Белки аминокислотный анализ

Аминокислотный анализ существенно способствовал бурному развитию химин белка. Главными областями применения аминокислотного анализа (наряду с идентификацией отдельных аминокислот) являются установление аминокислотного состава белковых гидролизатов, определение первичной структуры белков, а также аналитический контроль пептидного синтеза. [c.55]

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Методическое руководство по биохимии и иммунохимии белка. Рассмотрены теоретические основы методов и современная аппаратура для гель-фильтрации, бумажной, ионнообменной н тонкослойной хроматографии, в том числе методы количественного аминокислотного анализа с помощью автоматических анализаторов. Подробно описан анализ производных аминокислот методом газовой хроматографии. Книга хорошо иллюстрирована и снабжена подробной библиографией. [c.4]

Очистка и разделение белков (наряду с аминокислотным анализом) — основные области применения ионообменной хроматографии. Верно и обратное — в очистке любого белка этот вид хроматографии почти всегда занимает центральное положение. Поэтому при изложении общих соображений о выборе параметров хроматографического процесса в предыдущих разделах этой главы мы имели в виду прежде всего хроматографию белков. Был приведен соответствующий справочный и методический материал, отмечены аспекты, связанные с сохранением биологической активности и возможностью появления артефактов кажущейся утраты ферментативной активности и [c.301]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

При исследовании субстратов с длинной цепью [149] было установлено, что некоторые нативные белки устойчивы к действию фермента, в то время как белок с развернутыми цепями, а также окисленный или денатурированный белок легко гидролизуется. Например, цинковый комплекс инсулина почти не расщепляется ферментом, но удаление цинка облегчает ступенчатый гидролиз. В этом случае гидролиз не затрагивает дисульфидных мостиков. Разделенные цепи А и Б окисленного инсулина легко гидролизуются. Аминокислотный анализ свидетельствует о гидролизе всех связей в цепи- А, в то время как более медленный гидролиз цепи Б позволил установить последовательность первых шести остатков в этой цепи. [c.236]

Аминокислотный анализ белков 259 [c.7]

АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ [c.259]

Яркие примеры мутированных белков человека — разнообразные гемоглобины, встречающиеся при заболеваниях крови. Изменения одного аминокислотного звена гемоглобина из 287 оказывается достаточно, чтобы вызвать тяжелейшие недуги вследствие нарушения функции этого белка. Химич. анализ белковой цени позволяет изучить материальную природу каждой конкретной мутации, т. е. понять, какая замена аминокислоты и в каком месте белковой молекулы вызвала нарушение функции. Зная генетич. код, можно легко выяснить, какое изменение претерпел соответствующий кодон. Чаще всего модифицируется лишь одно нуклеотидное звено ДНК. [c.194]

Приблизительно столько же испытаний необходимо провести при селекции растений для отбора одного нового вида с повышенным содержанием белка или более высоким содержанием Лиз и Мет. В клинической практике также имеется область, где анализ аминокислот используется в массовых обследованиях для выявления нарушений аминокислотного метаболизма у новорожденных. Во многих странах такое обследование уже введено в обязательном порядке, правда, с применением микробиологических методов, поскольку исследование огромного числа образцов другими методами аминокислотного анализа реально не выполнимо. [c.243]

Полные аминокислотные последовательности белков Л, С и Т были получены иэ анализа соответствующих генов. Первичная структура четвертого белка реакционного центра, т. е. цитохрома с, пока не установлена. Субъединицы Л, С и Т содержат 273, 323 и 258 аминокислотных остатков соответственно. Важной структурной особенностью является наличие в каждой из легких и средних субъединиц по пяти, а в тяжелой — одного спирализованного участка. Эти участки состоят а основном из 24—30 гидрофобных аминокислот и прерываются короткими гидрофильными фрагментами. Такое построение полипептидных цепей является характерным для мембранных белков. Молекула цитохрома с, входящая а состав реакционного центра, согласно данным аминокислотного анализа содержит 323 аминокислотных остатка и носит ярко выраженный гидрофильный характер. Белок содержит 4 характерных участка связывания гема, последовательность которых аналогична последовательности соответствующих участков других цитохромов с. [c.635]

Основной упор в данной главе будет сделан на синтезе и химических реакциях аминокислот и их простых производных [но не пептидов и белков, которые рассмотрены в томе 10 (русского издания), части 23 и 24]. Кроме того, мы не будем рассматривать здесь несколько важных разделов, интересующих химиков, а именно технику тонкослойной хроматографии [6], практику автоматического аминокислотного анализа [7], химические последствия облучения аминокислот и их растворов [8], метаболические и исторические аспекты [10—12] и аминокислоты как антиметаболиты 13—14]. Более того, мы сконцентрируем внимание на алифатических аминокислотах, хотя и добавлен короткий обзор об ароматических аминокислотах. [c.233]

Ионообменная хроматография на колонках применяется в трех очень важных областях 1) для качественного и количественного аминокислотного анализа пептидов и белков, дающего ценную характеристику молекул его можно использовать Как средство обнаружения некоторых специфических различий среди белков 2) для определения аминокислотного состава биологических жидкостей, который дает не только существенную информацию о наличии свободных аминокислот, но и позволяет проследить за изменениями, происходящими в организме под воздействием многих факторов, таких, как окружающая среда, физиологическое состояние и генетическая конституция 3) для определения первичной структуры белков — чрезвычайно важной задачи биохимии сегодняшнего дня. Многие исследователи занимаются определением аминокислотной последовательности большого числа разнообразных белков. Это дает возможность установить их химическую структуру и изучить ее взаимосвязь с функцией. [c.8]

Точное определение аминокислотного состава белков весьма существенно для их идентификации и для понимания их структуры. Аминокислотный анализ включает две главные стадии гидролиз белка до аминокислот и количественное определение продуктов гидролиза. [c.56]

Данные химического анализа. Для обнаружения примесей в препаратах белка можно использовать данные по аминокислотному составу. Допустим, например, что аминокислотный анализ обнаруживает присутствие 0,3 моль гистидина на 1 моль белка. Естественно предположить, что гистидин содержится в загрязняющем веществе, а не в белке, подвергающемся очистке. [c.83]

Наконец, по возрастанию поглощения света в области 295 ммк, сопутствующему ионизации фенольных групп, было определено число остатков тирозина, которое оказалось равным 6, При pH 7,5 происходит изменение конформации макромолекулы, и две карбоксильные группы, скрытые до того внутри глобулы, становятся обратимо титруемыми. Всего в р-лактоглобулине найдено 53 карбоксильные группы. Таким образом, методом титрования могут быть изучены некоторые структурные особенности и переходы в белке. При рН>9,7 белок необратимо денатурирует. При низких значениях pH он диссоциирует на две субъединицы с молекулярным весом около 18 000 каждая. Результаты титрования согласуются с данными аминокислотного анализа белка, проведенного с помощью стандартных методов, с точностью до одного аминокислотного остатка. [c.115]

В настоящее время метод газо-хроматографического разделения и анализа аминокислот не представляет еще законченного и универсального способа аминокислотного анализа белковых гидролизатов. Разработанные методики конверсии аминокислот в летучие производные, особенно количественной конверсии в К-ТФА-метиловые, и в значительной степени их успешное разделение на колонках с низким содержанием полиэфирных полярных стационарных фаз позволяют уже сейчас в ряде случаев использовать метод газо-жидкостной хроматографии для определения абсолютных количеств аминокислот в смесях. Но требуется дальнейшая доработка метода, и в особенности его аппаратурного оформления, прежде чем он займет должное место при изучении аминокислотного состава белков. [c.267]

Утверждая, что результаты аминокислотного анализа являются неутешительными , Бейли [70] отразил точку зрения большинства исследователей, занимающихся анализом белков. Аминокислотный анализ представляет собой необходимую предварительную стадию всякого всестороннего исследования структуры и функции белков. Однако подобно другим аналитическим исследованиям аминокислотный анализ оказывается полезным только в сочетании с результатами других исследований. Химики, занимающиеся изучением белков, со времени Риттхаузена [68] (1872 г.) до Викери [69] (1946 г.) придерживались довольно естественной точки зрения о том, что знание аминокислотного состава даст возможность объяснить свойства белка, так как последние должны быть интегральной функцией входящих в их состав аминокислот. В настоящее время признано, что свойства боковых цепей белка не являются простыми функциями свойств свободных аминокислот, а представляют собой в действительности весьма сложные функции, зависящие от многих факторов, в частности от относительного расположения боковых цепей в главной пептидной цепи и в свернутой молекуле натив-ного белка. [c.243]

Многих из затруднений можно предусмотрительно избежать. Так, до проведения гидролиза остатки метионинсульфоксида могут быть восстановлены до метионина обработкой белка 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитом в денатурирующих условиях. Следует иметь в виду, что метиопинсульфоксид не обнаруживается в белке аминокислотным анализом, поскольку в условиях кислотного гидролиза восстанавливается до метионина, однако он может быть определен непрямыми методами [63]. Смесь пептидов с С-концевыми остатками гомосерина и гомосеринлактона может быть превращена в любую из этих форм [2, 45]. [c.348]

Определение аминокислот всегда представляло исключительно важную задачу биохимии ввиду того, что эти соединения играют роль кирпичиков при построении пептидов и белков. Широко применяемый, основанный на ионной хроматографии и теперь уже ставший классическим метод Мура и Штейна [1] не позволяет провести различие между энантиомерами. Между тем в хиральном аминокислотном анализе ощущается явная потребность так, например, в пептидном синтезе решающее значение может иметь оптическая чистота исходного материала, а результаты стереохимического анализа могут искажаться из-за рацемизации. Другой областью применения дгырдльного аминокислотного анализа является определение строения многих микробиологических продуктов, таких как полипептидные антибиотики, в состав которых входят о-аминокислоты, не обнаруженные у млекопитающих [2]. [c.173]

Еще одной важной проблемой в стереохимии природных соединений является установление строения полипептидных антибиотиков, продуцируемых бактериями и грибами. Такие полипептиды часто содержат в своей структуре неприродные аминокислоты, т. е. имеющие в-конфигурацию или обладающие структурой, не обнаруженной в белках. Очистка и установление структуры таких сложных соединений, часто вьщеляемых в очень небольших количествах, требует квалифицированного разделения и точных аналитических методов. В этом отнощении исключительно важным является непосредственное определение конфигурации аминокислот методом хиральной хроматографии. Особенно большое значение имеет применение хиральной ГХ для хирального аминокислотного анализа и создания аминокислотных карт гидролизатов. Приведенный ниже пример [24] должен проиллюстрировать сказанное. [c.182]

Впрочем, описан вариант и кратковременного гидролиза в течение 20 мин при температуре 155° [Наге, 19771. Недавно были представлены данные о целесообразности проведения гидролиза белка 6 н. НС1 в течение 4 ч при 145°. Авторы сопоставили результаты аминокислотного анализа не только чистых белков, но и различных кормов с высоким содержанием углеводов при использовании такого режима и традиционным методом (110° 24 ч) результаты оказались примерно одинаковыми. При 145° освобождается несколько больше Val, а содержание Asp и Ser получается слегка заниженным по сравнению с гидролизом при 110°. Интерполяцией к нулевому времени гидролиза это можно учесть [Lu as, Sotelo, 1982]. [c.526]

Сульфгидрильным группам миозина принадлежит важная роль в ферментативном катализе, а также в образовании актомиозинового комплекса. По данным аминокислотного анализа, в миозине содержится 15—17 моль SH-rpynn на каждые 200 000 г белка (молекулярную массу миозина в настоящее время считают равной 500 000 Да). В препаратах миозина методами титрования обычно определяется 10— [c.159]

Не будет преувеличением сказать, что уровень исследования БПТИ во многом отражает сегодняшние экспериментальные и теоретические воз. можности естествознания в изучении белковых молекул. В частности, особенно важным оказалось то, что изучение механизма свертывания и развертывания полипептидной цепи БПТИ, предпринятое Т.Крейтоном [7] безусловно, опережает все аналогичные работы по денатурации других белков. Аминокислотная последовательность БПТИ из 58 аминокислотных остатков была установлена Б. Касселем и М. Ласковским [8]. Трехмерная структура БПТИ с разрешением 1,9 А получена Р. Хубером и соавт. [9] и уточнена до 1,5 А Дж. Дайзенхофером и У. Стейгеманном [10]. Белок включает шесть остатков ys, которые образуют три дисульфидные связи ys - ys , Су5 -Су5 и ys °- ys . Конформационный анализ БПТИ [И], результаты которого рассматриваются в этой главе, проводился для линейной последовательности белка, так как априорный расчет должен автоматически привести к сближенности соответствующие остатки ys в наиболее предпочтительной конформации. [c.428]

Для определения локализации дисульфидных связей белок подвергают частичному гидролизу на относительно малые фрагменты с помощью протеиназы низкой специфичности, такой как пепсин, в условиях, при которых протекает минимум обменных реакций. Пептиды разделяют и определяют их аминокисло гный состав для того, чтобы убедиться в том, что они гомогенны и содержат одну дисульфидную связь. Дисульфидная связь в каждом пептиде разрывается (см. разд. 23.3.3) и образуются два фрагмента. Если первичная структура белка известна, то достаточно аминокислотного анализа и частичного определения Л/-концевой последовательности в двух фрагментах для того, чтобы определить ту часть цепи (ей), из которой образовался каждый фрагмент. [c.280]

Эта реакция была использована для частичной модификации карбоксильных групп в белках [46, 146, 147]. Хоар и Кошланд [146] использовали 1-бензил-3[3-диметиламино-(М)-пропил]-кар-бодиимид в виде /г-толуолсульфоната, Хориниши с сотр. [147] применяли 1 -этил-3[3-морфолино-(4)-пропил]-карбодиимид ЭМП К. В качестве аминного компонента обе группы исследователей использовали метиловый эфир глицина. Степень модификации определяют потенциометрическим титрованием или аминокислотным анализом. При модификации лизоцима в присутствии указанных реагентов конденсация идет соответственно по 8 и 6 карбоксильным группам (из 11). В присутствии реагента, предложенного Хориниши, модификация идет по 1 из 2 карбоксилов бацитрацина и по 3 и 6 карбоксилов инсулина. [c.365]

Прямое участие витамина К в биосинтезе биологически активного протромбина продемонстрировано [6] посредством измерения включения в белок С-бикарбоната. Опыты проводились на фракциях печени крыс, дефицитных по витамину К. Все инкубации проводились в присутствии циклогексимида в целях ингибирования биосинтеза белка de novo. Включение изотопа существенно возрастало в присутствии добавленного витамина К. Более того, наличие нормального протромбина в инкубационной смеси было продемонстрировано посредством активации фактором Ха, фактором V, фосфолипидом и ионами Са +. В процессе кислотного гидролиза С-меченного протромбина элиминировалось 50 % радиоактивности, а аминокислотный анализ показал, что остаток радиоактивности входил в состав глутаминовой кислоты, что доказывало участие витамина К во включении бикарбоната в остатки 7-карбоксиглутаминовой кислоты. Наконец, показано [7], [c.547]

Уже давно высказывалось мнение, что первичная структура белка — аминокислотный состав —определяет его пространственную структуру 170, 171]. Поскольку за последние несколько лет структура двух белков — лизоцима и миогло-б ина — стала известна детально, а еще для трех-четырех белков рентгеноструктурный анализ дал достаточное разрешение для того, чтобы увидеть основные черты вторичной и [c.151]

Были также разработаны ультрамикрометоды, основанные на сочетании двойного изотопного разбавления, бумажной хроматографии и электрофореза [193]. В настоящее время для полного аминокислотного анализа требуется только 2 мкг белка. Первоначально аминокислоты метили с помощью и содержащихся в г-иодфенилсульфонилхлориде, получая при этом их шипсильные производные [94]. Однако в дальнейшем оказалось более удобным получать изотопы с более длинным периодом полураспада для этого аминокислоты ацетилировали уксусным ангидридом, содержащим тритий и [193]. [c.402]

Молекулярный вес этих соединений очень велик. Вирус табачной мозаики, выделенный в кристаллическом состоянии [166], представляет собой нуклеопротеид с молекулярным весом порядка 40 млн. Палочконодобная молекула вируса имеет ядро из нуклеиновой кислоты, окруженное белковой оболочкой, которая может быть отделена. Первоначально с помощью физических методов определили, что молекулярный вес этого белка равен 100 ООО. Однако молекулярный вес, вычисленный на основании аминокислотного анализа, равен 17 ООО—18 ООО. В литературе имеется обзор, посвященный работам по структурному составу этого вируса [58]. [c.417]

При определении лейцинаминопептндазы и трипсина, ковалентно связанных с сефарозой, Кельш и др. [41] сопоставили пять методов определения связанных белков 1) основанный на балансе белка перед и после связывания 2) аминокислотный анализ после кислотного гидролиза 3) модифицированный метод Лоури 4) спектрофотометрический и 5) флуориметрический. Преимущество двух последних методов, которые они исследовали детально, состоит в том, что эти методы не приводят к разрушению геля. Как и метод Лоури, они характеризуются простотой, низким пределом обнаружения и высокой воспроизводимостью. [c.244]

В настоящее время аминокислотный анализ белков, белковых пншевых веществ и органов имеет чрезвычайно большое значение, как метод исследования. Это обстоятельство заставило нас перевести предлагаемую книгу. На фоне весьма убогой по содер. жанию американской литературы по белкам книга Блока и Боллинг выгодно выделяется своей содержательностью и практичностью. [c.5]

Наряду с несомненными достоинствами необходимо отметить и недостатки книги Блока и Боллинг. Прежде всего следует подчеркнуть, что авторы игнорируют произведения авторитетных советских ученых, основанные на широкой экспериментальной практике особо заслуживают упо.Д1инания работы Н. Д. Прянишникова, Б. И. Збарского, Е. Д. Каверзневой. Во-вторых, в книге не приводятся подробно методы систематического аминокислотного анализа белков, хотя именно эти методы для научной характеристики белков имеют первенствующее значение. Систематический аминокислотный анализ белков освещен в книгах П. С. Садиков— Белковый практикум (Гос. Ленингр. университет, Лгд, 1938) и в 4-м томе Губена 1Методы органической химии (Госхимиздат, 1949 г.), где глава об аминокислотах, полипептидах и дикетопиперазинах переработана М. М. Ботвнник. Недостаточно изложены также некоторые общие методы, нашедшие за последнее время большое распространение, как например, хроматографический и изотопный анализ аминокислотных смесей. [c.5]

Под действием горячей азотной кислоты, хромовой кислоты, перманганата калия или пермуравьиной кислоты дисульфиды окисляются,. у йудьфокислоты. Стандартный метод разрыва дисуль-фидны связей Б химии белков заключается в обработке их пермуравьиной кислотой [120]. При этом цистеиновый и цистиновый остатки после гидролиза превращаются в цистеиновую кислоту (71), которую можно определить автоматическим аминокислотным анализом. Более мягкие окислители, например холодная азотная кислота, пербензойная кислота, лг-хлорпербензойная кислота и озон, превращают дисульфиды в тиолсульфонаты, причем в некоторых случаях удается выделить тиолсульфинаты. [c.458]

Расположение специфических аминокислот в глобулярных белках. По данным рентгеноструктурного анализа миоглобина и других одноцепочечных глобулярных белков небольших размеров бьш сделан ряд обобщений, касающихся укладки полипептидных цепей растворим ых белков. Исходя из этих обобщений, укажите наиболее вероятное расположение (внутри или на поверхности молекулы нативного глобулярного белка) аминокислотных остатков аспарагиновой кислоты, лейцина, серина, валина, глутамина и л1Йина. Поясните свой ответ. [c.223]