Белки, кривая диссоциации

Кривая активности ферментов при различных значениях pH имеет много общего с кривой диссоциации амфотерных электролитов (белков). По мнению некоторых исследователей, это объясняется тем, что ферменты имеют наибольшую активность в изоэлектрическом состоянии (стр. 21.) [c.117]

Исследование кинетики диссоциации комплексов В1 и Вг позволяет из выражений (12.30) — (12.31) определить кинетические константы диссоциации. Помимо этого изучение кинетики диссоциации комплексов В] и Вг дает возможности сделать вывод о принадлежности исследуемых комплексов к комплексам белка с одним лигандом (кинетическая кривая диссоциации комплекса 61 описывается суммой двух экспоненциальных членов (уравнение (12.30))) или двумя лигандами (кинетическая кривая диссоциации комплекса описывается одной экспонентой (уравнение (12.26))). [c.306]

Почему миоглобин неспособен транспортировать кислород, но зато эффективно его запасает Количество кислорода, связывающегося с миоглобином ( процент насыщения ), зависит от концентрации кислорода в среде, непосредственно окружающей молекулу белка (эту концентрацию выражают как —парциальное давление кислорода). Зависимость между количеством связанного кислорода и Р можно представить графически в виде кривой насыщения миоглобина кислородом (кривой диссоциации кислорода). Для миоглобина изотерма адсорбции кислорода имеет форму гиперболы (рис. 6.7). [c.55]

Правда, в белке имеются различные кислые и основные группы, но формула (V. 5) остается приближенно правильной, если отнести значения Ка Кв наиболее сильным группам. Для полного определения молярного содержания различных ионо генных групп в белке и их констант диссоциации измеряют ход поглощения Н+ - и 0Н - ионов в широком интервале pH (примерно, pH 2—12), прибавляя к белковому раствору различные количества кислоты или щелочи и измеряя равновесное pH водородным или стеклянным электродом. При помощи этих кривых титрования белков определяют также максимальную емкость поглощения кислот и оснований, т. е. максимальное число зарядов на белковой молекуле. Например, для сывороточного альбумина человека при pH = 2 эта величина составляет 7]о = 100 элементарных зарядов на молекулу белка. [c.114]

Электрические заряды на коллоидных частицах возникают в результате преимущественной адсорбции одного из ионов электролитов из раствора или диссоциации собственных ионогенных групп. Независимо от механизма возникновения зарядов на коллоидных частицах, при достаточной плотности расположения зарядов, образуется двойной электрический слой, состоящий из зарядов на поверхности и из компенсирующих ионов в растворе при этом, по теории Штерна, компенсирующие ионы частично входят в прилегающий к поверхности адсорбционный слой, а частично — в диффузную часть двойного слоя. Изучение заряда поверхности методом электрокапиллярных кривых (на ртути, V. 4) и кривых титрования (золи AgJ, растворы белков) позволили определить точки нулевого заряда (в белках — изоионную точку, V. 5) и установить их смещение в растворах различных электролитов. [c.132]

Для разделения кислотной и нейтральной ветвей кривой титрования белка используется зависимость кривых титрования от температуры, характеризуемая теплотой диссоциации [c.36]

Правда, в белке имеются различные кислые и основные группы, но формула (У.8) остается приближенно правильной, если отнести значения и к наиболее сильным группам. Для полного определения молярного содержания различных ионогенных групп в белке и их констант диссоциации измеряют ход поглощения ионов Н и ОН в широком интервале pH (примерно pH = 2—12), прибавляя к белковому раствору различные количества кислоты или щелочи и измеряя равновесное значение pH водородным или стеклянным электродом, что позволяет построить кривую электрометрического титрования белков. Значение pH, при котором избирательное поглощение Нили ОН ионов по кривой титрования равно нулю, т. е. оба иона поглощаются в равной мере, и составляет изоионную точку белка. [c.102]

В основе теоретического объяснения приведенных в предыдущем параграфе экспериментальных данных, относящихся к свойствам адсорбированных ферментов, лежит следующая модель. Предполагается, что в адсорбционном слое белка путем обратимых процессов ассоциации и диссоциации возникают ферментные комплексы, содержащие одну, две, три, четыре и т. д. глобулы. Состав адсорбционного слоя зависит от поверхностной концентрации — степени заполнения поверхности 6. Заранее не делается никаких предположений о каталитической активности тех или иных комплексов, но определенные выводы часто удается сделать путем сопоставления наблюдаемой на опыте кривой зависимости каталитической активности от 6 с теоретическими кривыми, выражающими зависимость относительной концентрации тех или иных комплексов от общей степени заполнения. Теоретическая задача состоит в том, чтобы при каждом значении общей степени заполнения поверхности определить состав адсорбционного слоя [3]. [c.288]

Ценную информацию о кислотно-основных свойствах белков можно получить при помощи кривых титрования. Способность различных групп к диссоциации или присоединению протонов не зависит от того, присутствуют ли эти группы в составе аминокислоты, пептида или белка. Во многих случаях даже константы диссоциации ионизируемых групп мало зависят от влияния других участков молекулы. Таким образом, зная аминокислотный состав белков, можно на основании значений р/С для ионизируемых групп предсказать поведение белков при элект- [c.213]

Если же при электрофорезе во втором направлении применяют буферную систему с другим pH, то наблюдается иная электрофоретическая картина. В этом случае на разделение влияют изменения в характере диссоциации определенных групп белковой молекулы. Все белки с идентичными кривыми титрования будут располагаться на прямой, проходящей через точку нанесения пробы, а компоненты с другими кривыми титрования будут находиться вне этой линии. На практике следует менять и буферную систему, и концентрацию геля. [c.228]

Рис. 86. Кинетическая кривая диссоциации комплекса ( Н)-налоксон — рецептор (а) и представление этой кривой в полулогарифмических координатах (б). Условия ( Н) -налоксон с удельной активностью 60 Ки/ ммоль в концентрации 1 нМ мембраны коры головного мозга крыс в концентрации 1,5 мг белка/мл 4°С. Диссоциация инициирована добавленн-ем 10 М немеченого налоксона (экспериментальные результаты Зайцева, Курочкина, Поро-денко)

По кривой диссоциации белка можно определить роль свободных кислых и основных групп отдельных аминокислотных остатков. Активными кислотными и основными группами белка являются карбоксильные группы аспарагиновой и глютаминовой кислот, имидазольная группа гистидина, аминогруппа лизина, фенольн ая группа [c.160]

Формальдегид представляет собой, вероятно, самый простой и наиболее часто применяемый реагент, но механизм его реакции с белками, повидимому, наименее ясен. Обширная литература по этому вопросу собрана в обзоре Френча и Эдсалла [1]. Влияние, оказываемое формальдегидом на кривые титрования аминокислот и белков, хорошо известно и изложено в статье IV т. II. Этот способ является самым старым и наиболее обычным методом титрования в смешанных растворителях, однако для его интерпретации потребовались многолетние исследования. Леви [НО — 113] впервые систематически проанализировал быстрое из- менение кривых диссоциации белков ли аминокислот, вызываемое добавлением формалина при комнатной температуре. В своем исчерпывающем обзоре Френч и Эдсалл [1] следующим образом резюмируют выводы Леви 1) С формальдегидом реагируют только незаряженные амида- или иминогруппы 2) продукты присоединения формальдегида являются настолько слабыми основа- [c.310]

Во второй категории имеет место тот случай, когда комбинация металла с белком меняет свойства последнего. Если металл объединяется с белковой молекулой, то следует ожидать, что общий заряд комплекса будет отличаться от заряда, первоначально присущего белку. Такое изменение заряда может непосредственно влиять чисто электростатическим путем на сродство фермента к субстрату. Электростатический эффект может проявляться и иначе. Известно, например, что кривые титрования белков заметно изменяются после их связывания с металлами. В результате связывания группы, определяющие каталитическук> активность, могут иметь кривые диссоциации, заметно сдвинутые вдоль шкалы pH. Электростатический эффект связанного в комплекс металла может влиять на равновесие между мономерной и димерной формами ферментов (2Ф Фг). Если, например, Ф заряжен отрицательно, то комбинация с катионом должна способствовать образованию Фг. Если Фг — энзиматически активная форма, то присутствие металла должно увеличивать активность. [c.38]

В частицах лиофобных золей всегда содержится компактное ядро, лишенное электрических зарядов. Напротив, в частицах белков и полиэлектролитов подобное ядро отсутствует, и они по всей своей массе несут способные к диссоциации ионогенные группы. В белках ионогенные группы имеют различную химическую природу — кислые карбоксильные, основные амино-группы и др., вследствие чего белки относятся к классу амфотерных электролитов. При крайних рн резко преобладает диссоциация групп одного знака и, например, при рН-2 белковая молекула несет лишь положительные заряды. Однако тот же заряд при кислых рн можно представить, по Бьерруму и Линдер-штрем-Лангу, обусловленным не диссоциацией солеобразных аминогрупп, а адсорбцией Н+-ионов из раствора и подавлением диссоциации СОО -групп на белковой молекуле. При любом предположении белковая молекула при данном pH несет точно определенное число зарядов, а компенсирующие ионы располагаются в растворе с определенной плотностью распределения, что, соответственно, измеряется при помощи кривых титрования и электрофоретической подвижности (см. ниже). [c.105]

Возможность получения количественных данных по связыванию для взаимодействия белков с иммобилизованным пептидом впервые исследована Гавронским и Уолдом [8]. Определена константа диссоциации, равная (2,5 1,0) 10 моль/л, путем прямого титрования 5-белка рибонуклеазы, связанного с 5-пептидом, иммобилизованным на агарозе. Хорошие кривые титрования получены при концентрации 8-белка 10 —моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано соотношением [c.58]

Все белки содержат разнообразные кислотные и основные участки. В некоторых белках равновесие этих участков с ионами водорода определяется с большим трудом, так как возрастание заряда при титровании иногда может сопровождаться необратимыми изменениями конфигурации ( денатурацией ). Однако в случае многих белков, макромолекулы которых невелики, такие трудности не возникают вообще или же появляются только в крайних областях кривой титрования. В этих случаях равновесие легко определяется экспериментально и с некоторым приближением подчиняется уравнению (30-1). Если рассматриваемые белки глобулярны, их макромолекулы могут быть компактны и непроницаемы для растворителя в широком интервале pH, и поэтому фактор электростатического взаимодействия ш, входящий в уравнение (30-1), может быть выведен из уравнения (26-30) для и определяется выражением (29-32). Характеристические константы Кхзр. должны соответствовать константам диссоциации малых молекул, содержащих те же самые диссоциирующие группы. [c.626]

По крайней мере некоторые из этих отклонений от приближенной теории могут быть объяснены при использовании более реалистичной схемы расчета кривой титрования. Другие отклонения, видимо, связаны с особенностями конформации. Например, хорошо известно, что фенольные ОН-группы могут создавать довольно прочные водородные связи с атомами, имеющими свободные-пары электронов. Энергия разрыва такой связи равна около 6000 кал1моль. Если бы каждая фенольная группа молекулы белка участвовала в образовании водородной связи, АН1ар. отщепления протона увеличилась бы на 6000 тл, так как отщеплению протона предшествовал бы разрыв водородной связи. Энтропия диссоциации также изменилась бы, так как можно ожидать, что образование водородных связей в белках должно ограничивать свободу вращательного движения боковых групп. (Например,, вращение вокруг ординарной связи между СНа-группой и бензольным кольцом в фенольной СНз—СбН —ОН-группе должно сопровождаться вращением атома водорода гидроксильной группы вокруг оси, параллельной этой связи если атом водорода связан водородной связью, то ясно, что такое вращение невозможно.) Таким образом, энтропия фенольной группы, участвующей в образовании водородной связи, ниже энтропии свободной фенольной группы, и поэтому величина А5 р. для отщепления водородного иона от фенольной группы должна быть соответственно более положительной, чем обычно. Ласковский и Шерага оценили, что изменение величины А5хар. может достигать 20— [c.633]

Остановимся теперь на изучении электрохимических свойств белков. Мы уже упомипалп, что макромолекулы белков, как правило, несут па себе заряд. Результирующий суммарный заряд белковой макромолекулы представляет собой разность полон<и-тельных зарядов боковых групп лизина, аргинина, гистидина, а также концевых аминогрупп и отрицательных зарядов, которые несут боковые радикалы глютаминовой и аспарагиновой кислот, тирозина и цистеина, а также концевые карбоксильные группы полипептидных цепей. Так как все эти группы, как положительные, так и отрицательные, относятся к классу слабых оснований и кислот, то степень их диссоциации сильно зависит от pH. В принципе можно охарактеризовать каждый тип боковых групп своей константой диссоциации K или своей величиной показателя и можно ожидать, что, снимая кривую титрования белка, мы найдем ряд значений рН , при которых на кртшй титрования [c.123]

Если бы все было так просто, то нетрудно одним снятием кривой титрования определить количество и качество различных ионогенных боковых групп белка. Однако на самом деле реальная картина оказывается песравпеппо более сложной. Действительно,, рассмотрим для конкретности диссоциацию СООН-групп. В уксусной кислоте рК этой группы равняется 4,8. В полимерном электролите полиакриловой кислоты рК составляет 5,5. Некоторое уменьшение диссоциации СООН-групп объясняется в этом случае дополнительным электростатическим взаимодействием протонов с соседними анионами макромолекулы. [c.124]

Диксон разработал метод, который позволяет на основе данных по ферментативной кинетике идентифицировать функциональные группы, входящие в активный центр фермента. Если связывание субстрата или сам катализ сопровождаются диссоциацией функциональных групп белка или субстрата, то, используя кривые, характеризующие зависимость величин lg Утах, — gKм и lgvo от pH, можно приблизительно определить природу этих функциональных групп К В благоприятных случаях на графиках будут наблюдаться резкие перепады при значениях pH, соответствующих значениям рКа функциональных групп, непосредственно участвующих в ферментативном акте. Как известно, многие ферменты содержат каталитически важные сульфгидрильные и имидазольные группы, и приходится лишь сожалеть, что теплоты ионизации этих двух групп почти одинаковы. Если бы это было не так, то, используя метод Диксона, а также уравнение (4.51), можно было бы не только обнаруживать, но и различать эти два вездесущих нуклеофила. [c.248]

Изучение кинетических кривых изотопного обмена широко используют для оценки динамической подвижности белка в разных конформационных состояниях. Оказалось, например, что отрыв гема от гемоглобина или диссоциация этого белка на субъединицы приводят к небольшому увеличению объема апобелка и возрастанию конформационной подвижности с одновременным исчезновением рН-зависимых изменений внутримолекулярной подвижности. В лигандных формах гемоглобина по сравнению с нелигандной дезоксиформой смещение атома Fe вместе с гистидином к гемовой плоскости увеличивает локальную подвижность. У цитохрома с скорость обмена в окисленной менее компактной форме — феррицитохроме — выше, чем в восстановленной — ферроцитохроме. [c.265]

Из приведенных зависимостей видно, что кривые изменения электрофоретической подвижности с изменением pH напоминают кривые кислотно-основного титрования для определения константы диссоциации ионогенного соединения, с той существенной разницей, что благодаря специфичности метода позволяют селективно определять константу диссоциации только для поверхности. Сорбенты 4 и 5 с высоким содержанием белка (п 30) имеют значения изоэлектрической точки, практически совпадающие с изоэлектрической точкой альбумина. Это можно объяснить только исчезающе малым влиянием сульфогрупп вследствие полного экранирования исходьюй сульфоповерхности. [c.558]

Предполагается, что сушествуют две формы взаимодействия белков с ионообменниками в процессе адсорбции. Одна из них называется необратимым , а другая обратимным связыванием. Как отметил Петерсон [39], термин необратимое связывание неудачен, так как он подразумевает, что адсорбированный белок уже не выходит из колонки связывание такого типа нельзя было бы использовать. Переходы от так называемой необратимой адсорбции к обратимой вследствие непрерывного изменения состава буфера должен быть постепенным. Вероятность того, что диссоциация молекулы белка происходит за 1 с при обратимой адсорбции, может составлять 99%, а при необратимой — 0,001 % (эта величина никогда не бывает равной нулю) однако положение границы между этими двумя типами адсорбции — поистине весьма спорный вопрос. Указанную вероятность можно рассчитать из кривых зависимости адсорбции от pH, показанных на рис. 4.4, но часто используют другой способ выражения распределения адсорбированного на ионообменнике и неадсорбированного белка. Серия недавно проведенных экспериментов, аналогичных тем, результаты которых изображены на рис. 4.4, показала возможность перехода адсорбированной формы белка (коэффициент распределения близок к 1) в неадсорбированную (коэффициент распределения равен 0) [c.103]

При изменении pH буфера [38]. Расчеты, сделанные на основе этих кривых и уравнений, приведенных в разд. 4Л, позволяют количественно оценить величины констант диссоциации (допуская, что условия приближаются к равновесным) между белком и адсорбентом. В этих работах в качестве адсорбента была использована КМ-целлюлоза. Оказалось возможным не только рассчитать величины а и Кр, но исходя из скорости изменения этих величин в зависимости от pH получить величину энергии взаимодействия в расчете на единичный заряд белка. (Практически это 1 корость повышения энергии взаимодействия в расчете на каждый дополнительный положительный заряд, так как асимметрия в распределении зарядов и отсутствие данных о точных значениях изоэлектрических точек создает трудности при установлении точного числа зарядов белковой молекулы, участвующих во взаимодействии с адсорбентом.) Вывод уравнений, связывающих эти парамет1ры, представлен ниже, а также на рис. 4.7. [c.104]

Пример 14-Д. Спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величины р/С диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке (правило 2 в табл. 14-2). Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации зачастую меняется спектр одного из хромофоров (например, в случае тирозина) см. рис. 14-7. Рассмотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для определения числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2 (табл. 14-2). Предположим, что в этом белке имеется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении pH, спектр, отвечающий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свободного тирозина при высоких значениях pH, изображенному на рис. 14-7 (правило 26). Другими словами, зависимость "Огаз ( макс для ионизованной формы) от pH будет выглядеть, как кривая А на рис. 14-17. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, полученная кривая аналогична кривой Б (правило 2а) отношение величины первого плато к конечной величине равно Отметим, что при очень высоких pH на кривой видно большое возрастание 0295. Это указывает на то, что внутренние тирозиновые остатки стали доступны растворителю, т. е. белок развернулся (денатурировал). [c.399]

Рис. 6.8. Спектрофотометрическое титрование метгемоглобина (Ме1НЬ) инози-толгексафосфатом (1НР). При 512 и 649 нм поглощение комплекса увеличивается, а при 640, 618, 588 и 559 нм остается постоянным. Концентрация метгемоглобина в расчете на тетрамер (20 мкМ) примерно в 14 раз превышает константу диссоциации (1,4 мкМ) этого комплекса. Точка пересечения касательной к начальному участку кривой с плато дает стехиометрию связывания (в данном случае 1). Заметим, что этот простой метод нельзя использовать, если начальная концентрация белка не очень сильно превышает константу диссоциации, поскольку предполагается, что весь лигаид связы вается белком сразу после добавления.

Отличительным признаком диссоциативного механизма инактивации субъединичных белков является его проявление только при определенных концентрациях фермента и в интервале температур от 50 до 60°С, когда речь идет о термоинактивации [14-16]. В нашем случае при УЗ-инактивации уреазы один из признаков диссоциативного механизма (излом полулогарифмической анаморфозы кинетической кривой падения активности) четко проявился только при концентрации уреазы 25 нМ и температуре 50°С (рис. 4,1). В других случаях (при повышении концентрации фермента или изменении температуры озвучиваемых растворов) изломов анаморфоз не зарегистрировано. Однако это не означает полного отсутствия стадии диссоциации гомогексамера, которая мо- [c.129]

Следует отметить, что при УЗ-инактивации (27 кГц) другого субъединичного фермента -глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФДГ) стадия диссоциации белка при его озвучивании четко проявляется на полулогарифмических анаморфозах кинетических кривых инактивации фермента в концентрации 38.5 нМ при 35 5°С [17]. Так как сонолиз уреазы и Г6ФДГ проводился в одинаковых условиях (27 кГц, 60 Вт/см ), различия в поведении ферментов в поле УЗ-кавитации связаны только с их природой. [c.130]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология