Методы концентрирования электрофорез

Электрофорез микроорганизмов используют сейчас при исследовании природы поверхности клеток, а также как лабораторный метод концентрирования и разделения микроорганизмов [76, 77,79,80,90—92,182]. Однако, по всеобщему признанию специалистов, электрофорез не может стать промышленным способом отделения микроорганизмов от жидкостей [513]. [c.205]

Преимущества и недостатки неоднородных буферных систем. Основное преимущество диск-электрофореза заключает- ся в концентрировании разделяемых веществ с образованием очень узких зон. Недостатком является то, что в процессе изотахофореза белки могут достигать такой высокой концентрации, что это вызывает их осаждение. Кроме того, некоторые белки нестабильны в зоне pH, используемой для их исследования методом диск-электрофореза. [c.88]

И. Концентрированием части фильтрата с последующим хроматографированием на бумаге или электрофорезом на бумаге (один из лучших методов). [c.462]

Для разделения и концентрирования компонентов анализируемой смеси используют методы осаждения, соосаждения, экстракции, хроматографии, электролиза, электрофореза, дистилляции, сублимации, зонной плавки, флотации и др. В основе большинства методов разделения лежит принцип избирательного распределения компонентов пробы между двумя разделяющимися фазами. Открываемый компонент пробы переводят по возможности полностью в одну из фаз. [c.120]

В первой части тома представлены информационные базы и общие вопросы аналитической химии, метрологические основы методов количественного анализа, методы разделения и концентрирования, хроматографические методы и капиллярный электрофорез, гравиметрические, титриметрические и электрохимические методы анализа, масс-спектрометрический метод и газовый анализ. [c.2]

Для выделения ферментов из материалов различного происхождения, их фракционирования и концентрирования разработано множество эффективных методов. К ним относятся кристаллизация [5—7], диализ, ультрафильтрация и концентрирование на полых волокнах (8—10], электрофорез [И—13, гл. 35], экстракция [14, 15], лиофилизация [16], преципитация и методы с использованием растворимых неионных полимеров [17, 18], зональное центрифугирование [19]. [c.9]

Электрофорез. Обычно при нейтральных величинах pH вирусы несут отрицательный заряд [33], и при помещении вирусной суспензии в электрическое поле они перемещаются к катоду. Этот принцип был использован для концентрирования бактериофагов в воде [34]. Разработана простая процедура, при которой концентрации фагов возрастает в 100 раз. Путем модификации этот метод может быть использован и для концентрации энтеровирусов. [c.282]

В 1889 г. Гофмейстер обнаружил, что яичный альбумин, выделенный из белка куриных яиц, кристаллизуется из концентрированного раствора сернокислого аммония, из которого предварительно были осаждены остальные белки [232]. Наилучшие результаты могут быть достигнуты в том случае, если рН раствора, из которого осуществляется кристаллизация, приблизительно равен 4,8, а температура близка к 20° [162]. Яичный альбумин, приготовленный этим методом или по какому-либо из его вариантов [224, 233, 234] и перекристаллизованный несколько раз, является, как показали иммунологические [235] и иные пробы [236, 237], чистым веществом. Электрофорез обнаруживает наличие двух [c.54]

Метод ионообменной хроматографии в сочетании с электрофорезом применяется при разделении максимально очищенных смесей белков и гормонов из частично очищенных препаратов. На последней стадии очистки часто применяют метод кристаллизации. Для этого добавляют к концентрированному раствору фермента насыщенный раствор сернокислого аммония или спирт до заметного помутнения. Затем раствор оставляют стоять без помешивания несколько дней на холоде или при комнатной температуре до выпадения кристаллов. Выпавшие кристаллы отделяют и повторяют перекристаллизацию, каждый раз измеряя удельную активность фермента. Первоначально полагали, что кристаллические ферменты являются чистыми, свободными от примеси соединениями. Но вскоре было установлено, что степень чистоты многих кристаллических ферментов не превышала 50%, [c.128]

Преимущество данного метода заключается в том, что электрофорез приводит к концентрированию компонентов разделяемой пробы, так как в замыкающей части каждой отдельной зоны электрофоретическая подвижность выше, чем в районе ее переднего фронта. Благодаря этому в ходе разделения полосы даже суживаются, а к концу электрофореза становятся [c.102]

Это четвертый электрофоретический метод, который также широко используется в настоящее время. Он сходен с гель-электрофорезом в присутствии ДСН в том отношении, что белки в данном случае также разделяются только в соответствии с их размерами, а не по величине зарядов 182]. Концентрация акриламида изменяется по длине пластинки от самого высокого значения (обычно около 30%) в нижней ее части до всего лишь 3% в верхней. Буфер выбирается с высоким значением pH, так что в большинстве своем белки мигрируют в геле к аноду (вниз). Электрофорез длится до тех пор, пока каждый белок не достигнет такого участка в геле, где из-за слишком малых размеров пор он уже не сможет двигаться дальше. Например, небольшие белки могут дойти до участка, содержащего 25% акриламида, а крупные останутся вблизи старта (верхняя часть геля). Как и в системе с ДСН, при электрофорезе в градиентном геле можно определить размеры молекул, если прокалибровать гель с помощью смеси стандартных белков. Однако в данном случае эти размеры будут относиться к нативным белкам, а не к их субъединицам. Система электрофореза в градиентном геле сходна со следующим, пятым методом — изоэлектрическим фокусированием процесс продолжается до тех пор, пока не прекратится перемещение всех белков и пока не завершится фокусирование , или концентрирование, диффузных белковых зон, в результате чего будет достигнута очень высокая степень разрешения. [c.323]

В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носителя. Поскольку образец наносится в виде зоны, для полноты разделения приходится использовать небольшие количества вещества. В первую очередь функцией носителя является предотвращение механических воздействий и конвекции, которая происходит в результате как температурных изменений, так и высокой плотности концентрированных растворов макромолекул. Однако носитель иногда может адсорбировать молекулы различного типа или действовать в качестве молекулярного сита, приводя тем самым к хроматографическим эффектам (гл. 8), что может или помогать разделению или ухудшать его. Методы использования различных материалов в качестве носителей описаны в следующих разделах. [c.225]

Кристаллизация фермеявляется сложным методом их очистки и применяется для субстанций, проше1Щ1их концентрирование и многоступенчатую очистку [49]. Кристаллическое состояние не является единственным критерием гомогенности ферментного белка, а требует дополтштель-ного подтверждения другими методами (диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, ультрацентрифугированием и др.). Методы и техника кристаллизации подбираются индивидуально для каждого фермента. [c.170]

Метод гель-электрофореза всякий раз ставит экспериментатора перед выбором либо, используя концентрированный гель, добиться высокого разрешения нуклеиновых кислот с относительно небольшой молекулярной массой, либо в геле низкой концентрации с невысоким разрешением разделить высокомолекулярные соединения. Поэтому для каждого конкретного набора молекул приходится принимать некое компромиссное решение. Верхний предел по молекулярной массе можно увеличить путем уменьшения концентрации сшивающего агента и (или) суммарной концентрации геля. Такой подход оказался эффективным в случае выделения и анализа матричных и рибосо- [c.178]

Разрушение всех эмульсий можно достичь введением в систему поверхностно-активного вещества, вытесняющего из адсорбционного слоя эмульгатор, но неспособного стабилизовать эмульсию. Именно на этом основана возможность разрушения некоторых эмульсий первого рода введением в них амилового спирта. Эмульсии можно также разрушить путем центрифугирования, фильтрования, электрофореза. При центрифугировании и фильтровании происходит собственно концентрирование эмульсии. Однако в эмульсиях с очень высокой концентрацией дисперсной фазы и недостаточным срдержанием эмульгатора, как правило, происходит коалесценция капелек, и таким образом система разрушается. С. С. Воюцким с сотр. разработан метод непрерывного разрушений [c.379]

Рассмотренный только что для обычной сефарозы, этот вариант элюции, естественно, находит применение и при использовании гидрофобизированной агарозы. В качестве примера процитируем недавно опубликованную работу по мягкой очистке HMG-белка из ядер печени на колонке со-аминобутилагарозы. Этот белок растворим в растворе сульфата аммония вплоть до концентрации, достигающей 70% от насыщения. Сначала такой концентрацией СА в нейтральном 0,01 М трис-буфере высаливали из экстракта ядер большое количество балластного белка. Затем надосадочную жидкость, содержащую около 40 мг белка, вносили на колонку размером 2 X X 30 см, уравновешенную тем же раствором СА. Элюцию вели снижающимся линейным градиентом концентрации СА в том же буфере (500 мл) со скоростью 20 мл/ч, т. е. примерно 7 мл/см -ч. Низкая скорость элюции характерна для всех опытов такого рода ввиду повышенной вязкости концентрированных солевых растворов и соответствующего снижения скорости диффузии макромолекул. Около 30% белка не садилось на колонку и удалялось при первоначальной промывке. В ходе элюции выходило четыре пика, в первом из которых методом электрофореза идентифицировали HMG-белок [ onner. omings, 1981]. [c.181]

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-фата натрия в присутствии р-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли. [c.119]

Глутаминовая кислота, например, кристаллизуется прямо из концентрированного гидролизата, насыщенного хлористым водородом, цистин и тирозин отделяют благодаря их плохой растворимости в воде. Селективное отделение ароматических аминокислот удается выполнить с помощью адсорбции на активированном угле. Полученную при гидролизе смесь аминокислот лучше всего разделить хроматографически. Выделению отдельных компонентов предшествует обычно разделение на кислые, основные и нейтральные группы аминокислот, при этом большое значение имеют электрофорез и специфические иоиообменники. Раннее распространенные методы разделения, такие, как фракционная перегонка эфиров (по Фишеру), экстракция моноаминокарбоновых кислот н-бутиловым или амиловым спиртом (по Дакину), осаждение гексоновых оснований лизина, аргинина и гистидина фосфорновольфрамовой кислотой или флавиановой кислотой, теперь имеют только второстепенное значение. [c.39]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

В сернокислых растворах методом электрофореза найдены комплексы как катионного, так и анионного типов (последние преобладают в концентрированной H2SO4) [3, стр. 273]. В докладе Рабидо и сотр. [186] приводятся константы устойчивости ионов PuS04 и Ри(504)2 , равные соответственно 10 и 50. [c.39]

Электрохимические методы, характеризующиеся быстротой выполнения и избирательностью, применяются для удаления мешающих элементов и для выделения или концентрирования элементов с целью последующего их определения. Эти методы часто выгодно отличаются от других тем, что разделение проводится без введения дополнительных реактивов. Электролиз и электродиализ при контролируемом потенциале обеспечивают возможность избирательного извлечения элементов из раствора. Методы электрофореза и электромиграцин могут быть использованы для целей разделения и исследования состояния микроколичеств элементов в растворах. [c.181]

Одним из наиболее значительных преимуществ этого метода является его пригодность для исследования очень небольших количеств белка или пептидов. Это особенно ценно, например, для анализа разбавленных элюатов, получаемых при хроматографии и гель-фильтрации. Диск-электрофорез позволяет анализировать эти элюаты без предварительного концентрирования. [c.92]

Методика опыта. В пробирку вносят 1—2 мл испытуемого раствора сахара (в зависимости от его концентрации). Доводят объем, если это необходимо, дистиллированной водой до 2 мл. Приливают 0,05 мл водного раствора фенола (92 г свежеперегнанного фенола и 8 мл воды) и 5 мл химически чистой концентрированной Н2804 ( 1 = 1,84). Содержимое пробирок перемешивают и дают отстояться в течение 1 ч. Параллельно ставят контрольный опыт пустых непроявленных участков хроматограммы В. Количество сахара в пробе определяют в фотоэлектроколориметре с фильтром № 4 ( 1, = 500 нм) в кюветах с толщиной 1 см. Результат вычисляют по одной из кривых (рис. 38). Для получения достоверных результатов проводят не менее трех параллельных определений. При этом элюаты сахарных пятен необходимо тщательно освободить от волокон бумаги. Погрешность метода 5%. Сахара можно анализировать и методом электрофореза на бумаге, в котором используют боратные буферные растворы. [c.161]

Повышение чувствительности определения как за счет появления современных способов детектирования (ЛИФ и масс-спектрометрия) [82, 91], так и вследствие разработки оперативных вариантов концентрирования пробы ([109-111, 165, 166]) обеспечили доступ капиллярному электрофорезу к следовому анализу [138]. Многие лекарственные препараты находятся на уровне ниже пределов обнаружения для КЭ и ВЭЖЗС. Описаны методы повышения чувствительности при одновременном детектировании нескольких лекарств с использованием комбинированного варианта им-муноферментного, лазерно-инд5Щ1фованного детектирования и КЭ [182]. [c.366]

Первым этапом любого анализа, в том числе с использованием метода КЭ, является отбор и подготовка пробы. Отобранная проба должна быть представительной (т.е. не отличаться по качественному и количественному составу от анализируемого материала), а процедура отбора пробы— легко воспроизводимой [24]. При необходимости проводят консервацию пробы [78]. Время хранения отобранных проб перед анализом должно быть минимальным, а условия и способы хранения должны исключать неконтролируемые изменения состава пробы за счет испарения, окисления и фотодеградации [32]. На этапе подготовки пробы к анализу проводят удаление мешающих веществ, выделение и концентрирование определяемых соединений, их превращение в более удобные аналитические формы [24]. Необходимость выполнения всех или только некоторых из перечисленных процедур обусловливается природой анализируемого объекта и свойствами содержащегося в нем доминирующего вещества. Так, например, зонный вариант капиллярного электрофореза с УФ-детекти- [c.368]

Частичная очистка белков и полипептидов может быть достигнута осаждением концентрированными растворами солей, органическими растворителями или путем образования определенных соединений [31, 175]. Для очистки применяются также физические методы ультрацентрифугирование [175], электрофорез [179] и противоточное распределение [36, 187]. При любом методе очистки необходимо иметь критерий гомогенности белка или пептида. Даже кристаллическое состояние не может служить однозначным критерием чистоты [166]. В литературе имеются данные, которые дают возможность предположить, что многие высокоочищенные белки микрогетерогенны [32]. Тесты на гомогенность обычно включают иммунологические испытания, ультрацентрифугирование, электрофорез, диффузию, хроматографию и определение ферментативной или биологической активности [32]. [c.387]

При применении этого метода наносят очень небольшие количества концентрированного раствора исследуемого препарата на старт в виде узкой полосы. В результате электрофореза (может быть приложена весьма высокая разность потенциалов, поскольку в геле подавляются конвекционные токи) смесь будет разделяться на ряд зон, что позволяет получить более высокое разрешение, чем при работе по методу свободной границы. Более того, можно варьировать средний размер пор и распределение пор по размерам для некоторых поддерживаюш,их сред (крахмал, агар, полиакриламид) таким образом, что действие одного из факторов, влияюш их на электрофоретическую подвижность, а именно гидродинамического сопротивления, будет столь велико, что часть молекул будет практически неподвижной [30]. Электрофоретические подвижности в гелях или на бумаге нельзя непосредственно сравнивать с электрофоретическими подвижностями, измеренными методом свободной границы, кроме тех случаев, когда рассматриваемые молекулы малы по сравнению с размерами пор в поддерживающей среде. Компактные белки с молекулярным весом вплоть до 50 ООО легко диффундируют в 5%-ном полиакриламидном геле, и даже с веществами большего молекулярного веса можно получить хорошие результаты. Бумагу или гелевый блок нужно окрасить, чтобы показать положение различных компонентов можно также сделать перенос на подходящим образом вырезанный кусок фильтровальной бумаги, хотя эта методика часто малочувствительна. Обычные красители, применяемые для обнаружения белков (нигрозин, амидовый черный), дают удовлетворительные результаты для многих гликонротеинов, но некоторые эпителиальные вещества, которые могут представлять собой по существу углеводы (до 90%), окрашиваются довольно плохо. Было найдено, что для кислых гликонротеинов лучше применять толуидиновый голубой [32] или муцикармин [33], а алциановый голубой окрашивает как кислые, так и нейтральные гликопротеины [34]. Наиболее общей методикой окрашивания является, по опыту автора, методика Райдона и Смита [35] (хлорирование и обработка смесью крахмала и иодистого калия), но она неприменима на полиакриламидных гелях. [c.47]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

По этому методу электрофорез в первом направлении проводят в цилиндрическом геле, заключенном в стеклянной трубке, а во втором —на пластине геля. После первого разделения гель необходимо уравновесить с буфером, используемым во втором направлении. Один способ такого уравновешивания состоит в простом вымачивании геля в буферном растворе. Однако в этом случае для достижения нужного pH требуется несколько часов, а за это время может произойти расширение зон в результате диффузии и частичное вымывание белков из геля. Другой путь изменения pH предложили Авитал и Элсон [68]. После первого разделения при щелочном pH гель подкисляли, помещая его на несколько минут в пары концентрированной соляной кислоты или в ее разбавленный раствор. [c.230]

Несмотря на значительные преимущества методов, устраняющих этап концентрирования, без него, очевидно, нельзя обойтись в тех случаях, когда требуется детальный анализ белков СМЖ, включая минорные компоненты. Многие из этих белков можно обнаружить, повысив разрешающую способность электрофореза в полиакриламидном геле путем использования градиента концентрации геля [1454], особенно в преальбуминовой [c.362]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

Так как арбовирусы очень лабильны, то для очистки и концентрирования их используют мягкие методы осаждение иротаминсульфатом и полиэтиленгликолем, обработка в двухфазных полимерных системах, хроматография на фосфате кальция и электрофорез в градиенте плотности. Но наиболее широкое применение, особенно на заключительном этапе очистки, нашли методы зонального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и равновесное центрифугирование в хлористом цезии. [c.8]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология