Электрофоретическая гетерогенность

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ БЕЛКА [c.15]

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ОВОМУКОИДА а) Электрофоретическая гетерогенность [c.26]

По-видимому, наиболее полное изучение иммунохимии специфического лектина провели Бойд, Шап-ли и Мак-Мастер [3]. Эти авторы нащли, что анти-А-лектин (полученный из лимской фасоли) также представляет собой глобулин. Им не удалось получить его в кристаллическом виде, и они работали с концентрированными и частично очищенными препаратами около 36% вещества специфически реагировало с А-антигеном. Частично очищенное вещество при электрофоретическом исследовании оказалось гетерогенным, но при ультрацентрифугировании было почти гомогенно. Судя по полученному значению [c.91]

Нужно отметить, что теоретически возможно проверить на гомогенность любой препарат по его реакционной способности в качестве субстрата для фермента или да ке по отношению к химическим реагентам, но при этом существенно знать, что используемый реагент удаляет или изменяет строго определенную часть или части молекулы. Более того, это изменение должно легко обнаруживаться, а реагент и продукт расщепления (если он образуется) должны легко выделяться из реакционной смеси. Такие условия выполняются не часто, и обычно эту возможность пе удается реализовать. Но действие нейраминидазы на гликонротеины является примером того, когда это возможно. Обработанный ферментом гликопротеин можно проверять на гетерогенность любым способом, но электрофоретическое исследование является, вероятно, наиболее строгой проверкой. Еще одним интересным и уникальным случаем оценки гомогенности субстрата путем его обработки ферментом служит взаимодействие фибриногена с тромбином. [c.45]

При изучении системы трансферрин — кональбумин у домашней птицы было показано, что железосвязывающие белки могут синтезироваться во многих тканях и что ген трансферрина может определять синтез различных форм белка в разных тканях. У цыплят описана гетерогенная популяция железосвязывающих белков, подобная той, которая наблюдается при сравнении белков сыворотки крови и СМЖ у человека [60]. Трансферрин сыворотки курицы и кональбумин яичного белка сходны по иммунологическим свойствам и аминокислотному составу. Оба белка образуют аналогичные продукты после обработки трипсином и химотрипсином, и тот и другой содержат аланин в качестве N-концевой аминокислоты. Генетически обусловленный полиморфизм трансферрина сыворотки цыпленка отражается в соответствующем полиморфизме кональбумина яичного белка [69]. Генетические вариации трансферрина сыворотки птиц были описаны Мюллером и сотр. [70]. Вильямс [60] показал, что обработка нейраминидазой не оказывает влияния на электрофоретическую подвижность кональбумина в крахмальном геле. Однако тот же фермент уменьшает подвижность двух компонентов трансферрина сыворотки цыпленка, образуя компоненты, соответствующие по подвижности компонентам кональбумина. Это позволило автору предположить, что трансферрин и кональбумин отличаются только по содержанию сиаловой кислоты в углеводных простетических группах. Основываясь на данных, полученных в опытах по включению меченых аминокислот в кональбумин в срезах яйцеводов, тот же автор [60] постулировал, что ген трансферрина у птиц определяет синтез как трансферрина (в печени), так и кональбумина (в яйцеводах). [c.126]

Как отмечалось в гл. 5, глобулины—это белки, нерастворимые в воде, но растворимые в растворах солей. Глобулины сыворотки—это гетерогенная сложная смесь белковых молекул, обычно называемых а-, Р- и у-глобулинами (иногда дополнительно вводят цифровые обозначения) данная классификация основана на электрофоретической подвижности (рис. 55.2). Более рациональная классификация базируется на структуре и функциях глобулинов. [c.320]

Б. Поскольку обработка нативного переносчика глюкозы ферментом, отщепляющим боковые олигосахаридные цепи, приводит к получению более четкой электрофоретической полосы, размытый характер ее должен быть обусловлен гетерогенностью углеводных компонентов, связанных с белком. Объясняется ли эта гетерогенность различной заполненностью участков на поверхности белка, способных к О- или N-связыванию олигосахаридов, либо связана с вариабельностью длины или последовательности боковых олиго-сахаридных цепей, пока неизвестно. Данная степень гетерогенности необычна, большинство гликопротеинов образуют гораздо более резкие полосы при электрофорезе в полиакриламидном геле с ДСН. Хотя на каждый эритроцит приходится до 350000 молекул этого белка (столько же, сколько гликофорина и белка полосы 3), однако в течение многих лет он оставался незамеченным. К тому же существовали противоречивые мнения относительно молекулярной идентификации переносчика глюкозы, его молекулярный вес оценивали величинами до 200000 Да. Причиной была размытость, нечеткость его полосы при электрофорезе. [c.319]

Постепенное дефосфорилирование яичного альбумина было подтверждено электрофоретическим выделением дифосфояичного альбумина Ль частичным дефосфорилированием яичного альбумина фосфатазой предстательной железы, в результате которого образуется монофосфорное производное Л2, и полным дефосфорилированием производного Л2 кишечной фосфатазой с образованием альбумина Лз, не содержащего фосфора [150в]. За исключением содержания фосфора и характера подвижности, все три белка А, Л2 и Л3 обладают сходными свойствами. Как и в случае превращения яичного альбумина в плакальбумин, изменение подвижности, которым сопровождается процесс дефос-форилирования, можно использовать для оценки изменения суммарного заряда белков. Эти результаты показывают, что в удалении каждого из атомов фосфора принимают участие два способных ионизироваться атома водорода. Установление взаимосвязи между тремя формами яичного альбумина помогает объяснить электрофоретическую гетерогенность свежеприготовленных растворов этого белка и изменения, наблюдающиеся при старении. [c.335]

Точные данные о содержании амидного азота в белках необходимы при определении в них общего азота и при изучении вопроса о том, не являются ли различия в содержании амидного азота причиной электрофоретической гетерогенности белков, как это показано для желатина [1] и предполагается для у-глобулина [2]. Для установления тонкой структуры гликопротеинов [3] очень существенно точное онределение амидного азота, но при выполнении такого анализа в этой группе веществ встречаются значительные трудности. Во-первых, при действии кислот, применяемых для освобождения амидного азота в виде аммиака из остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот белковой части, будут образовываться, по крайней мере частично, 2-ацетамидо-2-дезоксигексозы. Свободные гексозамины, образующиеся при деацетилпровапии, являются потенциальным источником аммиака в условиях его отгонки из щелочного раствора. Во-вторых, известно, что сиаловые кислоты, обычные компоненты гетеросахаридов гликонротеинов, даже в мягких кислотных условиях расщепляются с выделением части их азота в виде аммиака [4]. [c.159]

В случае электрофоретической гетерогенности орозомукоида [24] и [Зг-гликопротеина из плазмы [25] различные компоненты этих гликонротеинов отличались по содержанию в них сиаловой кислоты. В какой-то степени то же можно сказать и об овомукоиде. Содержание сиаловой кислоты в минорном компоненте овомукоида [12] равно 4%, в то время как целый препарат содержал 0,5—1,0% сиаловой кислоты, что, несомненно, обусловливает сравнительно низкую изоэлектрическую точку минорного компонента, соответствующего, по-видимому, наиболее отрицательно заряженной электрофоретической фракции, описанной Биром и сотр. [23]. Другие фракции, полученные с немощью электрофореза, не были четко разделены препаративными методами, за исключением наименее отрицательно заряженной фракции, поэтому характеристики этих фракций до сих пор неизвестны. Поскольку компонент с высоким содержанием сиаловой кислоты содержит не всю сиаловую кислоту, присутствующую в препаратах овомукоида, разница между некоторыми другими компонентами овомукоида может быть также обусловлена различием в содержании в них сиаловой кислоты. Возможны и другие различия. [c.27]

В 1892 г. Фрейнд (см. [1]) выделил из крови углеводсодержащий мукоид, в котором ему не удалось обнаружить азот. Пять лет спустя Занетти [2], фракционируя спиртом жидкость, оставшуюся после удаления большей части белков из крови уксусной кислотой, получил белковое вещество, которое после гидролиза приобретало редуцирующие свойства (содержание азота 12,93%). По последним данным, эта фракция электрофоретически гетерогенна, однако она сходна с веществом, полученным Винцлером и сотр. [3], и содержит как основной компонент (-кислый гликопротеин. Занетти [4] обнаружил в этом веществе, которое он назвал серомукоид , присутствие гексозамина. [c.68]

В настоящее время около половины идентифицированных ферментов находятся в клетках и тканях в виде множественньгх молекулярньгх форм, имеющих единую субстратную специфичность, но отличающихся по физико-хими-ческим или иммунологическим свойствам. Генетическая основа молекулярной гетерогенности обусловлена наличием нескольких генов, каждый из которых кодирует одну субъединицу фермента или одну его молекулярную форму. Кроме того, различные молекулярные формы одного и того же фермента могут кодироваться в одном генном локусе, имеющем множественные аллели. Генетически детерминированные молекулярные формы называются изоэнзимами. Посттрансляционные модификации ферментов, обусловленные локальным протеолизом, ковалентными модификациями, белок-белковыми взаимодействиями и т. д., являются причиной образования множественных молекулярных форм, не являющихся истинными изоэнзимами, но играющими существенную роль в метаболических процессах. Наиболее часто встречаются так называемые конформеры — молекулярные формы, имеющие одинаковую первичную структуру, но отличающиеся по своей конформации. Это возможно в том случае, если эти конформации достаточно устойчивы, т. е. соответствуют уровню свободной энергии, близкой к минимальной. Только такие конформационные варианты белков, которые воспроизводимо фиксируются посредством электрофоретических, хроматографических или иных методов, могут рассматриваться как конформеры. [c.83]

Проблемы, как сорбция ионов осадками, электрофоретические свойства суспензий, диффузия ионов в кристаллах, изотопный обмен в гетерогенных системах и многие вопросы, относящиеся к области структурной химии. Кроме того, для многих ненабухающих трехмерных ионообменников с жесткой структурой теоретическая обработка данных по термодинамике и кинетике ионного обмена часто бывает намного проще, чем для органических смол, даже в тех случаях, когда стерические эффекты и ограниченная взаимная растворимость твердых фаз могут приводить к осложнениям. [c.8]

Одновременное ссуществление двух процессов — электрофореза и электролиза открывает новые возможности для получения композиционных покрытий и материалов. На основе совместного электрофоретического осаждения полимеров и электрохимического выделения коллоидных металлов из дисперсий полимеров в электролите получен новый вид композиционных покрытий — металлополимер-ные покрытия [18]. В отличие от электрохимических композиционных покрытий, в которых осаждаемый металл является матрицей, цементирующей распределенные в ней частицы вещества [19], металлополимерные покрытия представляют собой гетерогенную систему, состоящую из полимерной среды и высокодисперсной металлической фазы. Особенности металлополимерных покрытий определяются тем, что частицы металла не вносятся в среду полимера извне, а формируются непосредственно в ней. Это обусловливает возможность хемосорбцион-ного взаимодействия между полярными группами макромолекул и активной поверхностью частиц металла. [c.116]

Размывание границы при электрофорезе было описано Тизе-лиусом и другими исследователями [138—141]. Были рассмотрены преимущества работы при значениях рН, близких к средней изо-электрической точке [138—141] была развита теория этого явления [140—142] и произведено исследование гомогенности ряда белков [138—144]. Из числа многих исследованных указанным методом белков электрофоретически гомогенной оказалась одна лишь рибонуклеаза (ср., однако, это доказательство с доказательством гетерогенности, полученным распределительной хроматографией [145]). Был применен также метод стационарного состояния , не требующий проведения опыта в изоэлектрической точке [144]. (Дальнейшее обсуждение этих методов см. в статье IV т. П.) [c.26]

О гетерогенности системы оксидаз свидетельствуют также результаты работ, в которых показано, что целый ряд ферментов, принимавшихся до недавнего времени за индивидуальные соединения, в действительности являются многокомпонентными системами. Так, Теорель (Theorell, 1943), впервые выделив из хрена кристаллическую пероксидазу, показал, что по электрофоретическим и некоторым другим свойствам этот препарат (пероксидаза II) существенно отличается от некристаллизующейся части фермента — параперок-сидазы (пероксидаза I). [c.235]

Принципы и техника электрофореза не требуют специального описания [14—16]. Обнаружение одиночного пика при двух или трех достаточно далеких значениях pH является признаком гомогенности. Применение для этой цели интерференционной онтики менее удовлетворительно, несмотря на ее высокую чувствительность, поскольку полученная кривая требует дифференцирования. Электрофоретическая подвижность зависит как от заряда молекулы, так и от гидродинамического сопротивления, причем оба эти фактора независимы. Они могут компенсироваться, давая в результате одинаковую подвижность для двух физически совершенно различных молекул, по это не может происходить при различных значениях pH. Поэтому важно проверить устойчивость гликопротеина в изучаемом интервале pH многие гликонротеины неустойчивы, особенно при высоких pH [17—19]. Полезная дополнительная информация может быть получена, если гликопротеин содержит заметные количества концевой сиаловой кислоты. В таких случаях заряд молекулы онределяется главным образом этим компонентом, и в большинстве случаев сиаловую кислоту можно почти полностью удалить с помош ью нейраминидазы. Если используемое количество фермента таково, что его можно обнаружить при последуюш,ем электрофоретическом анализе, фермент лучше сначала удалить, если это можно сделать удобным способом. Часто для этого пригодна гель-фильтрация. Молекулярный вес нейраминидазы холерного вибриона составляет около 9 -10 (Лэйвер [20]). Если после обработки нейраминидазой наблюдается два или более электрофоретически различных компонента вместо одного, наблюдавшегося перед обработкой, это значит, что материал, несмотря на его электрофоретическую гомогенность, содержит молекулы, различающиеся по химической природе остатков, от которых зависит заряд молекулы. Эта процедура может повысить степень полидисперсности, если реакция пе доведена до конца, но она не будет превращать гомогенные препараты в гетерогенные. Очевидно, важно убедиться, что используемая нейраминидаза не обладает никакой иной ферментативной активностью, особенно протеолитической. Описаны методы получения нейраминидазы необходимой чистоты [21, 22]. Проверке по этому способу был подвергнут а1-кислый гликопротеин человека [23], после обработки нейраминидазой наблюдалось два электрофоретических ника, несмотря на кажущуюся гомогенность необработанного материала в широком интервале рЬ1. [c.45]

При исследовании локализации фосфорилирующих систем в ЦНС установлено, что цАМФ-зависимая система избирательно сконцентрирована в нейронах, особенно в девдритах, а не в глии. Мозг крысы содержит как I, так и и II форму протеинкиназы А при соотношении этих форм 1 4 соответственно. Высокое содержание А-киназы II типа по сравнению с ферментом I типа вообще характерно для нервной ткани. Недавно установлена гетерогенность Р-субъединиц А-киназы II типа. При этом в мозге выявлена собственная, специфичная Р П-субъединица, отличная по иммунохимическим свойствам от Р-су единиц II типа в других тканях. Р II мозга отличается от Р II мышц по характеру взаимодействия с К-субъединицей, а также по электрофоретической подвижности аутофосфорилированных форм. Показано, что фракция Р-субъединиц II типа мозга взаимодействует с Са " и кальмодулином. Необычные свойства Р П-субъ- [c.339]

Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоиы, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними. [c.14]

В обычных условиях (вероналовый буфер, pH 8,6, ионная сила 0,02—0,08) подвижность преципитирующих антител у большинства видов животных практически равна нулю. В действительности, конечно, это не совсем так, поскольку антитела гетерогенны по своей электрофоретической подвижности. И тем не менее для правильного проведения электроиммуноанализа необходимо, чтобы основная масса антител оставалась неподвижной. Такое ограничение суживает пределы применимости метода, так как те антигены, которые в указанных условиях движутся к аноду не намного быстрее, чем антитела, будут давать несимметричные пики, а следовательно, данный метод непригоден для точного определения их количества. [c.251]

Хилборн И Анастасиадис [554] нашли линейную зависимость между логарифмом молекулярной массы полисахаридов и расстоянием, пройденным ими при электрофорезе в 6%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,2 М фосфатный буфер (pH 11,5) и 0,25 М формиат натрия (рис. 128). Так как в разделяемых смесях гликозаминогликаны всегда присутствуют в виде изомеров, различающихся по заряду или размерам, относительная ширина электрофоретических зон может служить мерой их гетерогенности. [c.398]

Большое значение для исследования генетической гетерогенности природных популяций имело применение метода гель-электрофореза при оценке изозимного разнообразия. Этот шаг, сделанный в 60-х годах благодаря успехам молекулярной биологии, приблизил к гену генетиков, изучающих популяции, позволил им непосредственно исследовать элементарные признаки в их молекулярном проявлении. Замены аминокислотных остатков в белках в результате мутаций могут изменять физико-химические свойства белков, в частности их электрофоретическую подвижность. [c.461]

Если видоспецифичные гены и существуют, как мы это предполагаем, поскольку рассматриваемые виды экологически и репродуктивно изолированы, то эти гены не попали в случайную выборку из 24 локусов. Таким образом, даже если абсолютное число таких видоспецифичных генов велико, все равно они, вероятно, составляют небольшую долю всего генома, почти наверное меньше 10%. Можно предложить и другое объяснение видоспецифичных генов не существует, а различие между видами обусловлено накоплением количественных различий по частоте аллелей, как в случае локуса эстераза-5. Последняя гипотеза не очень привлекательна, так как при этом предполагается, что видовые различия просто представляют собой очень низкие вероятности полной генетической идентичности особей. Однако с учетом степени обнаруженного внутривидового полиморфизма вероятность идентичности особей в пределах вида уже по существу равна нулю. Например, если взять только 20 наиболее полиморфных генов, известных в настоящее время у человека, вероятность генетической идентичности двух англичан уже сейчас ниже 10- . Скорее всего следует предположить, что D. persimilis и D. pseudoobs ura действительно полностью отличаются друг от друга по определенным локусам, подобным тем, которые обнаружил Добржанский при исследовании стерильности у гибридов между этими видами, но что различия затрагивают только особую часть генома, тогда как большая его часть остается недифференцированной. Открытие значительной генетической гетерогенности внутри электрофоретических классов при изучении тепловой денатурации (см. стр. 177) могло бы существенно изменить это заключение. [c.182]

Значения f для D. pseudoobs ura, если исключить гены ретьей хромосомы и пренебречь редкими аллелями в каждом локусе, в три раза более изменчивы, чем они должны были быть, если бы все аллели были нейтральными. Избыток этот значимый (Я<0,01), но основной вклад в дисперсию вносят два локуса ксантиндегидрогеназа и эстераза-5. К сожалению, статистический критерий для гетерогенности значений f обладает достаточной мощностью лишь в том случае, если исследовано большое число локусов в популяции поэтому его нельзя применить к данным по другим видам или к электрофоретической изменчивости у человека. Тем не менее гетерогенность значений f потенциально представляет собой весьма полезный общий критерий отбора. [c.221]

Иммуноглобулины составляют группу макромолекул, чрезвычайно гетерогенную по биологической активности, заряду и молекулярному весу. Это наиболее щелочные из сывороточных глобулинов, обладающие наименьшей электрофоретической подвижностью (обзор Eisen, 1973). Для их отделения от остальных белков сыворотки используют либо обычные физико-химические методы, такие, как высаливание, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и препаративный зональный электрофорез, либо аффинную хроматографию последний метод особенно пригоден для выделения из сыворотки специфических антител. Все эти методы достаточно просты, не требуют большой затраты времени и обеспечивают хороший выход иммуноглобулинов. Иммуноглобулины разных животных различаются по заряду, молекулярному весу и электрофоретической подвижности, поэтому методы фракционирования, пригодные для выделения иммуноглобулинов одного вида, не всегда будут без каких-либо изменений пригодны для глобулинов другого вида в каждом отдельном случае необходима подработка методики. В этой главе дается краткое описание общих методов фракционирования, позволяющих выделять иммуноглобулины большинства видов животных. [c.58]

В опытах по препаративному ИЭФ, описанных в настоящем разделе, использовали электрофоретическое оборудование Мультифор фирмы LKB Produ ter АВ (Стокгольм, Швеция) и набор амфолитов-носителей ЛКБ-амфолины для электрофокусирования в гранулированных гелях. С помощью этого метода нам удалось выделить отдельные гомогенные в ИЭФ фракции кроличьего IgG, которые при других способах разделения дают гетерогенный препарат. [c.137]

Помимо различий между KJтa aми, существует и весьма значительная гетерогенность в пределах каждого оасса. Так, по электрофоретическим свойствам иммуноглобулины настолько разнообразны, что встречаются во всех фракциях норм шьной сыворотки, от а до у (рис. 6.2). [c.98]

Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика использовали препараты фермента, очищенные в 150—300 раз. Тремя независимыми методами электрофорезом в однородном геле и в градиенте концентрации полиакриламидного геля, путем разделения в тонком слое сефадекса С-200, с помощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом С-200 — была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны, характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0, после его элюции и кондентрирования обнаружил несколько белков с более низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07). [c.137]

Природа фибриллярного белка амилоида (F-компонент) в последнее время хорошо изучена. Руководствуясь разносторонними исследованиями (определение относительной молекулярной массы, электрофоретический и хроматографический анализ), можно считать, что фибриллы амилоида представляют собой гетерогенную группу (смесь) белков с индивидуальными особенностями в каждом случае амилоидоза [Рукосуев В. С., 1975]. Из смеси белков фибрилл амилоида удалось выделить две группы— белок А (AS) и белок В. Белок А (AS), обнаруженный в амилоиде при всех формах амилоидоза у человека и при экспериментальном амилоидозе у различных животных, по сравнению с белком В содержит больше таких аминокислот, как аргинин, аспарагин, глицин, аланин и фенилаланин, причем последовательность концевых участков аминокислот отличаех-этот белок от любого из иммуноглобулинов. Белок В, обнаруженный в амилоиде при первичном амилоидозе, опухолевидном амилоидозе респираторного тракта и плазмоцитоме, по сравнению с белком А (AS) имеет большую относительную молекулярную массу по аминокислотному составу и последовательности концевых остатков аминокислот он напоминает легкие цепи иммуноглобулинов или белка Бене-Джонса [Isersky С. et al., 1972]. [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология