Методы с использованием маркера

Методы с использованием маркера [c.105]

В практическом отношении антитела преимущественно применялись для решения проблем идентификации и количественного определения веществ. Здесь имеется в виду использование белков как природных маркеров некоторых сырьевых материалов с целью распознавания их в продуктах питания для контроля качества. С этой целью изготовлены специфические иммунные сыворотки этих белков. Так, например, методы преципитации в геле послужили для обнаружения в пшеничной муке примесей ячменной муки [76] или в муке из твердой пшеницы примесей муки из мягкой пшеницы [90, 91]. Они могут быть использованы также для проверки отсутствия клейковины в кормовых рационах [7]. В такой стране, как ФРГ, где законодательство разрешает использовать в производстве пива только солод из ячменя и хмель, исключая особенно зерно риса и кукурузы как более дешевые источники крахмала, для контроля поступающего в продажу пива применили метод иммунохимической идентификации [98]. Иммунохимический подход (метод преципитации и RIA) также использовали для контроля запрещаемых законом в некоторых странах добавок в пиво препаратов протеаз как средства стабилизации [32]. В этих двух последних случаях проблема распознавания сложна, поскольку изготовление пива предусматривает вспенивание сусла при перемешивании, пастеризацию при стерилизации, т. е. происходит в условиях денатурации белков. Задача распознавания денатурированных бел- [c.112]

Разработаны две модификации этого метода. В первой весовая ячейка соединена с растущим монокристаллом, во второй модификации с весовой ячейкой соединен тигель с расплавом. Оба способа успешно используются, поскольку весовой способ практически не зависит от теплофизических свойств кристаллизуемого вещества. При этом задача существенно упрощается, и более того, возникает возможность использования надежной теплоизоляции и различных средств измерительной техники для оптимизации процесса, без нарушения условий кристаллизации. Получил развитие и телевизионный метод контроля диаметра растущего монокристалла, основанный на учете свечения мениска. Он базируется на изучении зависимости амплитуды и длительности видеосигнала от яркости и размеров наблюдаемого объекта (рис. 103 б). Передающая камера устанавливается перед окном кристаллизационного аппарата так, чтобы в поле зрения постоянно находились мениск и часть кристалла вблизи фронта роста. С помощью маркера на экране монитора оператор выбирает для измерения определенную строку изображения, то есть задает ординату контролируемого сечения монокристалла и мениска. Для контроля сечения, отличного от кругового, используется угловой датчик. В этом случае проекция сечения синхронизируется с определенным угловым положением. Точность измерения диаметра растущего монокристалла телевизионным методом 3% и зависит от линейности развертки и точности измерения длительности видеосигнала. [c.145]

В 500 000 точек данных (соответствует примерно 30 хроматограммам), а используемая скорость выборки обычно составляет две точки образца в секунду. Типичный диалог человек — машина, который может происходить в процессе хроматографического анализа, показан в табл. 8.4. Слева показан пример диалога, проводимого с целью подготовки компьютера к анализу на определенном хроматографе с использованием специфического метода предварительного запоминания (диалог А). После того как компьютер отыскал в своей памяти необходимые программы, он информирует аналитика (сообщение ОК RUN), что анализ можно проводить. Аналитик вводит пробу в хроматограф и сигнализирует об этом компьютеру посредством соответствующего маркера события (ножной переключатель или сенсорный контакт и т. д.). После завершения анализа аналитик сигнализирует компьютеру, что вести контроль за работой газового хроматографа больше не нужно (см. табл. 8.4, диалог В). Компьютер помогает также при проведении масс-спектрометрического анализа. Сбор данных в этой области характеризуется двумя следующими особенностями а) время, необходимое для проведения анализа, предельно мало по сравнению со временем, необходимым для интерпретации данных за считанные секунды можно получить несколько масс-спектров, однако интерпретация каждого из них может потребовать до нескольких часов, объем получаемой информации весьма велик (так, масс-спектр одного компонента может содержать более чем 100 пиков). [c.343]

Ввиду неизотермических условий заполнения формы и зависимости вязкости от температуры и степени превращения в процессе течения будет неизбежно происходить перестройка профиля осевой составляющей скорости, связанная с появлением поперечной компоненты. Однако, согласно условию /Я>1, осевая составляющая скорости V в области основного течения значительно превосходит поперечную компоненту, что позволяет последнюю не учитывать. В этом случае траектории движения частиц жидкости будут прямолинейными и параллельными продольной оси полости. В области фронта необходимо учитывать двухмерность течения, так как здесь имеет место фонтанный эффект [131], при котором свежая масса из центральной области потока выносится в пристеночные слои (см. рис. 4.53), оказывая влияние на распределение степени превращения и температуры. Точное описание течения в этой области требует решения задачи со свободной поверхностью [263]. Для этой цели может быть использован метод маркеров и частиц в ячейках. Однако, даже если не учитывать реальных свойств жидкости и явления тепло- и массопереноса во фронте, такой подход приводит к значительному усложнению модели. В то же время на практике оправдывают себя упрощенные способы аналитического задания во фронтальной области распределения скоростей, соответствующие экспериментальным данным по фонтанному эффекту. [c.175]

Формальдегид сильно препятствует образованию водородных связей в денатурированной ДНК [395—397[, стабилизируя довольно вытянутую конформацию ее молекул это приводит к уменьшению устойчивости по отношению к ферментативному гидролизу и намного увеличивает эффективность образования комплексов антиген — антитело [396]. На микрофотографиях ДНК, обработанной формальдегидом, видны длинные тонкие нити с диаметром, значительно меньшим, чем у нативной ДНК [397]. Очень удачные микрофотографии были получены для денатурированной ДНК, обработанной диазониевой солью 8-амино-1,3,6-нафталин-трисульфокислоты (связывающейся, по-видимому, с Сз гуаниновых остатков) с последующим прокрашиванием уранилацетатом в разбавленном растворе формальдегида. Маркер отчетливо виден на микрофотографии, и вполне вероятно, что этот метод может быть использован для электронномикроскопического определения последовательности оснований в нуклеиновых кислотах [397]. [c.608]

Аналогичный гипотетический пример можно привести в отношении использования хемостерилизаторов для обработки природных популяций. Предположим, что 1) имеется какое-то средство, например приманка или аттрактант для обработки природной популяции 2) в приманку с хемостерилизатором можно ввести маркер иного типа, как, например, краситель или радиоактивный изотоп, и таким образом позднее опознавать насекомых, стерилизованных при обработке, и 3) имеется возможность обследования популяции в каком-либо ином пункте вдали от мест раскладки приманок или обрабатываемого участка. Если приманка или обработка полностью стерилизуют привлеченных самцов и самок, то можно ожидать, что процент стерильности самок популяции, которые не подверглись обработке или не трогали приманок, будет равен проценту особей популяции, подвергшихся обработке и стерилизованных при этом. В тех случаях, когда все подопытные самцы и самки не полностью стерилизуются или же некоторые из них стерилизуются полностью, а другие частично, нам придется сравнивать степень стерильности, установленную у самок всей популяции (как обработанных, так и необработанных), со степенью стерильности, рассчитанной исходя из процента особей популяции, подвергшихся обработке. Например, если в результате обработки было стерилизовано 50% особей популяции, то во всей популяции стерильность должна достигать 75%. В этом случае снова наличие корреляции между расчетными и опытными результатами докажет пригодность метода и конкурентоспособность стерилизованных самцов, а отсутствие корреляции укажет на необходимость проведения дальнейших исследований для совершенствования метода и лучшего понимания биологии вида. [c.232]

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

Идентификация индивидуальной хромосомы, в которой находится исследуемый ген,-это только первый этап картирования. Основной задачей являются установление порядка генов и их точная локализация. В некоторых случаях метод анализа родословных позволяет расположить на генетической карте хромосомы три и более маркеров. Использование более эффективных методов генетики соматических клеток может дать более точную информацию. Существенную помощь в таких исследованиях оказывают хромосомные перестройки (см. гл. 21). Далее мы рассмотрим примеры использования делеций, транслокаций или дупликаций для картирования генов. [c.301]

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88]. [c.125]

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Во многих случаях для изучения экспрессии генов млекопитающих наиболее приемлема так называемая временная экспрессия, происходящая в части клеток в течение нескольких часов после введения ДНК. Если же требуются большие количества продукта, то приходится выделять клоны, клетки которых сохраняют вектор и в ходе пролиферации. Подобное стабильное наследование вектора достигается двумя путями использованием вирусного репликона, например вируса папилломы крупного рогатого скота (ВРУ) (см. гл. 8 тома П этой серии [34]), или в результате интеграции вектора в ДНК клетки-хозяина. Известно, что любая чужеродная ДНК с низкой частотой способна встраиваться в неспецифические участки хозяйской хромосомы получившиеся клоны можно выявить, если использовать подходящий селективный маркер. В гл. 6 тома И данного издания описаны различные селектируемые векторы, а также способы их введения в культуру клеток. В этой главе мы коснемся методов, позволяющих получить высокоэффективную экспрессию интегрирующихся векторов в стабильно трансфицированных линиях клеток. [c.238]

Иммунометрическне. Вторая группа методов — иммунометрические, основана на принципе сэндвич -анализа. Особенность этих методов заключается в том, что на твердой фазе иммобилизован избыток антител, с которыми проводят инкубацию антигена. После удаления несвязавшихся компонентов в систему добавляют избыток меченых антител, которые взаимодействуют с антигеном. Очевидно, этот метод применим только к поливалентным антигенам (рис. 24, а). Чувствительность и точность иммунометри-ческих методов принципиально существенно выше конкурентных, так как используя избыток антител на твердой фазе, можно адсорбировать из раствора сколь угодно малое количество антигена, а затем избытком меченых антител определить его содержание. Кроме того, в этом случае гораздо менее строгие требования к количеству добавляемых компонентов. Чувствительность иммунометрических методов в большей степени зависит от нижнего предела детекции маркера. Однако на практике предельной чувствительности достигнуть трудно в силу того, что при большом избытке первичных и вторичных антител наблюдается значительная иеспецифическая сорбция, которая фактически и лимитирует чувствительность этих методов. Использование моноклональных антител в иммунометрическом анализе очень эффективно, так как, сорбируя на твердой фазе антитела одной специфичности, а проявляя связавшийся с ними антиген мечеными антителами другой специфичности, удается не только повысить избирательность детекции антигена, но и сократить время анализа (рис. 24,6). [c.118]

Биолюминесцентный иммуноферментный анализ (БИФА). В этой группе методов можно выделить методы, основанные на использовании в качестве меток люцифераз (светляков и бактерий) и методы с маркерами — ферментами, участвующими в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами. В табл. 4.6 приведены имеющиеся модификации БИФА ряда антигенов. [c.129]

В качестве маркеров применяют также ферменты. Основгшная на этом принципе специальная аппаратура для высокочувствительного ферментативного иммунохимического анализа выпускается серийно. В этом случае определяемый компонент метят ферментом. С антителами взаимодействуют как свободные, так и связанные с ферментом соединения, причем активность фермента при образовании комплексов АГ-АТ. как правило, подавляется (иногда усиливается). Концентрацию исследуемого вещества определяют путем измерения активности фермента по отношению к соответствующему субстрату. Чем больше концентрация немаркированного соединения, тем меньше фермента связьшается антителами и тем выше его активность. При этом достигается высокая чувствительность определений, характерная для ферментативных методов анализа. Использование ферментов-маркеров для контроля за ходом иммунохими- [c.299]

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

Процесс репликации ДНК в фагах и в митохондриях мышиных клеток, был исследован методом электронной микроскопии с использованием в качестве маркеров денатурационных петель. Эти петли представляют собой небольшие участки ДНК, денатурирующиеся в процессе подготовки препаратов для электронно-микроскопических исследований. Возможно, что эти петли ДНК образуются в участках с низким содержанием G -nap или в участках, обладающих по каким-либо другим причинам пониженной стабильностью по сравнению с остальными участками ДНК Петли чем-то напоминают гетеродуплексьь (разд. Г, 8, в), однако возникают они по другой причине. В кольцевой, митохондриальной ДНК мыши можно видеть две такие петли, отстоящие-одна от другой приблизительно на 180° и отличающиеся друг от друга. Использование этих петель в качестве маркеров позволило проследить-направление репликации. В настоящее время этот метод широко используется. [c.274]

Поскольку н Т-, н В-лимфоциты встречаются во всех периферических лимфоидных тканях, нужно было найти удобные методы, которые позволяли бы различать н разделять эти два типа клеток,-только после этого можно было изучать их индивидуальные свойства. К счастью, различительными маркерами могут служить многочисленные белки плазматической мембраны, характерные только для Т- нли только для В-клеток. Один нз наиболее часто используемых шркеров-гликопротеин Thy-], который у мышей имеется на Т-, но не на В-лимфоцитах поэтому антитела к Thy-1 можно использовать для удаления нли очистки Т-клеток из смешанной популящ1н лимфоцитов мыши. Использование антигенных маркеров клеточной поверхности для различения и разделения Т- и В-клеток революционизировало клеточную иммунологию и сыграло важную роль в быстром прогрессе этой области знания в последние годы. У экспериментальных животных и у человека находят все больше и больше новых маркеров, характерных для функционально различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов. [c.11]

Точное описание течения в этой области требует решения задачи для свободной поверхности. Для этой цели может быть использован метод маркеров и ячеек [132]. Однако даже если не учитывать реальных свойств жидкости и явления тепломас-сопереноса во фронте потока, такой подход приводит к значительному усложнению модели и большим затратам машинного времени. Как установлено в работах [133, 134], результаты моделирования совпадают с экспериментом с достаточной точностью, если фронт считать плоским и задавать в области фронта распределение скоростей, приближенно соответствующее фон- [c.79]

Для олигонуклеотидов иэ панкреатического РНК-азного гидролизата концентрацию фермента можно снизить до 0,1 мг/мл и проводить инкубацию 30 мин при 37°С. По окончании инкубации раствор иэ капиллярной трубки наносят непосредственно на полоску DEAE-бумаги шириной 2,5 см и длиной 30 см. По одну сторону от гидролизата наносят образец негидролизованного олигонуклеотида, по друг>то -смесь розового и голубого маркеров. Полоску бумаги кладут на рамку или помещают в прибор для электрофореза и затем смачивают смесью 2,5%-ной муравьиной кислоты и 8,7%-ной уксусной кислоты. Этой же смесью заполняют резервуары. Электрофорез проводят при напряжении 30В/см до тех пор, пока голубой маркер не продвинется приблизительно на /д общего расстояния. Ток отключают, бумагу осторожно вынимают и дают ей высохнуть. Положения красителей-маркеров отмечают радиоактивными чернилами и проводят радиоаутографию электрофореграммы. Измеряют расстояния пятен от старта и идентифицируют последовательность в соответствии с данными, приведенными в табл. 11.1. В сомнительном случае пятна можно элюировать и щелочным гидролизом определить нуклеотидный состав. Это подобно методу определения последовательности с использованием [c.281]

Стерильность у насекомых, каким бы способом она ни была до стигнута, будет полезна во многих отношениях как биологический инструмент в полевых опытах. Если взглянуть ка исследователь скую работу по хемостерилизаторам, то будет заметен довольно обобщенный подход к проблеме. Ведутся лабораторные опыты, чтобы найти химикаты, способные вызвать стерильность у насекомых и определить их потенциальную эффективность. Успешные лабораторные исследования приводят к полевым опытам для выяснения осуществимости различных методик. В лаборатории основной упор делается на определение действия хемостерилизатора на само насекомое, т. е. 1) минимальной эффективной концентрации 2) фазы развития, в которой легче всего произвести стерилизацию 3) влияния на каждый из полов, жизнеспособность, продолжительность жизни, половую активность самцов и 4) продолжительности стерильности. В этих исследованиях стерильность служит маркером, используемым для определения действия хемостерилизаторов на насекомых. В полевых опытах могут оцениваться некоторые из тех же самых факторов, однако здесь упор обычно переносится с изучения эффективности хемостерилизатора самой по себе на осуществимость методики применения конкретного хемостерилизатора для подавления или искоренения насекомых. Теперь важно разработать методику и понять биологию насекомого, с которым ведется борьба. Стерилизация — прекрасное средство маркировки насекомых для полевых опытов. Имеется много преимуществ в использовании стерильности, отдельно или в сочетании с другим маркером, например красителями, красками, флуоресцентными или радиоактивными материалами. Так, например, один из практикуемых методов определения численности насекомых в какой-либо популяции заключается в выпуске насекомых, меченных хорошо заметным образом, так что отношение меченых насекомых к немеченым после отлова может быть использовано для оценки общей численности [c.229]

Стерильность использовали в лабораторных, а также в некоторых полевых опытах для выяснения, спариваются ли самки того или иного вида лишь однократно или большее число раз. Конечно, имеются и другие методы определения одно- или многократности спаривания самок. Они включают простые наблюдения и использование генетических маркеров. Хотя простым наблюдением можно установить, сколько раз самка способна совокупляться, но это не дает исследователю сведений о том, происходил ли при этом перенос спермы или была ли эта сперма использована для оплодотворения яиц. Такие генетические маркеры, как видимые мутации, устойчивые к инсектицидам расы, и стерильность (доминантная летальность) необходимы для демонстрации произведенного оплодотворения. Если самцы стерилизованы хемостерилизаторами, то введение доминантных летальных мутаций в генетический материал позволяет проследить жизнеспособность яиц, с тем чтобы определить, спаривается ли самка больше одного раза. Использование стерильности этим путем возможно в любом лабораторном или полевом определении или исследовании, хотя полевые опыты намно- [c.234]

Когда мы имеем дело с популяцией насекомых, развивающейся с четко разграниченными поколениями или с небольшим перекрытием поколений, мы можем проследить за увеличением или сокращением общей численности от поколения к поколению, применяя полож-ения, разработанные Ниплингом для стерилизационного метода подавления или уничтожения вредных насекомых. В данном случае стерильность становится инструментом или маркером, позволяющим оценить изменения в численности популяции. Здесь снова нужно подчеркнуть, что определения этого рода могут быть с большой легкостью проведены путем выпуска стерилизованных и меченых насекомых. Использование стерильных насекомых позволит воспользоваться двумя способами определения численности популяции, обеспечит уверенность в том, что выпущенные насекомые достаточно хорошо смешались с природной популяцией, и подтвердит полученные данные о соотношении выпущенных и природных насекомых. [c.239]

О значении цитогенетических методов в селекции свидетельствует следующий пример. На симпозиуме, посвященном npnpio-де мутаций у растений, их получению и использованию (США, Пуллман, 1969), Рэ мед ж сообщил о том, что в США министерством земледелия и Университетом Аризоны выпущен в производство первый гибридный ячмень. Для его получения использована линия с транслокацией, обеспечивающая наличие мужской стерильности у растений, служащих материнской формой. У этих растений добавлена к диплоидному набору лишняя хромосома, состоящая из участков хромосом 2—7. В этой лишней хромосоме локализован рецессивный ген мужской стерильности и ген-маркер, позволяющий отбирать растения с лишней хромосомой без цитсуюгического анализа. Лишняя хромосома передается только через яйцеклетки и должна наследоваться вместе с одной из хромосом диплоидного набора. Авторы рекомендуют пользоваться подобной сбалансированной системой для получения гибридных форм у ряда других культур. [c.130]

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Однако эксперимент Меселсона — Сталя не дает представления о порядке репликации 1% участков ядерной ДНК бактерий в период генерации. Так, остался открытым вопрос о количестве участков, реплицирующихся одновременно. Иными словами, не был решен вопрос о том, сколько репликационных вилок Y-типа (фиг. 88) работают одновременно в одном ядре Е. oli. Этот вопрос был решен в 1963 г. с помощью трех совершенно различных экспериментов, один из которых, проведенный Бон-гоффером и Гирером, представлял собой просто усовершенствованный вариант опыта Меселсона — Сталя. Принцип использованного ими метода заключался в следующем если в клеточном наборе ДНК существует п участков, реплицирующихся одновременно, или п реплицирующихся вилок на бактериальное ядро, то для репликации молекулы ДНК, составляющей некую X долю общей ДНК ядра, потребуется f — пх времени генерации. Отсюда п = fix. Для измерения продолжительности времени, необходимого для репликации участка ДНК определенной длины, был проведен эксперимент по переносу, в котором в качестве маркеров плотности вместо двух изотопов азота использовались тимин и его аналог, 5-бромурацил (БУ) (фиг. 95). Это было возможно, так как, если нуждающихся в тимине ауксотрофов (Thy ) Е. соИ выращивать в среде, содержащей вместо тимина бромурацил, они легко включают в ДНК вместо тимина бромурацил, В результате молекулы ДНК, содержащие такой бро- [c.199]

Специфическая трансдукция облегчает генетические исследования у бактерий, касающиеся, в частности, расположения и регуляции генов. Для Е. соИ существует множество фагов, подобно фагу Я включающихся в хромосому бактерии в разных местах и позволяющих осуществлять специфическую трансдукцию хромосомных маркеров. Очень важно при этом, какой используется донор-хозяин. Например, штамм 2 (табл. 14.1) имеет делецию в месте нормальной интеграции профага Я в этом случае фаг Я включается с низкой частотой в другие, несвойственные для него места, разбросанные по всей хромосоме. Индукция таких лизогенных бактерий приводит к формированию трансдуцирующих фагов, несущих почти любой желаемый ген [35]. Этот подход может быть использован и для других фагов Е. oli, осуществляющих специфическую трансдукцию, а также для фагов, размножающихся в других видах бактерий. Многие из методов, позволяющих реализовать эти подходы и другие возможности использования фагов, способных к специфической трансдукции, описаны Миллером [2]. [c.90]

У Е. соН выделено множество штаммов типа Hfr с различными точками начала переноса и различными направлениями хромосомного переноса [13, 27]. Выбор штамма Hfr, таким образом, зависит от участка бактериальной хромосомы, который собираются изучать в отношении картирования генетических локусов. Новые Hfr-доноры могут быть легко выделены на различном генетическом фоне с использованием либо модифицированного флуктуационного теста со штаммом F+ [6], либо интегративной супрессии в штамме F+ или R+, имеющем мутацию dnaA (Ts) [30]. Методы осуществления скрещиваний типа HfrXF" можно проиллюстрировать, используя какой-либо Hfr-штамм, например прототрофный штамм 12 (табл. 14.1), который передает свою хромосому 0-thr leu pro А la ... руг В F и чувствителен к налидиксовой кислоте и стрептомицину, и какой-нибудь штамм F", например штамм 14 (табл. 14.1), с мутациями, обусловливающими ауксотрофность по лейцину, пролину, аденину, триптофану и тиамину и устойчивость к налидиксовой кислоте и стрептомицину. У штамма 14 имеются и другие мутации, и наследование их аллелей дикого типа будет происходить как наследование маркеров, по которым не ведется отбор. Штамм 13 (табл. 14.1) несет меньше мутаций, чем штамм 14 он более удобен для проверки стабильности Hfr-фенотипа в штамме 12. [c.110]

В основе метода лежит использование двух векторов — одного космидного, а другого плазмидного, не имеющих областей взаимной гомологии и различающихся по маркерам лекарственной устойчивости, например, Кт и Ар Оба вектора способны временно поддерживаться в гес+-окружении в штаммах для упаковки in vivo (разд. 2.2.8.5), причем клетки содержат обе эписомы. [c.62]

Более сложный технически, но часто дающий более удовлетворительные результаты метод получения чистых вирусных препаратов (т. е. не содержащих хелперных вирусов) предусматривает последовательное использование двух разных упаковывающих линий так, что вирус, продуцируемый первой клеточной линией (после трансфекции соответствующей ДНК) инфицирует затем вторую линию клеток [36] (рис. 9.5). Необходимое условие при этом наличие в векторе подходящего маркера для осуществления селекции инфицированных клеток. Чтобы обмануть свойственный упаковывающим клеткам иммунитет к инфицированию вируса той же тропности, вирус пересаживают из амфотропной упаковывающей линии на эко-тропную или наоборот. Если такое решение вопроса неприемлемо, скажем по соображениям возможной биологической опас- [c.289]

Смотреть страницы где упоминается термин Методы с использованием маркера: [c.226] [c.17] [c.132] [c.17] [c.11] [c.179] [c.5] [c.194] [c.459] [c.309] [c.47] [c.212] [c.231] [c.160] [c.63] [c.282] [c.309] [c.244] [c.245] [c.15]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология