Методы анализа отдельных аминокислот

Книга не является ни компиляцией, ни узким обзором американской литературы, что часто бывает характерно для многих подобных американских произведений она трактует аналитические методы определения аминокислот, в большинстве случаев проверенные, а зачастую и разработанные в лаборатории авторов. Обзор химических методов анализа отдельных аминокислот составлен достаточно полно, причем авторы делают очень ценную попытку подойти критически к каждому методу и выделяют при этом наиболее надежные. [c.5]

Методы анализа отдельных аминокислот [c.189]

Хотя в этой главе уже кратко обсуждались специфические преимущества н недостатки различных методов, но относительная ценность их еще не рассматривалась. К сожалению, лишь немногие исследователи пользовались несколькими методами при анализе отдельных аминокислот. Это и понятно, потому что, когда исследователь овладевает тон или иной методикой, он редко стремится овладеть еще второй пли третьей и этим подтвердить свои собственные результаты. Однако в тех случаях, когда исследователь пользуется несколькими. методами, получаются несомненно интересные результаты. [c.130]

Если к методам,ультрамикроанализа причислять также все методы анализа, при которых определяются элементы, группы или соединения в микрограммовых количествах, не принимая во внимание количества исходных веществ, то описание этих методов далеко перешагнет за рамки данного раздела. Так, придется включить описание большинства неорганических и органических цветных реакций, методов анализа витаминов, аминокислот, антибиотиков, ферментов и др. Надо отметить, что несмотря на отсутствие подходящих весов, все же удалось улучшить существовавшие до сих пор микрометоды настолько, что в случае необходимости, например при анализе очень ценных веществ и для отдельных исследований, можно работать с очень малыми количествами исследуемых веществ. Однако эти методы еще недостаточно разработаны для повседневного использования в лаборатории. [c.251]

Следует учитывать, что аминокислоты сильно различаются по своей структуре и отдельные реакции не всегда применимы ко всем из них, а именно некоторые реакции применимы только к алифатическим соединениям. Кроме того, при различных реакциях наблюдаются в значительной степени нежелательные побочные процессы максимальные достигаемые при этом выходы воспроизводятся с трудом и не позволяют точно количественно определять аминокислоты. Однако как качественный метод анализа газовая хроматография наряду с хроматографией на бумаге занимает важное положение в аналитической химии аминокислот. [c.271]

Вопросу анализа аминокислот методом хроматографии на бумаге посвящено большое число работ советских и иностранных авторов. Однако почти все они связаны с разделением аминокислот белков и других биологических препаратов [61. Наша попытка применить их для анализа мелассы не дала положительных результатов, что можно объяснить мешающим действием остальных компонентов мелассы, ио отношению к которым содержание отдельных аминокислот составляет лишь 0,1—3 вес. %. Описанный в литературе метод 17, 81, состоящий в сорбции аминокислот на катионите с последующей их элюцией и идентификацией на бумаге неудобен, так как требует сложной специальной аппаратуры и чрезмерно длителен. Первой частью нашего исследования было хроматографическое разделение искусственной смеси из десяти аминокислот, приблизительно имитирующей аминокислотный состав мелассы [1, 81. Смесь включала лизин, аргинин, серии, глицин, аспарагиновую и глютаминовую кислоты, а-аланин, валин, метионин и лейцин. Растворы аминокислот готовили в 15%-ном этиловом спирте с концентрацией 0,5—1 у аминокислоты в 1 мкл. [c.212]

Разделение смеси аминокислот. Для разделения смеси аминокислот, находящихся в гидролизате белка, и качественного обнаружения отдельных аминокислот широко используется метод распределительной хроматографии на бумаге. Этот метод представляет собой одну из модификаций метода хроматографического анализа, предложенного М. С. Цветом в 1903 г. [c.15]

В книге подробно рассматриваются автоматический метод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хроматографии, газожидкостная хроматография аминокислот и пептидов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электрофореза, изучение функциональных групп в белках с привлечением химических методов. Отдельная глава посвящена изучению четвертичной структуры белков. [c.2]

Впервые общий метод определения аминокислот в гидролизатах белков был предложен Э. Фишером. В настоящее время разработаны весьма совершенные методы анализа продуктов гидролиза белка, позволяющие с большой точностью определять качественно и количественно содержание отдельных аминокислот в тех или иных белковых веществах после их гидролиза. Эти методы основаны главным образом или на осаждении отдельных аминокислот специфическими реактивами, или на образовании с последними характерной окраски. [c.33]

Для разделения и количественного определения аминокислот особенно эффективными оказались методы распределительной, адсорбционной и ионообменной хроматографии. Большое применение, в частности, получил метод Мура и Стейна, в котором исследуемый раствор пропускают через колонку, наполненную или крахмалом (твердый полярный адсорбент), или ионообменной смолой (сочетание адсорбции с ионным обменом), и затем связанные на колонке вещества вымывают с различной скоростью подходящими растворителями. Сбор и анализ отдельных фракций осуществляются при помощи автоматических приспособлений. Метод Мура и Стейна позволяет получить через 24 часа данные о полном аминокислотном составе образца белка, используя при этом только 2,5—3,5 мг белка. Для оценки эффективности и значения этого метода полезно напомнить, что старые и более грубые аналитические приемы требовали для получения данных о полном аминокислотном составе белка нескольких недель трудоемкой работы, связанной с расходованием десятков граммов белка. [c.35]

Этот метод используют для качественного анализа, всякого рода органических смесей. Его можно сделать и количественным, применяя к отдельным пятнам микроаналитические методы, главным образом колориметрические. Классическим примером применения этого метода является качественный анализ смесей аминокислот. [c.24]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Применяемые методы анализа пептидов и концевых аминокислот в совокупности позволяют установить порядок расположения отдельных фрагментов в молекуле белка. [c.289]

Для количественного анализа проводят определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски или размерам пятен хроматограмм, а также путем элюирования аминокислот из отдельных пятен и последующего определения их классическими количественными методами анализа. [c.329]

Следует отметить некоторые недостатки книги. Данная авторами критическая оценка излагаемого материала не всегда объективна. Кроме того, ввиду исключительной широты круга вопросов, затрагиваемых в отдельных статьях, некоторые разделы химии белка освещены недостаточно полно. Поэтому по ряду вопросов (например по вопросам, относящимся к методам анализа аминокислот и пептидов, условиям гидролиза, синтезу пептидов и т. д.) читатель может получить сведения лишь в пределах, необходимых для общей ориентировки. Цитируемая авторами обширная литература компенсирует недостаточность охвата материала только до некоторой степени, так как в книге почти не нашли отражения работы и представления советских ученых в области химии белка, а также некоторые исследования иностранных ученых. [c.4]

Многие усовершенствования за последнее время, несомненно, были вызваны желанием подтвердить или опровергнуть гипотезу строения белка Бергманна и Нимана в той части, в какой она касалась полного аминокислотного состава. Современные аналитические методы едва ли способны разрешить эту задачу даже для отдельных аминокислот. Однако имеются серьезные основания полагать, что через несколько лет проблема анализа белковых гидролизатов или аминокислот будет разрешена в такой мере, что центр тяжести проблемы будет заключаться в соответствии состава гидролизата составу белка, из которого он получен. [c.46]

Тем не менее, многие методы анализа этого рода весьма специфичны и точны, и к числу их относятся методы, пригодные для определения отдельных классов аминокислот в смесях. Различные методы с применением нингидрина и йодной кислоты приобрели большое значение в белковой химии. [c.96]

Экспериментальное определение константы ионного обмена в двойной системе было проведено с применением тех же методов анализа отдельных компонентов, что и для тройных систем. Сорбированное количество аминокислоты определяли по разности концентраций исходного и равновесного растворов. Была проведена серия опытов, в которых сорбированное количество водорода превышало 0,3 мг-эт1г. Изотермы сорбции аминокислоты были сняты для разных, но постоянных pH равновесного рас- [c.97]

При анализе бе.пков применяются поэтому комбинированные методы определения отдельных аминокислот, т. е. целый ряд весьма разнообразных по степени сложности и в то же время совери1енно различных по точности количественных операций, в результате чего и получается та или иная суммарная картнна аминокис.чотного состава от дел ь-ных белков. [c.315]

К реакционной газовой хроматографии (в смысле определения Драверта и сотр.) должен быть отнесен также метод, разработанный Златкисом и сотр. (1958, 1960) для прямого определения алифатических аминокислот в водном растворе при применении двух реакторов (см. разд. 8.1.2). В нагреваемом до 140° реакторе I, заполненном нингидрином, сначала происходит окислительное разложение аминокислот до летучих альдегидов и двуокиси углерода. Продукты реакции разделяются в присоединенной последовательно колонке при комнатной температуре и переводятся в реактор II, заполненный никелем на кизельгуре. Это заполнение обеспечивает при 425° гидрогениза-ционное расщепление всех альдегидов до метана. Присоединяемая к реактору II короткая колонка с молекулярными ситами служит для абсорбции образующейся и захваченной из пробы воды. Отдельные аминокислоты затем определяются в виде пиков метана при помощи катарометра. Применением реактора II решается относительно простая задача газохроматографического анализа веществ, содержащих воду, тем более что метан в отличие от альдегидов легко высушить. Кроме того, превращение альдегидов в метан позволяет более просто количественно определять аминокислоты, так как специфическая для данных веществ теплопроводность остается всегда одинаковой и вследствие этого не нужно вводить поправочных коэффициентов в количественные результаты. Тот факт, что катарометр при обычной температуре может применяться для определения метана, положительно сказывается на чувствительности метода. [c.274]

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6 М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48- и 72-часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина. Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Вьщеление и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах, В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение — спектрофотометрически. Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных [c.40]

Книга Э. Шталя посвящена детальному описанию метода хроматографии в тонких слоях. В общей части излагаются приемы, аппаратура, сорбенты и некоторые общие методы идентификации. Подробно освещены вопросы теории хроматографии в тонких слоях. Специальный раздел посвящен изотопным методам. Специальная часть состоит из ряда глав, в которых п )иводятся примеры анализов отдельных классов соединений, например алифатических липидов, эфирных масел, бальзамов, смол, витаминов, стероидов, аминокислот, сахаров и т. д. [c.5]

Имеется ряд детальных обзоров, охватывающих применение хроматографии для анализа аминокислот, извлеченных из белков гидролитическими методами [89, 127, 134]. Читатель может найти в этих обзорах сведения об анализе отдельных белков. Достаточно указать на то, что в настоящее время количественно наиболее точным является метод, разработанный Муром и Стейном [93]. В этом методе применен градиентный проявительный анализ на ионообменных колонках из сульфированного полистирола. На рис. 165 показан типичный пример [62] превосходного разделения, осуществленного этим методом. Если применение сложной аппаратуры нецелесообразно, то хроматография на бумаге вполне применима для анализа белковых гидролизатов [7, 10, 30, 80]. [c.336]

Таким образом, для чисто химических или физико-химических исследований основным требованием является точность для широкого обзора в области пищевых белков самое первое, что нужно, это — получить возможно больше материала по присутствию и содержанию незаменимых аминокпслот. В нашей практике часто встречалось, что пищевой белок является хорошим источником больщинства незаменимых аминокислот, которые легко определить (именно цистин, метионин, аргинин, гистидин, лизин, тирозин и триптофан), и все же неполноценен в отношении других аминокислот, для выявления которых нет простых и точных способов определения. Если в таких случаях руководствоваться только анализами первой группы аЛтинокислот, то можно было бы впасть в серьезную ошибку при биологической оценке данного белка. Поэтому только полный анализ аминокислот, имеющих значение для питания, может дать правильную и полноценную картину исследуемых продуктов, даже если определение отдельных аминокислот будет произведено не абсолютными, а скорее сравнительными методами. [c.9]

Спакман, Стейн и Мур [12] предложили метод анализа кислых и нейтральных аминокислот на колонке размером 150 X X 0,9 см при использовании двух буферов, заменяемых один на другой в середине анализа. Согласно их методу, основные аминокислоты анализируются на второй колонке с использованием третьего буфера более высокой ионной силы и pH. Для анализа основных аминокислот, обычно встречающихся в пептидных и белковых гидролизатах, применяется колонка размером 15 X Х0,9 см. По этой методике для каждой колонки требуется отдельная проба однако методика име1Ет большие возможности. Гак, если необходимы сведения только о нескольких основных аминокислотах, например, в случае анализа физиологических жидкостей, то они могут быть получены без предварительного элюирования кислых и нейтральных аминокислот, которые при одноколоночном методе элюируются в первую очередь. [c.17]

Остается сделать вывод, что белки всасываются в кровь в форме более простых соединений, отдельных аминокислот и отчасти простейших пептидов. Применяя анализ оттекающей от кишечника крови, полученной по методу ангиостомии, удается показать, что во время пищеварения через кишечную стенку, действительно, в основном проходят аминокислоты и частично простейшие полипептиды. [c.335]

Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Пептиды соответствующих зон с нескольких листов бумаги после смывания объединяются и хроматографируются опять же на полном листе (каждая объединенная зона отдельно). Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. Повышение чувствительности методов анализа концевых групп даст возможность определять всю аминокислотную последовательность пептида после получения пептидной карты на одном листе бумаги. Для анализа К-концевых аминокислот уже разработан [8] флуоресцентный метод с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлЬри-дом, который в сто раз чувствительнее (достаточно 10 — 10" мкмоль пептида) обычно используемого метода с динитро-фторбензолом [9]. [c.237]

На широкой полосе бумаги помещают чередующиеся пятна контрольной и анализируемой смеси. Узкую полоску хроматограммы, отрезанную по одному из краев бумажной полосы, проявляют нингидрином. По положению окрашенных участков на отрезанной полоске разрезают остальные части хроматограммы. Полученные кусочки, на которых сорбированы отдельные аминокислоты, разрезают на мелкие части и помещают в пробирки для центрифугирования, куда введена суспензия фосфата меди в борнофосфатном растворе, дают постоять ночь на льду и затем осадок, содержащий фосфат меди и кусочки бумаги, отделяют на центрифуге. К жидкости добавляют сернистокислый натрий, определяют содержание меди полярографическим методом и строят график зависимости силы тока от концентрации для каждой а.минокислоты, используя результаты предварительного анализа нанесенных на бумагу пятен контрольной смеси. Получается прямолинейная зависимость между силой тока и концентрацией аминокислоты. По этому графику можно найти искомое количество аминокислот в анализируемой смеси. [c.161]

Обычные химические методы анализа растений часто, не обнаруживают закономерных изменений в количественном содержании отдельных азотистых веществ в растениях на протяжении какого-либо промежутка времени. Так, например, в одном из наших опытов с молодыми растениями овса через 24 часа после внесения азотной подкормки (с 5-мрат-ным обогащением общее содержание азота аминокислот состав- [c.47]

Ранее уже указывалось, что различные аминокислоты по-разному чувствительны к кислотам и щелочам и другим реактивам, применяемым в анализе с целью выяснения аминокислотного состава белка. Невозможно поэтому в одной навеске белка определить все аминокислоты без потерь отдельных из них в том или ином их количестве. С другой стороны, некоторые методы анализа аминокнс.ют, например колориметрические, дают подчас повышенные результаты для отдельных анинокнслот, поскольку та или иная цветная реакция оказывается далеко не специфичной. В результате этого окраска при реакции, которая оценивается количественно, обязана не одной аминокислоте, а нескольким нз них, в какой-то мере участвующим в данной реакции. Отсюда и получаются, как можно видеть, несколько повышенные цифры процентного состава для различных белков(105% — 120% в отдельных случаях). Для многих же белков аминокислотный состав их далеко еще не выяснен полностью. [c.315]

Метод используется для качественного анализа смесей органических веществ всех классов. Он может также служить и для количественного анализа, если при.менять микроаналитические методы, главным образом колориметрирование отдельных пятен. Классическим примером применения хроматопрафии на бумаге является качественный анализ смесей аминокислот. [c.441]

Современные направления в аминокислотном анализе стремятся избегнуть методов разделения с участием твердых фаз, которые медленно достигают равновесия, трудно регулируемы и являются неудобными для повторения фракционирования (например, фракционированной кристаллизации, которая является чрезвычайно трудоемкой процедурой). Аминокислоты в растворах можно перемещать в заданном нап эавлении в электрическо.м поле. Равновесие может быть быстро достигнуто ири использовании ионного обмена или адсорбции из растворов на твердой поверхности, пли распределения между двумя жидкими фазами, позволяющими применить хроматографические методы. Ионофоретический и хроматографический методы имеют особые преимущества, так как с их помощью концентрирование и очистка могут быть проведены сравнительно простылги приемами. В комбинации они, вероятно, представляют собой весьма плодотворный метод анализа. Они имеют особые преимущества перед методами, дающими определение отдельных аминокислот, так как позволяют обнаружить новые неожиданные аминокислоты в смеси. [c.62]

Сущность метода состоит в том, что белковый 1идролизат помещают на колонку с ионообменником, которая непрерывно промывается буфером с возрастающим pH (градиентная элюция). Элюат, вытекающий из колонки, встречается с капиллярным током нингидринового реактива и поступает затем в змеевик, где под влиянием повышенной температуры развивается голубое окрашивание (в случае пролина и оксипролина — желтое). Затем элюат попадает в кюветы, где измеряется его оптическая плотность при 570 и 440 ммк. Результаты фотометрирования автоматически записываются в виде серии максимумов. Полный анализ гидролизата продолжается 24 ч. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят, измеряя площадь пиков, отвечающих отдельным аминокислотам. [c.68]

Если цистеиновую кислоту определяют с помощью окисления надмуравьиной кислотой, анализ остальных аминокислот обычно проводят в отдельном гидролизате неокисленного белка. Бидмид и Лей [109] разработали метод одновременного определения всех аминокислот, включающий окисление. Однако в этом случае стадия окисления является более критической дополнительное неудобство состоит в частичном окислении тирозина в смесь моно- и дихлортирозина. [c.148]

Точное вычисление результатов анализа и их выражение в подходящих единицах не менее важны, чем тщательный выбор и выполнение самого экспериментального метода. Контроль полноты возврата общего азота, исходя из известного содержания азота в разных компонентах (см. стр. 133), как описано в классической работе Чибнелла [115], все еще остается лучшей гарантией правильности выполнения анализа белка в целом [6]. Несмотря на это, результаты определения отдельных аминокислот, выраженные в единицах азота, весьма неудобны и могут вводить в заблуждение в случае основных аминокислот. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология