Концентрации градиент при ультрацентрифугировании

Подобные кюветы значительно расширяют возможности метода ультрацентрифугирования, поскольку, применяя их, можно добиться образования резкой исходной границы седиментации в центре столба жидкости. Существует несколько вариантов конструкции таких кювет, каждый из которых применяют для проведения экспериментальных исследований определенного типа. Недавно была создана многоканальная кювета для одновременного ультрацентрифугирования четырех столбиков жидкости. Для ряда специальных задач описаны другие кюветы, хотя большинство из них пока не нащли широкого применения в исследовании полимеров. Все оптические методы, применяемые для регистрации границ седиментации в ультрацентрифуге, основаны на поглощении или преломлении света, проходящего через раствор полимера. Абсорбционные оптические системы регистрации нашли довольно ограниченное применение в исследованиях полимеров, поскольку большинство полимеров не поглощает свет в ультрафиолетовой части спектра . Но если полимер обладает сильным поглощением в указанной области спектра, то абсорбционный метод позволяет проводить весьма точные измерения при крайне низких концентрациях полимера [9]. Методы регистрации, основанные на разности показателей преломления раствора и растворителя, как правило, применяются в системе скрещенных диафрагм или в интерференционной оптической системе . Система скрещенных диафрагм регистрирует градиент показателя преломления (dn/dr) в зависимости от расстояния (г) до центра вращения, как показано на рис. 8-1 для скоростной седиментации полистирола в циклогексане. Интерференционные регистрирующие системы позволяют получать зависимость показателя преломления от расстояния г, на рис. 8-2 подобная регистрация представлена для низкоскоростной седиментации полистирола в циклогексане. Кривые изменения показателя прелом-. Ленин можно преобразовать в кривые изменения концентрации, определив постоянные такого преобразования по изменению показателя преломления стандартных растворов с помощью кюветы с искусственной границей. Возможности применения интерференционных методов регистрации основаны на большом различии показателя преломления растворителя и показателя преломления исследуемого полимера. [c.221]

Седиментационные характеристики частиц, содержащихся в вирусных препаратах, можно исследовать либо методом зонального центрифугирования в градиентах концентрации сахарозы, либо методом аналитического ультрацентрифугирования. [c.24]

Остановимся на трех современных методах, с помощью которых с большей или меньшей полнотой решаются рассмотренные здесь задачи. Ультрацентрифуга позволяет развить еще один интересный метод, который сводится к измерению удельного объема полимера в растворе [25]. Идея его заключается в том, чтобы создать в кювете ультрацентрифуги градиент плотности. Это осуществляется выбором бинарного растворителя и притом такого, который составлен из более легкого и более тяжелого комнонентов (например, бензола и хлороформа). Ультрацентрифугирование приводит к быстрому (в течение 3—4 часов) установлению седиментационного равновесия в растворителе. Строго говоря, к этому случаю нельзя применить закон Больцмана, так как концентрации обоих компонентов одного порядка, т. е. раствор никак нельзя считать идеальным. Однако оценку величины разделения можно все же произвести по Больцману [c.168]

Одной из наиболее важных и ответственных стадий в изучении НК является их очистка и разделение на более или менее однородные фракции и индивидуальные компоненты. С этой целью в настоящее время широко применяется ультрацентрифугирование в градиенте концентрации, различные виды электрофореза и ионообменной колоночной хроматографии. [c.76]

При ультрацентрифугировании достаточно концентрированного раствора соли малого молекулярного веса возникает градиент плотности, причем у дна ячейки плотность раствора оказывается наибольшей. Исследуемое вещество, подвергнутое ультрацентрифугированию в таком растворе, образует слой, положение которого определяется плотностью этого вещества. Концентрацию и тип соли можно подобрать так, чтобы этот слой располагался в средней части ячейки. При исследовании, например, водных растворов ДНК их центрифугируют в градиенте плотности хлористого цезия, взятого в концентрации 7,7 М (на протяжении столба жидкости высотой 1 см плотность СзС меняется от 1,64 до 1,76 г мл). Положение слоя ДНК определяют при этом по поглощению в ультрафиолете. [c.195]

Рефрактометрия находит применение также в количественной тонкослойной хроматографии пятна разделенных компонентов экстрагируют подходящим растворителем, и концентрацию полученных растворов определяют по показателю преломления [39, 40]. В специальных методах разделения —электрофорезе, диффузии, ультрацентрифугировании — используется более сложная техника определения градиентов показателей преломления, рассматриваемая в гл. XV. [c.53]

Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности [115, 1Щ. Когда при центрифугировании в градиенте плотности достигается седи-ментационное равповесие, концентрации макромолекул распределяются но гауссову закону ширина полосы седиментации определяется двумя противоположно действующими факторами — тенденцией макромолекул диффундировать в область более низких концентраций и их стремлением седиментировать в зону с соответствующей плотностью. Было показано, что в такой системе приближенное значение молекулярного веса может быть определено по следующей формуле [c.240]

Средневесовой молекулярный вес находят методом светорассеяния или методом равновесного ультрацентрифугирования, но только в том случае, если распределение концентраций раствора в кювете находят по изменению абсорбции света. Если распределение концентраций находят по изменению градиента показателя преломления, то получают так называемый г-средний молекулярный вес М , который вычисляется по следующей формуле [c.16]

Характеристика полученных фракций ядерной РНК началась с определения их размеров методом ультрацентрифугирования в градиенте плотное сахарозы. Раствор РНК наслаивается в центрифужную пробирку на столбик буфера с возрастающей концентрацией сахарозы и ультра- [c.15]

Тем не менее, ввиду широкой распространенности метода ИЭФ в жидкостных колонках следует рассмотреть его особенности. Процесс ИЭФ белков здесь протекает в растворе амфолитов без носителя. Опасность конвекционного перемешивания слоев жидкости блокируется созданием по высоте колонки достаточно крутого линейного градиента плотности раствора сахарозы, которая не мешает формированию градиента pH и фокусированию белков. Колонку заполняют с помощью перистальтического насоса из смесителя градиента того же типа, что используется для приготовления линейных градиентов плотности растворов сахарозы для ультрацентрифугирования [Остерман, 1981]. На дно колонки амфолиты поступают в 50%-ном растворе сахарозы, к ее верхнему концу концентрация сахарозы снижается до 5%. [c.67]

Выше уже упоминалось о возможности использования градиента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведены соображения, касающиеся подбора концентраций инициирующих добавок в этом случае. Преимущества таких градиентных гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиентных гелей используют такие же смесительные устройства, как при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацентрифугирования. В этом случае также можно получать линейные и нелинейные градиенты, выпуклые и вогнутые , в том числе экспоненциальные. [c.24]

Метод седиментационного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 ООО—8 000 об-мин , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных — с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества согласно формуле [c.62]

Определены оптимальные условия ренатурации ДНК после ее тепловой денатурации I308]. Концентрация ионов патрия должна быть выше 0,4 М, а температура на 25 ниже температуры плавления. Так как переход спираль — клубок воспроизводим (в отношении физических свойств и тепловой инактивации биологических маркеров), при охлаждении образуется та же вторичная структура, а сколько-нибудь заметного образования неспецифических водородных связей не происходит. Полнота ренатурации увеличивается с увеличением молекулярного веса ДНК и, как и следовало ожидать, заметно зависит от гомогенности препарата. Степень реконструкции вторичной структуры убывает в последовательности для ДНК из бактериофага > мелких бактерий > бактерий > животных тканей, и этот порядок отражает изменение числа различных молекул ДНК и различие нуклеотидного состава, которыми характеризуется каждый из источников ДНК 1308]. Как было показано фракционированием ренатурированной трансформируюшей ДНК при иомош,и ультрацентрифугирования в градиенте плотности, ренатурация не относится к процессам типа все или ничего>л а образование двойной спирали вновь после разрушения может происходить в различной степени [309]. В основном это есть результат случайного расщепления ковалентных связей в полин клеотид-ной цепи при нагревании. При стандартных условиях тепловой денатурации и последующего охлаждения можно рассчитать, что в каждой цепи ДНК с молекулярным весом 10 может происходить в среднем по три разрыва. Поэтому в процессе ренатурации будут участвовать комплементарные цепи с длиной, различающейся на i/i—1/2, что понижает ренату рацию на 20—30% [310]. Действительно, на микрофотографиях часто наблюдаются клубки на одном или на обоих концах ренатурированных цепей, которые соответствуют выступающим концам однотяжных цепей. [c.605]

При определении 5 с помощью зонального центрифугирования часто используют стандартные образцы (маркеры), значения з которых предварительно были определены методом аналитического ультрацентрифугирования. Однако даже в том случае, когда концентрация достаточно низка, чтобы можно было не принимать во внимание концентрационную зависимость седиментации (которая может достигать большой степени, если материал недостаточно чист), определение с помощью зонального центрифугирования имеет подводные камни, которые не встречаются в аналитическом ультрацентрифугировании. Это можно объяснить тремя основными причинами. Во-первых, плотность и вязкость раствора увеличивается вдоль пробирки, поэтому суммарная сила, действующая на молекулу, здесь уже не является простой функцией расстояния. Во-вторых, стенки препаративных пробирок параллельны, поэтому они не совпадают с направлением седиментации, в результате чего происходит седиментация по стенкам с накоплением вещества. Это накопление приводит к локальным инверсиям плотности, вызывая некоторую конвекцию. В-третьих, значение 8 рассчитывается только по двум точкам, положению при времени, равном нулю, и после остановки центрифуги, так что истинная скорость движения остается неизвестной. Первая причина может быть рассмотрена очень сложным теоретическим путем, вторая теоретически описана, однако влияние ее на 5 до конца не установлено. Для избежания трудностей, связанных с первой причиной, обычно применяют изокинетические градиенты, т. е. концентрацию и плотность градиента подбирают таким образом, чтобы молекулы двигались с постоянной скоро- [c.311]

Как было описано ранее (см. раздел Градиентное центрифугирование ), суть метода состоит в том, что при ультрацентрифугировании растворов тяжелых металлов создается градиент концентрации за счет седиментации тяжелых ионов. При этом макромолекулы за 24—26 часов под действием гравитационного поля мигрируют в те зоны пробирки, плотность которых соответствует их плавучей плотности, причем они занимают в ней весьма узкие полосы. При центрифугировании в аналитических центрифугах значение плавучей плотности для РНК, или ДНК может быть измерено с точностью до 0,001 г/см . Подобное [c.180]

Первое поколение дочерних молекул ДНК состоит наполовину из старых и наполовину из новых полинуклеотидных цепей. Зто было подтверждено замечательным экспериментом на бактериальных культурах с использованием меченых атомов ( N разд. 20.17). Об этом опыте в 1958 г. сообщили М. Мезельсон и Ф. У. Шталь. Они выращивали несколько поколений кишечной палочки Es heri hia oli) на питательной среде, в которой присутствовало соединение азота с высоким содержанием тяжелого изотопа Выделенная в этом случае бактериальная ДНК имела большую молекулярную массу (атомы в молекуле были те же) и большую плотность, чем ДНК, полученная из бактерий, выращенных на обычной среде. Различие плотности определяли методом, называемым ультрацентрифугированием в градиенте плотности. Раствор хлорида цезия помещают в центрифужную пробирку и вращают ротор с такой скоростью, чтобы получить центробежное ускорение, в 100 000 раз превышающее ускорение земного тяготения. В центробежном поле концентрация ионов цезия, имеющих высокую плотность (вместе с компенсирующими их заряд ионами хлора), будет выше в периферическом конце пробирки. Таким образом, по направлению к периферии в пробирке создается градиент плотности. Большие молекулы, вроде ДНК, при введении в пробирку и создании силового поля концентрируются в зонах, где их плотность равна плотности раствора хлорида цезия, т. е. в периферическом конце пробирки. Мезельсон и Шталь перенесли бактерии, выращенные в среде, обогащенной [c.460]

Наличие некоторых примесей или специально добавленных реагентов может существенным образом изменять характер элюции НК с оксиапатита. Например, присутствие ионов ртути и особенно серебра в комплексе с ДНК существенно затрудняет элюцию однонитевой ДНК. Эти ионы нередко используют при фракционировании ДНК ультрацентрифугированием в градиенте концентрации sjSO [Остерман, 1981]. Если такая операция предшествовала очистке ДНК на оксиапатите, то следует принять специальные меры для удаления этих ионов [Markova et al., 1978]. [c.238]

Для интеркаляции со сходным эффектом можно воспользоваться и более привычным красителем — бромистым этидием, в частности для очистки плазмидной сверхскрученной ДНК, подобно тому как это делают методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации раствора s l, но значительно проще и быстрее. В основе обоих методов лежит одно и то же явление — в линейную [c.238]

Получение рибосом из печени крысы. Навеску ткани гомогенизируют (приготовление препарата см. на с. 49) в гомогенизаторе Поттера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава 0,01 М трис-буфер (pH 7,6), 0,02 М Mg la и 0,05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18 000 в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугат объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 90 мин. Осадок рибосом суспендируют в среде, содержащей 0,1 М трис-буфер и 0,001 М Mg la. Если суспензия мутная, ее осветляют центрифугированием на хоМде (18000 g, 15 мин). Очистка фракции рибосом может быть проведена также ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы 10—30% (с. 172). [c.170]

Индивидуальные рРНК в препаративных кол-вах получают из изолнр. субчастиц рибосом или ультрацентрифугированием суммарной РНК в градиенте концентрации сахарозы. Для аналит. целей индивидуальные рРНК м.б. получены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.266]

Рис. 8.1. Седиментационный перенос в кювете для ультрацентрифугирования в процессе вращения, г —расстояние от центра вращения с—концентрация, в —изменение концентрации по высоте столбика в кювете б —градиент конценграцни, образующийся в кювете.

В концентрированном растворе низкомолекулярного вещества, в частности в солевом растворе, при длительном ультрацентрифугировании устанавливается градиент концентрации, или, что то же самое, градиент плотности ёроМх. Если поместить в такой раствор, служащий здесь растворителем, макромолекулы, то в силу пропорциональности 5 и (1 — 1 ро), где ро — по-прежнему плотность растворителя, они будут располагаться в той части кюветы, в которой 5 = О, т. е. Рро = 1, или ро = рм- Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плотность концентрированного солевого раствора совпадает с плотностью макромолекул и, значит, плотность рм можно измерить непосредственно. Гетерогенная смесь макромолекул [c.153]

Этот метод, впервые предложенный Ламмом [1, 2], является наиболее точным из всех рефрактометрических методов определения градиентов концентрации, но связан с довольно кропотливой обработкой фотопластинок. Применение его поэтому стремятся ограничить теми случаями, когда первостепенное значение приобретает воспроизведение кривой распределения концентрации во всех деталях. Обычно это имеет место при измерениях коэффициентов диффузии полидисперсных веществ и при исследовании в ультрацентрифуге молекулярно-весовых распределений (скоростным ультрацентрифугированием или методом седиментационного равновесия) [4, 5]. [c.271]

Полученные таким способом кажущиеся распределения оказываются истинными распределениями по коэффициентам седиментации лишь в том случае, если степень уширения границы седиментации не зависит от давления, диф-4>узии или концентрации растворенного вещества. Подобные зависимости все же имеют место при ультрацентрифугировании большинства полимеров в органических растворителях, поэтому для получения точного распределения ло молекулярным весам необходимо учитывать эти влияния. При используемых обычно в методе скоростной седиментации силовых полях ультрацентрифуги возникает большое гидростатическое давление, изменяющееся от 1 атм на уровне мениска до нескольких сотен атмосфер в придонном слое кюветы. От величины давления зависят плотность и вязкость раствора, а также удельный парциальный объем молекул растворенного вещества, поэтому характер седиментации, осуществляющейся в таком градиенте давления, меняется в зависимости от расстояния до мениска. Рассмотренное влияние давления наиболее выражено при использовании относительно сжимаемых органических полимеров и растворителей, обычно применяемых в химии полимеров. Проблема влияния давления на седиментацию, впервые рассмотренная Мосиманом и Сигнером [39], недавно вновь привлекла внимание исследователей. С помощью математической интерпретации качественного рассмотрения проблемы Отом и Деро [40] Фужита [41] использовал уравнение Ламма и показал, что линейная зависимость седиментации от давления приводит к выран ению [c.231]

Был разработан также ряд очень чувствительных методов, в которых непосредственно наблюдаемой величиной является градиент концентрации, а не сама концентрация. К числу этих методов принадлежит так называемый шлирен-метод, который был использован Свенссоном [454, 455] в ставшей очень популярной оптической системе. Этот метод основан на том, что луч света, проходящий через среду с градиентом показателя преломления перпендикулярно направлению распространения света, отклоняется в направлении увеличения показателя преломления п, причем отклонение пропорционально величине градиента. Этот принцип использовался также при расчете скорости смещения изображения освещенной щели в зависимости от градиента концентрации, существующего в кювете, через которую проходит свет. Так как зависимость показателя преломления разбавленных растворов от концентрации растворенного вещества является линейной, то с помощью шлирен-метода можно получить градиент концентрации в кювете центрифуги при условии, что инкремент показателя преломления (дп/дс2)т определен заранее. Градиенты показателя преломления можно также определить с помощью интерферометров. По мнению Шахмана [449], этот метод наиболее перспективен для будущего усовершенствованрш равновесного ультрацентрифугирования. [c.158]

Если полимерный образец неоднороден по молекулярным весам, но однороден по эффективной плотности макромолекул, то наблюдаемая в условиях равновесия полоса полимера является суммой многих гауссовых кривых с совпадающими центрами распределений, каждая из которых характеризуется стандартным отклонением, связанным с молекулярным весом макромолекул данной длины по уравнению (8-64) . По моментам такой составной кривой можно определить различные типы средних молекулярных весов [74, 76]. В связи с невозможностью выполнения идеальных условий в каждой точке градиента плотности, установившегося в смеси растворителей, всегда оказывается необходимым проводить экстраполяцию кажущихся молекулярных весов, определенных описанным способом, к бесконечному разбавлению. Хермане и Энде [76] показали, что при ультрацентрифугировании полистирола в идеальной смеси растворителей (циклогексанол и четыреххлористый углерод) линейной экстраполяцией (1/А/ )каж и (-Мги)каш к нулевой концентрации можно с удовлетворительной степенью точности получить величины молекулярных весов. В смеси указанных растворителей кая<ущаяся плотность полистирола в значительной мере зависит от избирательной адсорбции полимером хорошего растворителя. Удовлетворительные величины молекулярных весов не удалось получить таким способом для смеси хороших растворителей. Параметры предполагаемых функций распределения можно определить с помощью полученных этим методом средних величин молекулярных весов, но тем не менее детали кривой распределения по молекулярным весам нельзя воспроизвести вследствие ограниченности количества моментов кривой. [c.243]

В целях упрощения расчетов выше принималось, что коэффициент диффузии мошет не зависеть от концентрации. В действительности же подобное положение выполняется в определенных пределах только в условиях идеальных растворителей [16]. Во всех других случаях имеет место более или менее выраженная зависимость коэффициента диффузии от концентрации. Определение параметров диффузии становится более сложным в связи с концентрационной зависимостью, поскольку кривая градиента концентрации становится асимметричной по отношению к начальной границе. Следовательно, теперь уже нельзя получить степень неоднородности по параметрам диффузионной кривой, измеренным только при одной концентрации. Отношения Оп/Оаг В11В2 и В21Вг должны определяться по измерениям при нескольких концентрациях с последующей экстраполяцией к бесконечному разбавлению. Аналогичные операции проводят при определении молекулярных весов методами ультрацентрифугирования и диффузии. Если не учитывать больший разброс величин, полученные в предыдущих разделах уравнения остаются справедливыми для экстраполированных средних значений коэффициентов диффузии. [c.258]

Ясно, что ренатурация может быть легко достигнута для более однородных образцов ДНК (например, для тех препаратов, которые дают достаточно узкие зоны при ультрацентрифугировании в градиенте плотности), так как в растворах совершенно гомогенной ДНК после ее денатурации будет наибольшая концентрация комплементарных цепей. Таким образом, наиболее полно будут рена-турировать ДНК бактериофагов, в несколько меньшей степени бактериальные f ДНК и в значительно меньшей степени ДНК из животных тканей (например, из зобной железы теленка), которые весьма гетерогенны по составу (см. также стр. 601, где денатурация и ренатурация обсуждаются более детально). [c.580]

Методы изучения макроскопического переноса веществ вужиДкой среде под действием некоторой внешней силы имеют много общего, что породило выделение их в отдельную область транспортных явлений (transport phenomena) [5, 6]. В физической химии полимеров к транспортным методам относят ультрацентрифугирование, диффузию, электрофорез и хроматографическое разделение макромолекул в растворах. Транспортные методы основаны на неравновесных процессах массопереноса различной природы. Общее во всех этих методах — направленное движение макромолекул относительно гомогенной или гетерогенной окружающей среды под действием некоторой силы. Разновидности последней обеспечивают разнообразие транспортных методов. В случае седиментации и электрофореза — это силы внешних гравитационного и электрического (для заряженных макромолекул) полей, в случае диффузии — это осмотическое давление, т. е. градиент химического потенциала, возникающий одновременно с возникновением градиента концентрации, в случае хроматографии — обусловленное динамической сорбцией межфазное распределение, уменьшающее среднюю скорость движения макромолекул по сравнению с молекулами растворителя — носителя . [c.7]

В 1961 г. в журнале Nature были опубликованы работы двух групп авторов, сыгравшие исключительную роль в формировании современных представлений о процессах биосинтеза белка. В обоих случаях было использовано препаративное ультрацентрифугирование в одном из них компоненты бесклеточнои системы разделяли в градиенте плотности хлористого цезия, в другом использовали градиенты концентрации сахарозы. [c.8]

В последнее время для зонального ультрацентрифугирования стали применять угловые роторы, обладающие, как оказалось, некоторыми преимуществами перед роторами с подвесными стаканами. Известный недостаток угловых роторов, связанный с происходящей в них конвекцией, компенсируется применением градиента концентрации сахарозы. В работе Фламма с сотр. [12] описано применение такого ротора для разделения и фракционирования отдельных цепей ДНК при помощи изопикнического ультрацентрифугирования. Направление градиента плотности в пробирке углового ротора после его остановки изменяется на 90°, что, очевидно, эквивалентно соответствующему изменению ориентации пробирки в подвесных стаканах [13]. В угловых роторах, как правило, используются пробирки относительно большего объема, и число пробирок в угловом роторе также больше, чем в роторе с подвесным стаканом. Толщина слоя жидкости с градиентом плотности в этом случае меньше, что уменьшает время достижения равновесия. В работе [12] исследовано зональное фракционирование нуклеиновых кислот. РНК в использованных авторами этой работы условиях быстро седиментирует и оседает на стенке пробирки, в то время как ДНК хорошо разделяется в градиенте плотности. На фиг. 39 иллюстрируется улучшение разрешения за счет применения углового ротора. [c.185]

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот [34]. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных — в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов. [c.27]

Для этого был изобретен остроумный и исключительно чувствительный метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Метод Месельсона представляет собой ультрацентрифугирование, при котором мы разделяем макромолекулы не по молекулярному весу, а по удельному весу полимера. В среду вводится электролит большой плотности ( s l с р = 3,7). Эта соль распределяется в кювете ультрацентрифуги в согласии с законом Больцмана, и нри установившемся равновесном распределенни концентрация соли будет зависеть от координаты примерно как [c.251]

Лучший метод изолирования ИРНК, найденный до сих пор, — ультрацентрифугирование рибосомного препарата при достаточно низкой концентрации (<10 М) ионов Mg . Для того чтобы провести ультрацентрифугнрование заметного количества вещества, оно осуществляется в нренаративном роторе (с шарнирно подвешенными стаканчиками) в течение 5—6 ч. В пробирке предварительно создается с помощью специального дозатора градиент концентрации сахарозы от 25% у дна до 5% вверху. На поверхность жидкости наслаивается 0,2 мл центрифугируемой взвеси. Вследствие градиента плотности не происходит конвекционного перемешивания, и разделение компонентов осу- [c.468]

Каковы различия в принципах и применении между ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы, в градиенте плотности хлорида цезия и аналитическим центр ифугир ОБ анием [c.285]

Влияние размера конъюгата. Сигмоидный характер кривой титрования в ее верхней области, т. е. в области относительно высокой загрузки первичными антителами, позволяет предположить, что а) в области более высокой концентрации антител пространственные затруднения для работы системы детектирования возрастают или б) связывание конъюгатов с различным молярным соотношением фермент антитело или с ферментативной активностью, отличной от активности конъюгатов, преимущественно связывающихся в области низкой концентрации антител, происходит избирательно. Второе из названных предположений кажется маловероятным ввиду однородности состава ИФК, используемого в a-ELISA (см. рис. 14-2), Поэтому мы исследовали влияние на форму кривой титрования конъюгатов различного состава с разной способностью вызывать пространственные затруднения при связывании. Для этого использовали системы, схематически показанные на рис. 14-1. Размер частиц конъюгата определяли ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте аналогично тому, как это делали при получении данных на рис. 14-2. Было установлено, что конъюгаты, полученные с помощью глутарового альдегида, представляют собой крупные агрегаты, в то время как конъюгаты на основе Fab однородны по размеру и имеют мол. массу [c.229]

Изобретение этой простой оптической системы, которая на самом деле дает график зависимости градиента концентрации от расстояния, было главным достижением в разработке метода ультрацентрифугирования, без которого эта техника, возможно, никогда не стала бы столь полезной. Систему разработал Дж. Ст. Л. Филпот и модифицировал X. Свенсон. [c.287]

Изоплотноетный градиент. При пользовании данным методом градиент образуется непосредственно в процессе центрифугирования. Для этого обычно применяют растворы солей тяжелых металлов цезия и рубидия. Возникновение градиента обусловлено перераспределением концентрации соли при ультрацентрифугировании. Величина установившегося перепада плотности между мениском раст [c.62]