Буферы для ионообменной хроматографии

При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе матрицы и емкости ионита) и буферного раствора, при котором осуществляется сорбция белков (величине pH и ионной силы, природе буфера и буферной емкости). [c.108]

В самом простом случае смену буферов можно осуществить вручную. Однако поскольку процесс ионообменной хроматографии длится несколько часов, а иногда и несколько дней, ручной способ сопряжен с большими неудобствами. Поэтому были сконструированы вспомогательные устройства для автоматической смены буферов. [c.557]

В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных pH) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок - стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области р1 (р1 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение ) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и -потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа. [c.67]

Ионные соединения а)кислоты,основания б) ионы металлов, анионы ++ (+) ++ (+) Используются немодифицированные сорбенты I и сорбенты И с водными буферами и ион парная хроматография с обращенными фазами. АЬОз не применяется для анализа кислых соединений Используется ионообменная хроматография [c.397]

Аммиак (водные растворы) применяют при приготовлении буферов для обращенно-фазовой и ионообменной Хроматографии Изредка используют как индивидуальную добавку с целью улучшения формы пиков веществ основного характера. В таких случаях следует проявлять осторожность, поскольку при pH 8 возможно быстрое разрушение сорбентов на основе силикагеля. [c.300]

IV. Ионообменная хроматография карбоновых кислот в разбавленных кислотах или в растворителях, содержащих буфер [c.160]

Этот метод основан на образовании множества электростатических связей между заряженными группами пептида и несущими противоположный заряд ионогенными группировками поверхности ионита. Благодаря амфотерному характеру пептидов в этом методе можно использовать катиониты или аниониты. Единственным ограничением является слабая растворимость пептидов в той или иной области pH. Если же смесь пептидов вообще не растворяется в обычных буферных растворах, то применяют буферы с высокой концентрацией мочевины или солянокислого гуанидина. Применение летучих буферных растворов в ионообменной хроматографии позволяет миновать стадию обессоливания. Б настоящее время ионообменная хроматография пептидов полностью или частично автоматизирована, а метод стал настолько универсальным, что позволяет разделить практически любую смесь пептидов. [c.389]

Поскольку наличие углеводного остатка не оказывает существенного влияния на диссоциацию (за исключением хроматографии рибонуклеозидов в боратных буферах) [71, 72], методы разделения оснований вполне применимы для разделения нуклеозидов. Основными методами являются в этом случае распределительная и адсорбционная хроматографии используют также гель-проникающую и ионообменную хроматографии. [c.47]

Тип противоиона может также оказывать действие и на селективность. Особенно значительные различия иногда наблюдаются для анионов [70]. Подобным же образом в условиях ионообменной хроматографии выбор буфера может оказать значительное воздействие на селективность. В качестве наиболее универсального компонента буферного раствора рекомендуют [c.112]

Параметры, которые играют роль в ионообменной хроматографии, приведены в табл. З.Юд. Для того чтобы оптимизировать хроматографическую селективность системы, в этом случае можно осуществить объединенную оптимизацию двух основных параметров (величины pH и концентрации противоионов). Однако для воздействия на селективность часто используют и различные буферы или противоионы. Повышенная температура, как правило, позволяет увеличить эффективность, а не селективность системы. [c.142]

Разъединенные полипептидные цепи могут быть разделены методом ионообменной хроматографии. Как уже говорилось выше, лучше использовать ионообменники на целлюлозной основе, которые обладают большой емкостью по отношению к полипептидам, отсутствием необратимой сорбции и т. д. С помощью этого приема были, например, расфракционированы и получены в чистом виде две цепи инсулина и две субъединицы гемоглобина. В последнем случае разделение велось на карбоксиметил-целлюлозе при градиентной элюции буфером пиридин — муравьиная кислота (pH 2,0). Получаемые субъединицы разде- ляли на отдельные цепи в щелочной среде. [c.79]

В ионообменной хроматографии на катионитах в Н+-форме в большинстве случаев используют разбавленные водные растворы кислот (хлороводородной, муравьиной и др.) или кислотные буферные растворы (фосфатные, ацетатные, цитратные). Удерживание веществ при этом понижается с уменьшением pH подвижной фазы. В хроматографии на ионитах в ОН-форме, наоборот с возрастанием pH понижается удерживание подвижная фаза содержит основные буферы (фосфатные, боратные и т. п.). Если иониты используют в форме соли, что при аналитической ионообменной хроматографии бывает часто, то удерживание зависит от концентрации противоиона в подвижной фазе. Кроме буфера подвижная фаза содержит в этом случае и добавки нейтральной соли, в частности хлорида натрия или хлорида калия. Для подавления неионогенных взаимодействий разделяемых веществ с матрицей ионита иногда в подвижную фазу добавляют органические растворители, чаще всего алифатические спирты. [c.249]

Ионообменная хроматография, как это видно из названия, служит для разделения смесей ионов. Органические соединения, например аминокислоты или карбоновые кислоты, можно разделять как с помощью ионообменной хроматографии, так и другими хроматографическими методами. Однако целый ряд ионных соединений, в том числе очень важных соединений редкоземельных и трансурановых элементов, можно удовлетворительно разделить только при помощи ионообменной хроматографии. К недостаткам этого вида хроматографии следует отнести недостаточное теоретическое обоснование и невозможность элюировать разделенные ионы в чистом виде. Выделенный компонент элюируют большим количеством растворителя, который часто содержит посторонние ионы, являющиеся компонентами буфера или комплексообразова-телями, причем эти ионы могут присутствовать в больших концентрациях. [c.82]

Правильный выбор подвижной фазы в ионообменной хроматографии связан с преодолением больших трудностей, чем в любом другом варианте хроматографии. Элюент практически всегда состоит в основном из воды. Для поддержания постоянного pH к элюенту добавляют соответствующий буфер, а для улучшения разделения или для селективного элюирования (или удерживания) компонентов определяемой смеси вводят комплексообразующие агенты. Таким образом, для выбора элюирующих растворителей необходимо всесторонне изучить ионные равновесия в водных растворах. Выбор подвижной фазы сложен, и значительное количество времени и усилий можно сэкономить, правильно используя литературу по ионообменной хроматографии [50, 51]. Условия эксперимента можно подобрать, изучив условия равновесия между ионообменником, определяемым веществом, с одной стороны, и растворами с различными pH и концентрациями комплексообразующих агентов — с другой. Повторяя эту процедуру для каждого компонента определяемой системы, можно подобрать условия анализа. [c.82]

Продолжая поиски оптимальных условий для ионообменной хроматографии сахаров в форме боратных комплексов Флори-ди [75] предложил вернуться к ступенчатому элюированию. Рекомендуемая им система содержала только два буфера и обеспечивала разделение смеси, содержащей двенадцать сахаров (включая сахарозу, мальтозу, лактозу, мелицитозу и раффинозу, а также обычные моносахариды), за б ч. Разделение проводили на колонке (1,1 мХб мм) со смолой дауэкс 1-Х4 (200— 400 меш) при температуре 55 °С. Колонку промывали в течение 90 мин буфером с pH 8,40 (0,025 М тетраборат калия — 0,125 М борная кислота, pH устанавливали путем добавления 1 н. КОН) со скоростью 45 мл/ч, а затем буфером с pH 8,80 (0,11 М тетраборат калия — 0,125 М борная кислота) со скоростью 60 мл/ч. [c.22]

Фракции после ионообменной хроматографии часто содержат много соли, поэтому их неудобно концентрировать нростым высушиванием, но можно воспользоваться ультрадиализом под давлением. С этой точки зрения удобно пользоваться для элюции летучими буферами и солями, которые можно упарить в роторном испарителе. Если они летят медленнее, чем вода, то в ходе упаривания во фракции несколько раз добавляют воду. [c.295]

Ионообменная хроматография. После диализа раствор наносят на колонку (4x20 см), заполненную ДЭАЭ-сефадексом А-50, уравновешенную буфером В. Колонку промывают тем же буфером (500 мл), после чего проводят элюцию 0,3 М трис-фосфатным буфером, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ЭДТА (500 мл). Фракции, содержащие фермент, объединяют и добавляют сульфат аммония до 807о-ного насыщения. Продолжают перемешивание в течение часа, центрифугируют (20 мин при 15000 ). Осадок осторожно суспендируют в буфере В, насыщенном сульфатом аммония, и хранят при 4° С. [c.245]

Ионообменная хроматография. Колонку (40x2,5 см), заполненную КМ-целлюлозой (с. 109), уравновешивают 30 мМ К-фосфатным буфером, pH 6,0, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Пер1 д нанесением на колонку раствор белка диализуют против уравновешивающего буфера до полного удаления сульфата аммония. На колонку можно нанести до 500 мг белка. После нанесения белка колонку промывают уравновешивающим буфером (примерно 75 мл). Для элюции фермента используют линейный градиент концентрации КС1 от О до [c.272]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

Тонкослойная хроматография АК на тонком слое катионообменни-ка, позволяет разделить АК в буфере pH 3,3 по величине заряда АК. В этом случае принцип разделения - ионообменная хроматография (ИОХ). Разделение АК методом ИОХ осуществляют на колонках, а анализ смеси АК проводят в специальных приборах - анализаторах АК. [c.18]

В основу работы анализатора положена ионообменная хроматография на полимере полистирольной природы, содержащем сульфогруппы (точнее натриевую соль сульфобензокислоты). Смесь АК наносят в буфере pH 3,3, в результате чего с полимером первыми будут связаны основные АК (арг, ЛИЗ, гис), затем - менее основные и нейтральные аминокислоты и последними будут связываться кислые АК (для чего постепенно сдвигают pH буфера до 6,5-8,0). При элюировании смеси аминокислот буфером, имеющим pH 6,5-8, первыми выходят наименее прочно связанные кислые АК (глу, асп), затем - менее кислые и нейтральные АК и последними элюируются основные аминокислоты. Определение АК в анализаторе основано на нингидри- [c.18]

При приготовлении подвижных фаз для ион-парной, обра-щенно-фазовой или ионообменной хроматографии получение необходимой молярной концентрации компонентов не вызывает затруднений, в то время как установка необходимого значения pH водно-органических элюентов может быть связана с затруднениями. Поэтому принято указывать значения pH не для элюента в целом, а для его водной части, до смешения с органическим растворителем. Следует одновременно иметь в виду, что ирибавление к водному буферу органического растворителя может увеличить кажущееся значение pH на 1—2 единицы, в результате чего смешанный водно-органический элюент может оказаться довольно агрессивным по отношению к химически модифицированным силикагелям. [c.208]

Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом, ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита используют изменение концентрации при pH пропускаемого через ионит буфера или введение нейтральных солей (ЫаС1, КС1). [c.203]

Некоторое время считалось, что анализ ионных или ионогенных соединений следует проводить методом ион-париой хроматографии с обращенными фазами. Однако в настоящее время исследователи останавливают свой выбор либо на традиционном варианте ионообменной хроматографии, либо на хроматографии с применением немодифициро-ванного силикагеля или оксида алюминия. В последнем случае применяют водные растворители и буферы. Хроматография на немодифицированном силикагеле или оксиде алюминия имеет существенные преимущества по сравнению с ОФ-вариаитом. Во-первых, свойства сорбента не меняются от партии к партии, во-вторых, сорбенты в меньщей степени подвержены гидролизу и, наконец, при анализе таких проб, как сыворотка, не требуется предвар1ггельная очистка [275]. Оксид алюминия ие изменяет своих свойств при использовании водных элюентов с pH от 2 до 12. Силикагель растворим в воде при рН>8, однако этот недостаток может быть преодолен при насыщении растворителя силикагелем в фор-колонке. При использовании ТСХ описанные преимущества реализуются наилучшим образом (см. разд. 1П, Б, 2). Учитывая взаимное влияние буфера, растворенного вещества, рК, состава элюента и pH, можно варьировать условия и тем самым оптимизировать процесс разделения. Разработанные [c.399]

Если электрофорез и хроматографию на бумаге можно отнести к микропрепаративным методам, то метод разделения смеси пептидов с помощью ионообменной хроматографии следует, пожалуй, считать макропрепаративным. Его главное преимущество заключается в том, что он позволяет обрабатывать большие количества материала и получать несомненно большие выходы фракций. Применение при ионообменной хроматографии летучих буферов дает возможность избежать трудоемкой процедуры обессоливания, которая осложняла ранее предложенные методики [49, 92]. Большим достижением в области ионообменной хроматографии является введение сферических смол. Их применение способствует увеличению скорости потока фракционируемых веществ через колонку и значительно сокращает продолжительность препаративного разделения. Сферические смолы в автоматических аминокислотных анализаторах обеспечивают воспроизводимую сравнительную хроматографию пептидов с высокой разрешающей способностью, т. е. позволяют автоматически проводить анализ методом отпечатков пальцев . [c.38]

Поэтому до настоящего времени не нашли широкого распространения в области полисахаридов такие виды хроматографии, как распределительная и адсорбционная (отдельные примеры см." ). Более успешным оказалось применение ионообменной хроматографии для разделения кислых и даже нейтральных полисахаридов. Ионообменниками служат обы.ч,но аниониты, полученные модификацией целлюлозы, например ДЭАЭ-целлюлоза. Для элюирования полисахаридов с колонок используют растворы солей или буферные растворы разной концентрации прочно удерживаемые полисахариды элюируют разбавленными растворами щелочей. Таким споссбом легко удается отделить кислые полисахариды от нейтральных, например, пектиновую кислоту от сопутствующего ара-бинана или сульфированные полисахариды водорослей от крахмалоподобных примесей в ряде случаев при таком способе разделения удается освободиться от примесей белка. Нейтральные полисахариды можно разделить, применив ДЭ.ЛЭ-целлюлозу в боратной форме, при вымывании боратным буфером . Описано также успешное применение ЭКТЕОЛА- [c.486]

Фенол-сернокислотный метод был использован в автоматическом анализаторе сахаров рядом авторов [48, 49 и др.]. Природные сахара, элюируемые из анионообменной смолы буфером в боратной форме, непрерывно смешивали с 5%-ным водным раствором фенола и концентрированной серной кислотой. Поглощение потока полученной смеси измерялось колориметром с фильтрами при 480, 486 и 490 нм. Скорости потоков фенола и серной кислоты, которые прибавлялись к потоку элюата, были 0,6 и 3,05 мл/мин соответственно [49]. Основанный на этом методе детектирования углеводный анализатор МагкП является прототипом анализатора, который использовался в высокоэффективной ионообменной хроматографии сахаров. Его устрой- [c.74]

Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии. Анализ смеси аминокислот начинают с разделения этой смеси на компоненты методом ионообменной хроматографии. Небольшое количество смеси вносят в вфхнюю часть колонки, заполненной частицами полистирола, содержащими остатки сульфоновой кислоты (см. рис. 5-14). Затем через колонку пропускают буферный раствор. Аминокислоты проходят через колонку с разными скоростями, поскольку их движение тормозят два фактора 1) электростатическое притяжение между отрицательно заряженными остатками сульфоновой кислоты и положительно заряженными функциональными группами аминокислот и 2) гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями аминокислот и сильно гидрофобным остовом полистирольной смолы. Для каждой из выписанных ниже пар аминокислот определите, какая аминокислота данной пары будет сходить с колонки первой (т.е. испытывать наименьшее торможение) при пропускании через колонку буфера с pH 7,0. [c.136]

Компоненты А и Б могут быть разделены ионообменной хроматографией на сульфокатионите СДВ-3 с использованием градиентной элюции 0,1 М уксусноаммонийным буфером pH 9,0—10,0 или на цефадек-се G 25 путем элюции 2н. СН3СООН. [c.339]

Нуклеозиды состоят из гетероциклического основания, присоединенного к молекуле рибозы. Так как в состав их молекул входят азотсодержащие группы, имеющие основной характер, они могут диссоциировать в растворах (при условии поддержания определенной кислотности) с образованием катионов. Поэтому для разделения этих веществ был выбран метод ионообменной хроматографии. Окончательные условия разделения были выйраны за счет варьирования ионной силы раствора буфера (рис. 9.7). [c.208]

Олигонуклеотиды дезоксиаденозинового или аденозинового ряда можно разделить с помощью ионообменного электрофореза на слоях ДЭАЭ-и ЭКТЕОЛА-целлюлозы [34] или с помощью ионообменной хроматографии на слоях ПЭИ-целлюлозы (неопубликованные данные). При хроматографии на ПЭИ-целлюлозе в 0,8—1,4 М буфере трис — НОА с pH 8,4 эти соединения разделяются в соответствии с длиной их цепи. Нри этом частично разделяются 2 -, 3 - и 5 -изомеры коротких олигомеров. Разделение этих соединений осуществляется путем нисходящей непрерывной хроматографии на предварительно уравновешенных j(ohx (см. разд. III, А). Соответствующие олигомеры уриди,лового ряда такн<е разделяются по длине цепи при хроматографии в буфере трис — НС1 с pH 8,0—8,4. [c.47]

Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно ОЕАЕ-целлюлозу и ОЕАЕ-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только от используемого материала, но также в большой степени от pH и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хроматограммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [c.108]

Ионообменную хроматографию на колонках со смолами в боратной форме применяли для разделения и анализа не только сахаров, но и полиолов [84, 85]. Для этой цели использовали такую же хроматографическую систему [85], как и в случае разделения сахаров [78], но хроматографию проводили при более высокой температуре колонки (75 °С) и при большей скорости подачи буферов (70 мл/ч). Это обеспечивало разделение смеси, содержащей этиленгликоль, пять полиолов и два аминодезокси-полиола, за 4 ч [78]. С помощью анионообменной хроматографии в боратных буферах был успешно разделен ряд производных углеводов, в том числе несколько метилгликозидов [80], а также метиловые эфиры п-ксилозы, о-глюкозы и о-маннозы [c.23]