Белки, физические константы

Таким образом, различия в константах равновесия между двумя белками могут быть обусловлены различиями между энергиями конформационного перехода и сольватации двух участвующих в равновесии комплексов (например, Ре и Ре Юг) в каждом из этих белков. Одинаковые константы равновесия могут быть, например, у белка, в котором два компонента равновесия имеют сильно искаженную структуру, и у белка, где такое искажение структуры не имеет места. Все это крайне затрудняет любую попытку поиска корреляций физических и химических свойств. Еще два фактора ограничивают возможность выделения в чистом виде эффектов различной природы. Во-первых, пока не удалось получить и исследовать ни одного небелкового и ненапряженного железопорфирина, который содержал бы только один связанный имидазол (или гистидин), чтобы его можно было использовать как основу при сравнении свойств. Мы можем поэтому сопоставлять только физические и химические свойства одного белка с физическими и химическими свойствами другого. Во-вторых, рентгеноструктурный анализ таких больших молекул позволяет обнаружить только сравнительно большие изменения структуры у металла и его лигандов. Спектроскопические методы позволяют зафиксировать менее значительные, но все еще функционально важные изменения структуры, одна- [c.171]

Там, где это было возможно, в таблицах приведены различные физические константы. В целях сравнения была сделана попытка построить таблицы таким образом, чтобы белки одинакового происхождения или с одинаковой биологической функцией группировались вместе. Такой принцип построения таблиц, однако, не мог быть строго выдержан, и некоторые таблицы содержат белки, не имеющие общих свойств. [c.228]

Исследования белков развиваются по трем путям. Один из них заключается в изучении химии амииокислот, составляющих белки, и представлен работами Эмиля Фишера и других исследователей. Другой путь предпочитается исследователями, изучающими поведение белков в целом и определение их физических констант. Первый путь особенно привлекает химиков-органиков, которые видят в аминокислотах объект, доступный для исследования привычными им методами. Второй путь развивается главным образом физико-химиками, методы которых приспособлены для исследования макромолекул природных веществ, подобных белкам. [c.213]

Крайний случай конформационно о изменения — денатурация белков, которая может быть вызвана нагреванием или обработкой различными реагентами, например сильными кислотами и основаниями, мочевиной, гуанидингидрохлоридом и додецилсульфатом натрия. Денатурация приводит к развертыванию молекулы белка, и он переходит в более или менее разупорядоченное состояние (здесь уже почти нет ни спиралей, ни (3-слоев, ни любых других типов регулярной укладки цепи). В денатурированном состоянии амидные группы пептидной цепи образуют водородные связи с окружающими их молекулами воды таких водородных связей значительно больше, чем внутримолекулярных. Специфическая биологическая активность белка при денатурации теряется, изменяются и физические свойства, например меняется константа седиментации, вязкость и поглощение света. Легкость, с которой происходит денатурация белка, и тот факт, что денатурация в принципе обратима, свидетельствуют о том, что различия в энергии между свернутыми конформациями и открытой конформацией статистического клубка невелики. [c.105]

Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментации биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, используемых для седиментации. [c.267]

При анализе некоторых материалов диффузия может уменьшаться в результате изменения физических свойств образца в процессе дегидратации. Например, при анализе сиропов может значительно повыситься их вязкость, так как при понижении содержания воды уменьшается константа диффузии, или же сироп может кристаллизоваться с образованием на его поверхности корки [270 ]. При дегидратации белков возможна их коагуляция [c.73]

Вирус табачной мозаики (ВТМ). Из всех вирусов наиболее хорошо изучен растительный вирус табачной мозаики. Тем не менее сведения, которыми мы располагаем в настояш,ее время, вероятно, еще далеко не достаточны для полного описания его строения. Физические исследования показали, что ВТМ представляет собой тонкий стержень длиной 3000 А и диаметром 150 А. Вес такой частицы равен 39- 10 . Из этого числа 5% приходится на РНК, константа седиментации которой равна 27S, а молекулярный вес 2,0 10 . Если бы цепь РНК вируса полностью вытянуть, она была бы в 10 раз длиннее вирусной частицы. Остальные 95% вируса приходятся на белок, который состоит из 2130 идентичных субъединиц. В состав каждой субъединицы, имеющей молекулярный вес 17 420, входит 158 аминокислот. Белок вируса табачной мозаики является третьим белком после инсулина и рибонуклеазы, для которого полностью установлена последовательность аминокислот. Каждая белковая субъединица представляет собой единую полипептидную цепь, на N-конце которой находится ацетилированный серии. Это один из редких случаев особой модификации N-конца полипептидной цепи. Различные штаммы этого вируса отличаются по аминокислотному составу белка. У всех исследованных штаммов белковая часть содержит только один остаток цистеина. В некоторых штаммах отсутствуют метионин и гистидин. [c.359]

После того как была обнаружена идентичность констант связывания металла с двумя центрами белка, тотчас же возник вопрос, идентичны ли сами связывающие центры. Эту проблему особенно трудно решить для белков, построенных из одной полипептидной цепи. И физиологические, и физические исследования пролили свет на эту еще не до конца решенную проблему, к которой мы ниже вернемся. [c.343]

Наиболее широко распространено представление о том, что дезактивация (3-каротином, взаимодействующим с ним преимущественно по физическому механизму, связана с переносом энергии от синглетного кислорода на низколежащий триплетный уровень каротина. Обсуждается вопрос о вкладе в рассматриваемый процесс комплекса с переносом заряда между и каротином. Константа скорости дезактивации синглетного кислорода близка к диффузионной и составляет для СС1 740 л (моль-с) . Гистидин относят к типу акцепторов 0 его дезактивация осуществляется химическим путем. Константа скорости для этой аминокислоты составляет 540 л-(моль с)" в метаноле в — 10 л-(моль с)" В реакцию с Юз вступает только непротонированная форма гистидина. Из анализа рис. 54, б следует, что Р-каротин в концентрации 3,340 моль/л оказывает защитное действие по отношению к молекулам ЛДГ (М ) активность УФ-облученного в дозе 2,27 кДж/м белка восстанавливается на 18 % по сравнению с таковой в отсутствие протектора. Гистидин в концентрации 3,340 моль/л снижает степень инактивации ЛДГ на 19 % (см, рис, 54, в), что согласуется с данными, полученными при использовании [3-каротина. [c.191]

На первой стадии процесса происходит трансформация исходного лимитирующего субстрата под действием фермента (или ферментной системы) Е с образованием ключевого метаболита У. Этот процесс представляет собой обычную ферментативную реакцию, и кинетика его описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментен. Ключевой метаболит 5 участвует в процессе репликации и в других параллельных процессах, приводящих к накоплению клеточного материала Р. Предположим, что скорость синтеза ДНК на матрице ДНК пропорциональна концентрации промежуточного метаболита 5 и может быть охарактеризована константой скорости а . По физическому смыслу это может быть константа скорости удлинения полимерной цепи на одно основание. Важным также представляется предположение о том, что скорость биосинтеза фермента Е и белков репликационного комплекса — относительно быстрые процессы, концентрации этих компонентов постоянны и не входят в уравнения скорости процесса. Любое из этих предположений может быть неоправданно, что существенно изменит кинетическое описание, однако это не затрагивает принципы излагаемого метода. [c.601]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

Метод анализа белков, использующий влияние концентрации белка на показатель преломления раствора, был введен в 1903 г. Рейссом 1152] и позже развит Робертсоном [153]. Когда в 1925 г. физические методы анализа белков были рассмотрены Штарлингером и Гартлем [154], уже было известно, что рефрактометрический метод имеет серьезные ограничения 1 г белка, растворенный в 100 мл водного раствора, повышает показатель преломления растворителя приблизительно на 0,0018. Так как предельная чувствительность рефрактометров Пульфриха или Аббе равна 0,0001, ясно, что при пользовании этими приборами чувствительность метода меньше, чем метода удельного веса. Погружательный рефрактометр, который несколько более чувствителен, требует значительно большего количества вещества. Влияние на показатель преломления 1 г минеральной соли, растворенной в том же количестве раствора, имеет тот же порядок величины, что и для 1 г белка, и может даже быть значительно больше. Поэтому для обычных анализов обсужденные ранее предположения могут оказаться несправедливыми. При надлежащей осторожности метод применим в той же степени, что и другие методы определения физических констант. Критический анализ условий приложения метода к анализу казеина в сливках молока дал удовлетворительные результаты [155]. Казеин сперва осаждался и промывался, а затем снова растворялся для определения. Аналогичная методика была осуществлена для серума крови Зибенма-ном[156], который измерил различие в преломлении дон после тепловой коагуляции белков при pH 4,6, и для сока картофеля Вольфом [157], который применял интерферометр, дающий большую точность, чем рефрактометр, и удалял белок кипячением и фильтрованием. См. также работы по применению метода показателя преломления для анализа белков серума [158, 159]. [c.31]

Массу белка можно также определить эмпирически при помощи большого числа нефелометрических, турби-диметрических и объемных методов. Их преимущество состоит в приложимости к малым количествам вещества и в быстроте для обычных анализов. Однако эти методы совершенно эмпиричны и содержат большое количество возможных ошибок. Вообще же они сильно зависят от воспроизводимости условий и калибрации по другим (эмпирическим) методам. Определения, повидимому, менее воспроизводимы, чем измерения физических констант, а интерпретация результатов вряд ли легче. [c.33]

Диксон и Нейрат [152] попытались непосредственно наблюдать образование N-ацилимидазольных производных при ацилировании химотрнпсина -нитрофенилацетатом. В отличие от первоначальных результатов [138] эти исследователи показали, что на стадии ацилирования можно наблюдать быстрое увеличение поглощения при 245 ммк, которое затем медленно убывает со временем. Зная, что N-ацетилимидазол имеет .ма. с при 245 ммк и е 3-10 , можно рассчитать, что увеличение поглощен11я обусловлено ацилированием примерно 0,4 моля имидазольных групп в 1 моле химотрипсина. Кроме того, найдено, что константа скорости первого порядка, вычисленная по убыванию поглощения при 245 ммк, близка к константе скорости деацилирования 6-хи-мотрипсина, измеренной по появлению ферментативной активности. Показано, что скорость восстановления ферментативной активности, в свою очередь, соответствует скорости деацилирования N-ацетилимидазола. Однако в настоящее время считают, что поглощение при 245 ммк не связано со стадией ацилирования, а характеризует физическое состояние белка [15, 161]. [c.281]

Интенсивные полосы в ультрафиолетовой и видимой областях спектра в основном определяются тс—т-переходами порфиринового лиганда. У большинства гемоглобйнов и миоглобинов имеются небольшие отличия в оптических спектрах, которые позволяют идентифицировать животный организм, служивший источником белка. В большинстве случаев эти различия больше для Ре -фор-мы, чем в случае Ре Юг-, Ре СО- и Ре ОНг-комплексов. Переход от свободных а- и р-цепей к тетрамерному НЬ Aj человека также сопровождается более значительными изменениями спектров в случае Ре -формы (четвертичную структуру типа Т), чем в случае Fe Oa- и Ре СО-форм (четвертичная структура типа R). Однако спектры Ре -комплексов в а- и Р-цепях в свободном состоянии аналогичны таковым в НЬ Fe , когда последний находится в состоянии R. Такая ситуация достигается непосредственно после фотолиза НЬ Ре СО, а также для ряда природных и модифицированных гемоглобйнов, для которых не обнаружено гомотропного взаимодействия [40, 195]. По-видимому, изменение четвертичной структуры, которое является ключевым моментом гомотропного взаимодействия (см. ниже), может влиять на константу равновесия главным образом путем изменения физических свойств Ре(П). Примечательное исключение составляет гемоглобин из парентеральной жидкости As aris, спектры которого в состоянии Ре , Ре СО и Pe N аналогичны спектрам гемоглобина и миоглобина млекопитающих, тогда как спектры Ре Ог существенно различаются [238]. [c.173]

То обстоятельство, что электрофоретическая подвижность мутантов отлична от подвижности нормального белка, неудивительно, ибо кислотное звено Глу заменено на незаряженное Вал илп щелочное Лиз. Интересна физическая природа самого заболевания. Дело вовсе не в потере способности гемоглобина обратимо связывать кислород. Специальные измерения показали, что константа связывания молекулярного кислорода гемоглобином одинакова у всех трех форм гемоглобина, но существенно изменяется растворимость белка, с понижением которой белок начинает кристаллизоваться внутри эритроцитов, чем и вызывает исканченную форму последних. Выпадение гемоглобина из раствора лишает его способности выполнять свою функцию, откуда и возникает анемия. Мутантные формы гемоглобина явились прекрасным доказательством того, что и в высшем организме имеются генетические области — цистроны, управляющие синтезом одпого определенного полипептида. Провозглашенный Бидлом п Тэтумом для микроорганизмов принцип один ген — один фермент нашел здесь прекрасное подтверждение. [c.417]

В последнее время появилась возможность изучать физические свойства белков такими методами, как температурный скачок, которые позволяют исследовать процессы с временами, соизмеримыми с временами каталитического превращения субстрата на ферменте, так что стало возможным непосредственно установить взаимосвязь между скоростями субстратзависи-мых конформационных изменений и скоростями самой реакции. В настоящее время имеется ун е несколько свидетельств в пользу существования изомеризации ферментов и ферментсубстратных комплексов, которые могут представлять собой конформационные изменения такого рода [49—52]. Скорость мономолекулярной изомеризации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы характеризуется константой порядка 1 с и является слишком медленной, чтобы этот процесс имел место при каждом обороте фермента по-видимому, этот процесс относится к явлениям контроля ферментативной активности. Рентгеноструктурный анализ лизоцима [28], химотрипсина [54] и карбоксипептидазы [55] дал прямое доказательство существования изменений в конформации фермента при взаимодействии с субстратами или ингибиторами. Гемоглобин, хотя и не является ферментом, но может быть поучительным примером использования всех этих методов для демонстрации конформационных изменений при взаимодействии этого белка с кислородом [56]. [c.243]

Физические и химические свойства белков, Р-ры Б. обладают рядом свойств, характерных для лиофильных коллоидных р-ров. Частицы Б. не проходят через полупроницаемые мембраны, что используется для их очистки от низко-молекулярных соединений диализом. Наличие на поверхности частиц Б. многочисленных полярных групп обусловливает их значительную гидратацию. Так, количество гидратационной воды, связанной с альбуминами и глобулинами, составляет 0,2—0,6 г на 1 г сухого веса Б. В определенных условиях Б. образуют гели (студни). Во многих случаях Б. удается получить в кристаллич. виде. Б. в р-рах седимен-тируют в ультрацентрифугах при ускорении порядка 200 000 константы седиментации (s) Б. находятся в пределах от l-10 i до lOO-lO i сек. Коэфф. диффузии Б. О,МО —10-10 см /сек средний удельный объем 0,75 см г. Эти физико-химич, характеристики используются для определения мол. веса Б., а также степени асимметрии их молекул е/а, где в и а — продольная и поперечная полуоси гидродинамически эквивалентного эллипсоида, приближенно принимаемого за форму молекулы Б. Мол. вес Б. — от 5000 до нескольких миллионов, в/а — от 1 до 200. Для определения мол. весов и размеров молекул Б. широко применяется метод светорассеяния. Мол. веса могут быт1> определены также методом осмометрии, методом исследования монослоев на поверхности жидкой среды. Размеры молекул Б. определяются методом двойного лучепреломления в потоке, измерением коэфф. вращательной диффузии. Макромолекулы некоторых Б. наблюдались в электронном микроскопе. Для изучения структуры Б. широко применяется метод рентгеноструктурного анализа и электронографии. [c.193]

Влияние остатков за пределами т 8 на вторичную структуру белка ттринято несущественным, хотя эти границы в известной степени условны. Значение т = 0 отвечает вкладу остатка, занимающего центральное положение в сегменте. Аналогичное предсказание выполняют для каждого остатка в последовательности от /=1 до =п, после чего при необходимости расчеты повторяют для любого конформациоиного состояния 5. В результате каждому из остатков приписывают то из конформационных состояний 5, для которого уровень информации имеет наивысшее значение. На практике из результатов, полученных для каждого из состояний, вычитают некоторую условную константу, зависящую от типа конформации 5. Эту константу можно рассматривать как дополнительную информацию, полученную из данных по круговому дихроизму. Необязательно знать точное содержание вторичной структуры, а достаточно отнести белок к одному из типов, например спиральному, -складчатому и т. д. Физический смысл такого приема очевиден, поскольку белок, содержащий много р-участков, будет иметь тенденцию к дальнейшей стабилизации путем кооперативного образования водородных связей в складчатой структуре. Не менее важно также, что длинные а-спирали более стабильны, чем короткие. [c.588]

Физические основы метода сложны и пока еще не до конца изучены. Чувствительность анализа определяется 1) числом частиц, 2) поверхностной плотностью антител или антигена, 3) константой связывания антител (в анализе гаптенов), 4) возможно, псевдоконстантой связывания антител (в анализе белков), 5) по-грепгаостью Пуассона при подсчете частиц в потоке, проходящем через ячейку. [c.233]

Доказать выполнимость допущения, что У = vIV, очень трудно ( или даже невозможно). Однако обычно обойтись без него не удается, так как пытаться интерпретировать кинетические данные для кооперативных ферментов, не вводя никаких упрощающих предположений, — задача совершенно безнадежная. Это не является, конечно, свойством только симметричной модели — все другие модели кооперативности также построены при некоторых допущениях. Предположение о том, что У = vIV, имеет по крайней мере то достоинство, что оно кажется весьма правдоподобным, чего нельзя сказать о ряде других допущений, используелшх в симметричной модели. Таким является, в частности, основное допущение о симметрии конформации белковой молекулы, чья спорность не уменьшается от того, что его часто используют. Симметричная модель не рассматривает молекулярного механизма, объясняющего конформационную симметрию, и с физической точки зрения неясно, почему белки, имеющие субъединичную структуру, должны обладать подобным свойством. Другое не очень обоснованное допущение состоит в том, что многие ферменты рассматриваются как истинные К-системы (в терминологии Моно, Уаймена и Шанжё). Иными словами, допускается, что хотя R- и Т-состояния могут различаться в 1000 и более раз по степени сродства к субстрату, константы каталитического распада у них совершенно одинаковы. Вопрос о том, насколько вероятно существование истинных К-систем, никогда серьезно не обсуждался в литературе. Действительно, допущение о равенстве констант скорости каталитического распада для R- и Т-форм часто рассматривается как аксиома, не требующая доказательства. [c.185]

Антитела, циркулирующие в крови, представляют собой весьма гетерогенную популяцию белков типа глобулинов, которые могут отличаться друг от друга по физическим, химическим и серологическим свойствам. Различают три основных класса иммуноглобулинов IgG (или yG) с константой седиментации ( 20, w) 7S, обычно устойчивый к действию меркаптоэтанола IgM (или М) с константой седиментации 19S, чувствительный к дех ствиго мер-каш оэтанола, и IgA (или 7А), у которого константа седиментации варьирует от 7 до 19S. [c.360]

Рассмотрим два примера. Первый пример — исследование связывания лиганда ферментом в ходе иекатализируемой реакции. При этом могут произойти два физических события связывание и индуцируемое лигандом конформационное изменение фермента. Чтобы установить число промежуточных стадий и определить соответствующие им константы скорости, прежде всего необходимо определить число времен релаксации и найти их концентрационную зависимость. В идеальном случае число времен релаксации будет равно числу стадий данной реакции. Если найдено даже одно время релаксации и его концентрационная зависимость нелинейна, это может означать, что процесс протекает в две стадии [например, уравнения (4.71) и (4.74)], Далее стоит воспользоваться несколькими физическими методами (например, исследовать флуоресценцию и поглощение лиганда и белка), поскольку некоторые стадии могут быть выявлены только с помощью одного из этих методов. В ходе рассматриваемой реакции могут протекать и другие физические процессы, например отдача или присоединение протона или изменение степени агрегации белка. В первом случае весьма полезен еще один метод — измерение pH, для чего можно использовать просто цветные индикаторы. Агрегация осложняет кинетические исследования, однако ее можно обнаружить и количественно охарактеризовать, что также даст дополнительную информацию. Для исследования простых реакций релаксационные методы часто оказываются эффективнее струевых, поскольку позволяют изучать более быстрые процессы. Однако иногда метод остановленной струи более ценен, например, при исследовании процессов, слишком медленных, чтобы применять метод температурного скачка. Кроме того, некоторые эксперименты (такие, как исследование влияния сильных изменений pH) можно осуществить только в том случае, если использовать методы, включающие быстрое смешивание реагентов (хотя небольшого изменения pH можно добиться, применив метод темпера- [c.151]

Предстационарная кинетика обладает рядом преимуществ с практической точки зрения. Она имеет дело с очень простыми по сути процессами например, с ее помощью определяют стехиометрию процесса, в ходе которого происходит всплеск концентрации продукта, находят константы скорости переноса связанных с ферментом промежуточных соединений на второй субстрат или исследуют индуцируемые лигандами конформационные изменения в белках. Кроме того, характеристики процессов первого порядка (которые обычно изучают) не зависят от концентрации фермента в отличие от констант скорости, измеряемых в стационарной кинетике. Для исследования быстрых реакций требуются очень высокие концентрации ферментов, но их значения близки к концентрациям in vivo. Более того, аналогичные концентрации обычно используются при прямом определении физического состояния белка, что позволяет получать, например, данные об агрегации в условиях, при которых протекает реакция. [c.212]

Структура антител. Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и сахаров построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Молекулярная масса иммуноглобулинов находится в пределах 150—900 кД. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80 % иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60 °С. Вьщелить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов. [c.149]