Очистка на колонке с белком

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

Проведя на колонке с гелем измерение Fe для нескольких белков с известной молекулярной массой, т.е. фактически осуществив градуировку колонки, можно определить Vg для исследуемого биополимера и путем интерполяции с помощью соотношения (7.6) найти его молекулярную массу. Существенно, что гель-хрома-тографию можно проводить в мягких условиях, сохраняя белок в нативном, функционально активном состоянии. Если в распоряжении экспериментатора имеется специфический тест на этот белок, пригодный для его выявления в смеси с другими белками, например определенная ферментативная активность, то определить молекулярную массу можно даже в неочищенном препарате белка т.е. уже на промежуточных стадиях его очистки. Если полимер имеет четвертичную структуру, то, как правило, она сохраняется в условиях разделения и молекулярная масса представляет собой сумму масс составляющих белок субъединиц. [c.268]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Рис. 4-47. Типичные результаты, полученные при очистке белка различными методами хроматографии. В данном случае подлежащий фракционированию клеточный экстракт сначала пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую концентрацию соли. Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле проходят через колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к ионообменной смоле. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая концентрация соли. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика он был выявлен по ферментативной активности. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для гель-фильтрации (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по ферментативной активности активные фракции собирали и очищали до гомогенного состояния на колонке (В), содержащей иммобилизованный

Кроме очевидного удобства внесения препарата (в любой точке градиента pH), обнаружения и элюции белков, что обусловлено горизонтальным расположением и открытой поверхностью геля, подчеркнем относительную нечувствительность рассматриваемого метода к возможности выпадения в осадок некоторых белков вблизи их изоэлектрической точки. В описанной системе эти осадки будут уходить на дно слоя геля, освобождая его сечение для свободного протекания тока и миграции других белков. При извлечении сефадекса из секции осадок можно собрать вместе с гелем, перенести в колонку и в ходе элюции снова растворить, использовав для этого подходящий буфер или солевой раствор. Возможность примириться с выпадением осадков особенно ценна на ранних стадиях очистки, когда очищаемый белок может составлять лишь малую долю всей белковой смеси. Допуская выпадение в осадок балластных белков, можно значительно увеличить загрузку геля н повысить выход нужного белка. Практика показывает, что для узких диапазонов pH загрузку гранулированного геля при ИЭФ можно довести в случае одного основного белка до 2—4 мг на 1 мл объема геля, а для смеси белков — до 5—10 мг/мл. Прн объеме геля в 80 мл это составляет внушительную величину общей загрузки — до 800 мг белковой смеси. [c.66]

Для очистки белков точное определение объема элюции не столь существенно при условии, что балластные белки хорошо отделяются. Обычно желательно, чтобы нужный белок элюировался в диапазоне, лежащем между одной третью и двумя третями общего объема колонки, так как именно в этой области достигается наивысшее разрешение. Однако для некоторых специальных целей приходится выбирать другую область объемов элюции (см. ниже). [c.200]

Рассмотренный только что для обычной сефарозы, этот вариант элюции, естественно, находит применение и при использовании гидрофобизированной агарозы. В качестве примера процитируем недавно опубликованную работу по мягкой очистке HMG-белка из ядер печени на колонке со-аминобутилагарозы. Этот белок растворим в растворе сульфата аммония вплоть до концентрации, достигающей 70% от насыщения. Сначала такой концентрацией СА в нейтральном 0,01 М трис-буфере высаливали из экстракта ядер большое количество балластного белка. Затем надосадочную жидкость, содержащую около 40 мг белка, вносили на колонку размером 2 X X 30 см, уравновешенную тем же раствором СА. Элюцию вели снижающимся линейным градиентом концентрации СА в том же буфере (500 мл) со скоростью 20 мл/ч, т. е. примерно 7 мл/см -ч. Низкая скорость элюции характерна для всех опытов такого рода ввиду повышенной вязкости концентрированных солевых растворов и соответствующего снижения скорости диффузии макромолекул. Около 30% белка не садилось на колонку и удалялось при первоначальной промывке. В ходе элюции выходило четыре пика, в первом из которых методом электрофореза идентифицировали HMG-белок [ onner. omings, 1981]. [c.181]

Джонсон и Илан недавно отметили, что методика Колман и соавторов дает не всегда воспроизводимые результаты и загрязнения плазмидной ДНК белком и РНК в некоторых случаях оказываются значительными. Они ввели в эту методику промывку колонки с сорбированной на ней ДНК 0,35 М Na-фосфатным буфером (вместо 0,27 М) в присутствии 6 М мочевины. Такая промывка надежно удаляет РНК и белок. Они также показали возможность очистки на оксиапатите высокомолекулярной ДНК фага X. Оказалось, что в присутствии 8 М мочевины эта ДНК сорбируется на нем обратимо [Johnson, Пап, 1983]. [c.239]

Есть вариант очпстки вещества, когда опо свободно проходит через колонку, в то время как примесп на ней задерживаются. Подбор pH для этого варианта осуществляется аналогично, но выбор следует остановить на таком его значении, когда концентрация вещества в отстое только начинает уменьшаться, т. е. на лсоменте самого начала сорбции вещества на обменнике. Кстати, такой вариант очистки является наилучшим для лабильных белков — как потому, что он занимает минимальное время, так и потопу, что любой процесс сорбщш—десорбции таит в себе опасность денатурации белка. Иногда пропусканием белка без задержки последовательно через анионо-и катионообменник (при разных значениях pH буфера) удается очистить белок почти полностью. [c.291]

П р и м е р 5. Очистка ДНК-полимеразы I из Е. oli [Rhodes et al., 1979]. На первых этапах здесь использовали грубую очистку осаждением полиэтиленимином и сульфатом аммония. Затем следовал этап хроматографической очистки на колонке фосфоцеллюлозы, уравновешенной 0,04 М К-фосфатным буфером (pH 6,9) с обычными добавками, включая 5% глицерина. Введение глицерина продиктовано лабильностью фермента — его активность снижается вдвое за сутки. Препарат вносили в том же буфере, им же промывали колонку, а затем вели элюцию линейным градиентом концентрации этого буфера (0,04—0,3 М). Таким образом, вытесняющий белок контрион (К+) поставлялся самим буфером. [c.304]

Следующий вариант относится к случаям, когда в области pH, обеспечивающей сохранение нативности белка, ои несет достаточно выраженный электрический заряд, т. е. обладает явным сродством к ионообменнику одного тина. Тогда для полной очистки белка можно использовать последовательно два разных ионообменника на одном из них белок сорбировать, затем снять ого ступенчатой элюцией и пропустить через обменник иротивоиоложного типа. Нужный белок пройдет свободно, оставив на колонке примеси, не отделившиеся на первом ионообменнике. [c.305]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Колоночную хроматографию применяют для разделения экстрагированных из растений природных белковых комплексов хлорофиллов или протохлорофиллидов. Так, на колонке (1Х Х5,5 см) с гидроксиапатитом (предварительно промытым 5 мл 1%-ного додецилсульфата натрия в 0,1 М фосфатном буферном растворе, pH 7,0) в ступенчатом градиенте концентрации фосфатного буферного раствора (0,1 и 0,35 М, pH 7,0) удалось разделить два хлорофилл-белковых комплекса [32]. На одном из этапов очистки комплекса протохлорофиллид-белок (про-тохлорофиллидголохром) разделение проводили на колонке (7,5х1 5 см) с гидроксиапатитом путем последовательного, элюирования 0,2 М. КС1 и 0,25 М фосфатом калия в три-циновом буферном растворе (pH 8) при скорости подачи 20 мл/мин [33]. [c.275]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

Осадок между 40 и 90% насы-ш ения растворяли в небольшом количестве фосфатного буфера (pH 7 и пропускали через колонку сефадекса Ж-50 для отделения нжзкомолекулярных соедийений и снижения моляр-ности раствора. Последующее пропускание белка через колонку Ж-200 позволяет разделить полифенолоксидазу на две части (рис. 3). Однако при этом не происход ит существенного увеличения удельной активности ферментов. Поэтому в целях дальнейшей очистки белок вносится в колонку ДЭАЭ-целлю-лозы. [c.157]

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разработаны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эритроцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хроматографией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42], ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она используется на той или иной стадии выделения. Накопленный опыт препаративной работы выявил некоторые особенности методов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол существенно не меняет большинство физико-химических свойств. Но, как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37] или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристаллов повышается, если проводится электрофоретическая очистка фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23]. [c.562]

Большая часть методов выделения основывается на методике Чарльза и Скотта [5], которые использовали бычью печень и бычьи легкие как недорогой источник гепарина. Ткань подвергают автолизу и затем экстрагируют щелочным раствором. Растворимый белок удаляют, разрушая его с помощью ферментов, а жиры извлекают спиртом. Эта методика была упрощена обработке протеолитическими ферментами подвергалась непосредственно ткань [6, 7]. Предложен ряд методик окончательной очистки гепарина. Наибольшую ценность имеет метод, предусматривающий приготовление бензидиновой соли, которую затем превращают в кристаллическую кислую бариевую соль [8]. Кристаллическую кислую или нейтральную бариевую соль фракционируют. Новейшие методы заключаются во фракционировании цетилпиридиниевой соли [9 — 10] (см. также стр. 288) и адсорбции на колонках с различными ионообменными смолами [11 ] и ЭKTEOЛA-цeлJtюлoзoй [12]. Приведенная ниже методика основана на первоначальной методике Чарльза и Скотта [5, 8], и очистка проводится с использованием кристаллической кислой бариевой соли [13]. [c.365]

Чтобы удалить белок из плазмы крови, к последней добавляют пикрат [184] или лучше (чтобы избежать потери основных аминокислот) сульфосалициловую кислоту [185], смесь фильтруют, не содержащий белков фильтрат очищают методом катионообменной хроматографии на колонке (50X8 мм) с дауэксом AG50W-X8. Методики очистки образцов мочи перед разделением и количественным определением в нем аминокислот и пептидов описаны в работах [2, 182]. [c.69]

РИС. 6.8. Очистка интерферона на Li hrosorb RP-8 с использованием ОФ- и НФ-ВЭЖХ. а —на колонку нанесли 63 мл раствора интерферона в 4 М мочевина — 0,1 М ацетат натрия колонка промыта 1 М ацетатом натрия, pH 7,5 белок элюировали в градиенте н-пропанола (см. текст) б — фракции элюата, содержащие интерферон из а, объединяли и доводили содержание н-пропанола до 80% наносили на колонку, элюировали и [c.212]

Для элюирования антигенов клеточной поверхности мы в нашей практике обычно используем 50 мМ H I-диэтиламиновый буфер, pH 11,5, содержащий 0,5% дезоксихолата, и сразу же после элюирования нейтрализуем элюат глицином. Затем определяем поглощение при 280 нм и измеряем антигенную активность препарата. Выход препарата обычно составляет около 50% от количества антигена, нанесенного на колонку. Фракции элюата концентрируем ультрафильтрацией и, если необходимо, освобождаем от дезоксихолата с помощью диализа. Однажды при очистке Т-лимфоцитарного антигена, названного MR ОХ-34, мы не смогли определить в элюате ни антигенной активности, ни даже поглощения при 280 нм. При этом в экстракте, элюированном с колонки после нанесения антигена, антигенной активности тоже не было. Мы попробовали провести элюцию 0,5 М пропионовой кислотой без детергента и добились успеха, причем с хорошим выходом антигенной активности (А. F. Williams, неопубликованные данные). То же самое было в случае с крысиным антигеном D4(W3/25). Элюирование щелочным буфером дало неудовлетворительные результаты, но пригодным оказался 0,1 М H l-глициновый буфер, pH 2,5 [30]. При этом с колонки элюировался белок с нужной мол. массой,, однако его антигенная активность частично была потеряна. Критериями очистки в данном случае служил сам факт утраты антигенной активности исходного экстракта после нанесения на колонку, а также элюирование из нее белка с известной мол. массой. [c.179]

В другом варианте очистки белок, осажденный сульфатом аммония или натрия, после диализа растворяют в О, М трис-НС1-буфере с pH 7,5, содержащем 1,0 М Na l, и фракционируют на колонке сверхтонкого сефакрила S-200 (Pharma ia). На колонку размером 2,5X90 см наносят 2 мл раствора белка и элюцию проводят тем же буферным раствором при скорости протекания 10—15 мл/ч. [c.51]

Есть еще одно, специфическое для данного метода обстоятельство— опасность выпадения белков в осадок вблизи их изоэлектрической точки. Вертикальное расположение колонки и жидкая среда придают этой опасности особое значение. Дело не в том, что выпавший в осадок белок может сильно повлиять на электропроводность окружающего его раствора амфолитов— для этого осадок должен быть слишком плотным. Опасно другое белковые осадки могут постепенно оседать на дно колонки, нарушая плавность градиента pH и загрязняя лежащие ниже зоны. На ранних этапах очистки белков, когда их содержание в исходной смеси невелико, такая ситуация вполне реальна именно она может оказаться решающей для выбора полярности электродов. Фокусирование нужных белков может пройти вполне успешно несмотря на образование осадков, если зона фокусирования окажется лежащей выше области осаждения. Правда, в этом случае во избежание загрязнения очищаемого белка частицами осадка элюировать колонку лучше не через нижний сливной канал, а через верхний отросток, используемый для ее заполнения. С этой целью концентрированный раствор сахарозы подают от насоса через слнвиой канал в нижнюю часть колонки. [c.71]

Недавно был предложен быстрый способ очистки белка от I путем центрифугирования мини-колонки G-25, изготовленной из конической полипропиленовой пробирки емкостью 1,5 мл, проколотой на конце. При внесении в такую колонку 0,1 мл белкового раствора и центрифугировании внутри второй пластиковой пробирки (200 g 1 мин) белок полностью выходит из колонки, а свободный I в ней на 99% задерживается [Tuszynski et al., 1980]. [c.237]

Кальмодулин-связывающий пептид. Очистка гибридных белков, содержащих кальмодулин-связываюпщй пептид, была впервые описана в 1992 г. [169]. В ней используется 26-звенный пептид, заключенный в С-концевой последовательности киназы легкой цепи миозина скелетных мышц. Кальмодулин в присутствии ионов Са2+ обладает высоким сродством к этому пептиду. Прочность комплекса допускает промывку колонки при аффинной хроматографии в жестких условиях, что позволяет достигать высокой степени очистки целевого полипептида. Система особенно пригодна для очистки рекомбинантных белков из клеток Е. соН, поскольку их собственные белки не взаимодействуют с кальмодулином. При этом хроматографию можно проводить в присутствии восстанав-ливаюпщх агентов и детергентов в концентрациях до 0,1%. Эта аффинная последовательность позволяет вводить радиоактивную метку с помопдью у-[32Р] и протеинкиназы А, что используется для исследования белок-белковых взаимодействий [170]. Данную аффинную последовательность предпочтительнее вводить в С-конец исследуемого полипептида, поскольку его N-концевая локализация часто приводит к ингибированию трансляции. [c.130]

Перед тем как приступать к описанию различных методов десорбции белков и вытеснения их из ионообменников, полезно напомнить две ситуации (разд. 4.1)—тривиальную ситуацию когда а = 0 и белок проходит че рез колонку, и промежуточную, когда а значительно больше О, но существенно меньше 1. При а —О все сход 1ые белки (обычно имеющие тот же заряд, что и адсорбент) проходят сквозь колонку и, если не считать пограничных эффектов за счет различной степени молекулярной эксклюзии, собираются во фракции, объем которой незначительно превышает нанесенный объем. Если требуемый фермент находится в этой фракции, а большая часть белков уде(рживается на колонке, то это великолепный метод очистки, дающий обычно 100%-ный выход фермента. Хотя при такой процедуре, когда нужный белок не адсорбируется, реализуются не все воз- [c.127]

Выпущенные фирмой LKB новые голубые колонки пред-иазначались для использования их при высоком давлении, однако было найдено (см. брошюры фирмы LKB), что низкие давления в сочетании с медленными скоростями потока дают значительно лучшее разделение. Главное достоинство этого материала, по-видимому, заключается в том, что он характеризуется очень широким интервалом фракционирования. В заданном диапазоне молекулярных масс разрешение лишь немногим лучше, чем то, которое достигается с помощью ультрагеля или се-факрила, имеющих более узкий интервал фракционирования. Вместе с тем существующие колонки для хроматографии белков с помощью ЖХВД могут быть использованы для разделения нескольких миллиграммов и дают превосходные результаты на заключительных стадиях очистки белков, когда белок составляет лишь небольшую долю количества исходного материала. [c.205]

Смотреть страницы где упоминается термин Очистка на колонке с белком: [c.139] [c.140] [c.140] [c.182] [c.291] [c.307] [c.407] [c.419] [c.424] [c.432] [c.114] [c.436] [c.103] [c.129] [c.158] [c.226] [c.61] [c.77] [c.243] [c.379] [c.145] [c.97] [c.239]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология