден для лизоцима, гидролизующего определенные связи в цепях бактериальных полисахаридов. На рис. 1 показана (в масштабе) предполагаемая структура нормального фермент-субстратного комплекса для лизоцима. Это изображение бьшо получено. на основе данных рентгеноструктурного анализа кристаллического комплекса лизоцима и ложного , т. е. негидролизуемого, субстрата, представляющего собой аналог обьиного субстрата лизоцима. Эти исследования бьши проведены Дэвидом К. Филлипсом и его сотрудника- [c.250]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

Дальнейшее продвижение системы по координате реакции невозможно без отрыва протона. Однако в системе создаются все предпосылки для акцептирования протона подходящим основашем, поскольку состояние атакующей группы близко к таковому у оксоний-катиона. Интересно -отметить, что по данным рентгеноструктурного анализа комплекса трипсина и панкреатического трипсинового ингибитора [3044] расстояние мевду сериновым гидроксилом и карбонильным углеродом остатка IiysIS также больше длины ковалентной связи. Более того, расстояние мевду ОТ -атомом и К -атомом Hls57 в комплексе фермента с "пирами-дализованным" субстратом, как показывают исследования комплексов трипсина и химотрипсина с белковыми ингибиторами [3044], становится достаточно близким для образования хорошей водородной связи, что обеспечивает дальнейший перенос протона на имидазольный остаток. [c.321]

Лизоцим в зависимости от условий кристаллизуется с образованием ряда полиморфных форм — тетрагональной, триклииной, моноклинной, орторомбической [29, 30]. Наиболее известна тетрагональная структура, с использованием которой и было получено большинство рентгеноструктурных данных. По мнению самого Филлипса [5], тетрагональная структура кристаллического лизоцима имеет один серьезный недостаток — молекулы фермента в ней подходят друг к другу особенно плотно и взаимодействуют в области участков Е и Р активного центра, что не позволяет наблюдать связывание сахаров с данными участками без разрушения кристаллов. Это, видимо, стимулировало изучение других кристаллических форм лизоцима [29—31], хотя и без особого успеха в выявлении новых деталей строения активного центра и механизма его действия. Более того, выяснилось, что триклигшый лизоцим еще менее пригоден в данном отношении для исследований, поскольку у него в кристаллической ячейке взаимно блокированы три участка активного центра — О, Е и Е [32, 33]. По предварительным данным, моноклинная и орторомбическая формы кристаллического лизоцима страдают тем же недостатком [34, 34а]. В настоян ее время надежды возлагаются на лизоцимы из других источников, такие как лизоцим из белка яиц черепахи [34], четвертичная структура которого практически идентична лизоциму из белка куриных яиц, но кристаллы содержат аномально большое количество воды. Возможно, и этом случае активный центр фермента будет более доступен для аналогов субстрата и эффекторов и соответствующий рснгеноструктурный анализ приведет к более определенным выводам о топографии связывающих участков активного центра. [c.154]

Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза ЕсоКЧ наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319]. [c.442]

Чтобы на основании всего сказанного не создалось впечатления, будто коферменты представляют собой особый род субстратов, отличающийся от остальных какими-то иными свойствами помимо того, что они крайне удобны для изучения фермент-субстратных комплексов, следует отметить, что имеются также и другие убедительные примеры образования этих промежуточных продуктов. Например, сопоставление данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2—3 А для карбокси-пептидазы А и ее комплекса с глицил-Ь-тирозином [38] показывает не только истинное расположение связанного пептида в гидрофобном кармане фермента, но и такие тонкие детали, как сдвиг остатка тирозина на 14 А по направлению к субстрату при образовании комплекса. Впечатляющим примером подобного исследования является рентгеноструктурный анализ лизоци-ма [39], коррелирующий с результатами изучения механизма его действия [40]. Здесь, как и в случае карбокси-пептидазы, структура свободного фермента и его комплекса исследована очень детально. [c.62]

В молекуле лизоцима 129 аминокислот, расположенных отчасти по типу а-спирали, а главным образом так, что получается вытянутая и сложенная в петлю нить, форма которой поддерживается дисульфидными и водородными связями. Лизоцим расщепляет полисахарид, входящий в состав клеточной стенки бактерии, вызывая его гидролиз и последующее разрушение стенки. Норт, Филиппе и Блэйк, применив рентгеноструктурный анализ кристаллов лизоцима и затратив много усилий на расшифровку сложных рентгенограмм, пришли к выводу, что в процессе катализа молекула полисахарида попадает в своеобразную щель в молекуле белка-фермента и внутри щели, подвергаясь действию специфически расположенных участков молекулы фермента, распадается. В этом случае точная геометрическая настройка фермента на субстрат играет решающую роль. Исследование структуры было проведено с кристаллами лизоцима, но его каталитические свойства не испытывают при кристаллизации существенных изменений. [c.164]

Наиболее обширную информацию о фермент-субстратных взаимодействиях получают при исследовании кристаллических ферментов и их комплексов с ингибиторами и субстратами методом рентгеноструктурного анализа. Найденные этим способом координаты атомов фермента и субстрата затем оптимизируются путем минимизации энергетических потенциалов, задаваемых суммой атом-атомных взаимодействий (см. гл. VIII-IX). Построенные в результате энергетические карты (см. 1, гл. IX) фермент-субстратных комплексов позволяют сравнивать конформации отдельных фрагментов белка и аминокислотных остатков в связанном и свободном состояниях. В настоящее время насчитывается сравнительно небольшое число таких исследований. [c.422]

На основании данных, полученных с помощью рентгеноструктурного анализа и при исследовании свойств РНазы в растворе, предложено несколько схем механизма действия этого фермента одна из них приведена на рис. 9.10. Данная схема не может считаться однозначно доказанной однако ясно, что в случае катализа РНазой увеличение скорости реакции обусловлено специфическим связыванием различных групп субстрата соответствующими участками активного центра и, вероятно, согласованным действием His-12 и His-119, осуществляющим общий кислотно-основной катализ. [c.313]

Вторичная структура ДНК играет важную роль в узнавании ферментами субстрата. Исследования коротких ДНК-дуплексов, содержащих участки узнавания ряда рестриктаз, методами ЯМР [333] и рентгеноструктурного анализа [137, 386] показали, что конформационные параметры отдельных нуклеотидных звеньев варьируют от значений, характерных для В-формы до значений, присущих А-форме двойной спирали. Известно, что некоторые ферменты взаимодействуют с ДНК в различных формах. Например, рестриктазы BssH II и BamH I не расщепляют субстраты в Z-форме [67]. [c.92]

Гексокиназа индуцированное соответствие. Имеются веские данные в пользу того, что в гексокиназе дрожжей, которая фосфорилирует глюкозу с участием концевого фосфата молекулы АТР, достигается индуцированное соответствие между ферментом и субстратом. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, связывание как сахара, так и нуклеотида вызывает существенные изменения в третичной структуре фермента. Кроме того, присоединение нуклеотида к одной из форм фермента облегчается связыванием сахара [24, 25]. Эти результаты согласуются с результатами более ранних исследований АТРазной активности этого фермента в растворе в отсутствие глюкозы. Гексокиназа фосфорилирует глюкозу в положении 6 с Утах = 800 мкмоль-мин- на 1 мг белка и/См для АТР 0,1 мМ. В отсутствие глюкозы АТР гидролизуется с Утах = = 0,02 мкмоль-мин- на 1 мг белка и /См = 4,0мМ. Добавление ликсозы, которая не может фосфорилироваться вследствие утраты оксиметильной группы в положении 6, приводит к увеличению Утах ДЛЯ реакции с участием АТРазы в 18 раз при этом величина /См для АТР уменьшается в 40 раз, т. е. до значения /См, характерного дая фосфорилирования глюкозы [26, 27]. Ксилоза вызывает изменения в кристаллической структуре фермента, аналогичные изменениям, индуцируемым глюкозой (рис. 10.10). [c.319]

Фактический материал по каталитическим свойствам амидгидролаз (кинетика, спеодфичность, рН-зависимость и т.п.) собран в двух последующих главах. Эти данные вместе с результатами кристаллографических исследований являются основой для понимания собственно каталитического акта. Здесь целесообразно сначала проанализировать структуру фермент-субстратных комплексов и лишь затем - собственно акт химического расщепления связи. Первый этап такого анализа в настоящее время основывается на сравнительно немногочисленных данных рентгеноструктурного исследования комплексов ферментов с ингибиторами или очень медленно расщепляемыми субстратами (квазисубстратами). Экстраполяция этих данных на истинные фермент-субстратные комплексы требует известной осторожности, однако без этого любые выводы а механизме реакции будут не более чем гипотезами. [c.8]