Реакции инактивации ферментов

Рис. 104. Определение кинетических параметров ферментативной реакции при быстрой инактивации фермент-субстратного комплекса (на примере гидролиза нитрокатехолсульфата, катализируемого арилсульфатазой А) [26 1

Термолабильность ферментов т. е. инактивация их, связанная с разрывом полипептидных связей при повышении температуры,— денатурация белков, приводит к появлению оптимума температурного действия. С ростом температуры увеличивается скорость ферментативной реакции, но увеличивается и инактивация фермента. Поскольку белки являются амфотер-ными электролитами, для ферментов характерен также оптимум pH. Так, например, оптимум действия пепсина лежит в зоне pH = 1,5 —2,5, трипсина —8—11, сахаразы, выделенной из. дрожжей, — 4,6—5,0, сахаразы из кишечника — 6,2, амилазы из слюны или поджелудочной железы — 6,7—6,8 и т. д. Некоторые ферменты могут иметь различную величину оптимума pH для разных субстратов. Так, оптимум pH пепсина несколько меняется для разных белковых субстратов, тогда как карбогидразы [c.249]

Инактивация фермента в ходе реакции [c.254]

Если проводить изучение инактивации фермента в фермент-субстратном комплексе в условиях избытка субстрата ([S] Ks), то анализ, всего лишь одной кинетической кривой ферментативной реакции [c.257]

Если из независимого эксперимента (при использовании начальных скоростей ферментативной реакции) определить значения kz и К , то, зная начальные концентрации субстрата и фермента и долю субстрата, прореагировавшего до прекращения реакции, из соотношения (6.159) можно рассчитать константу скорости инактивации фермента в условиях опыта. [c.255]

Изменение скоростей реакции и инактивации с повышением температуры различно. Поэтому если опыт проводится за малый промежуток времени, то оптимум может лежать при более высоких температурах, чем при длительном опыте. Уже при 60° большинство ферментов инактивируется. При денатурации (инактивации) ферментов теплота активации этого процесса велика— порядка 40—ккал моль, но так как энтропия активации тоже велика, то такие реакции идут быстро. [c.250]

Обнаружение, выделение, очистка и изучение свойств фермента зависят прежде всего от наличия достаточно точного и быстрого метода определения активности фермента, а также подходящего метода определения общего белка. Точное определение активности фермента на ранних стадиях очистки часто бывает сопряжено со значительными трудностями, поскольку посторонние ферменты, присутствующие в препарате, могут конкурентно действовать на субстрат. Например, в присутствии АТФ-азы затруднено определение АТФ-зависимых синтетаз, а присутствие р-амилазы мешает определению а-амилазы. Многих трудностей, связанных, например, с подавлением активности продуктами реакции, инактивацией фермента и изменением степени его насыщения субстратом, можно избежать, если измерять начальные скорости реакции. [c.98]

В том случае, когда инактивация фермента происходит только в фермент-субстратном комплексе, т. е. когда субстрат вызывает денатурацию фермента, схему реакции следует записать в другом виде [c.256]

Ферментативные реакции характеризуются также наличием колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком температурном интервале (что приводит к температурному оптимуму реакции). Эта особенность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций объясняется наложением двух эффектов — возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах. Ясно, что при достаточно корректной постановке эксперимента оба эти явления можно изучать раздельно (см., например, 9 этой главы). [c.266]

Ингибирование бывает обратимым и необратимым. Последнее относится к реакциям, приводящим к безвозвратной потере активности фер- мента [33а]. Примером необратимого ингибирования может служить инактивация фермента ацетилхолинэстеразы под влиянием ядов нервно-паралитического действия — фосфорорганических соединений (гл. 7, разд. Г, 1). Часто стадии необратимой инактивации предшествует обратимое связывание ингибитора с комплементарным ему центром на поверхности молекулы фермента. Здесь мы не будем рассматривать математическую обработку кинетических данных, соответствующих необратимому ингибированию, и ограничимся обсуждением количествен лых аспектов действия обратимых ингибиторов. [c.27]

Под действием ультразвука происходит необратимая инактивация фермента а-химотрипсина. В табл. 7 приведены значения ферментативной активности при различных временах озвучивания раствора фермента. Найти порядок реакции и константу скорости инактивации. [c.11]

При изучении кинетики ферментативных реакций, протекающих до высоких степеней превращения субстрата, необходимо принимать в расчет возможность инактивации фермента в ходе реак- [c.168]

Из уравнения (8.41) можно рассчитать время, необходимое для завершения каждого последующего реакционного цикла (до 99%-ной степени превращения субстрата, т. е. до образования 0,99М продукта) при данной исходной концентрации активного фермента. Так, время необходимое для завершения первого реакционного цикла (при начальной концентрации активного фермента, равной 3-10 М), равно 10,3 часа при этом концентрация активного фермента после завершения цикла составит 69% от первоначальной. Для завершения второго цикла потребуется 16,3 часа, после которых концентрация активного фермента составит 38% первоначальной. Третий реакционный цикл пройдет за 45,5 часов, и концентрация активного фермента к окончанию цикла понизится до 6,7% от исходной. Практически полная инактивация фермента должна произойти во время четвертого цикла реакции. Таким образом, за 72 часа непрерывной работы реактора можно осуществить три полных реакционных цикла и получить при этом 300 л раствора 6-АПК концентрации 0,99 М. При количественном выделении продукта выход 6-АПК составит 297 молей или 64,5 кг. [c.184]

Измерение констант скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хло-ридом в присутствии разных концентраций лигандов (например, АТФ или АДФ) проводят, как описано выше. Расчет значений /С д возможен по схеме реакции инактивации, согласно которой с ингибитором может взаимодействовать фермент, свободный от лиганда (схема справедлива в случае Са—АТФазы и НБД-хлорида) [c.363]

Кинетические параметры гидролиза бензилпенициллина до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) под действием иммобилизованной пенициллинамидазы при 40° С равны йкат=15 сек- , Ят(каж)=3,1 10- м. Константа инактивации пенициллинамидазы в условиях проведения реакции равна 10 сек , причем связывание с ферментом субстрата или продуктов реакции не влияет на скорость инактивации фермента. Рассчитать, какое количество 6-АПК (мол. вес 217) можно получить с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы в периодически действующем реакторе объемом 100 л (начальная концентрация активного фермента равна 3-10 М, начальная концентрация субстрата равна 1,0 М), если степень конверсии субстрата в каждом реакционном цикле должна составлять 99%. В расчетах учесть, что константа конкурентного ингибирования пенициллинамидазы вторым продуктом реакции, фенилуксусной кислотой, равна 2,8-10 М. [c.176]

Конкурентным называют ингибитор, обратимо взаимодействующий с активным центром фермента. Как правило, конкурентные ингибиторы по структуре похожи на субстрат и могут вытесняться из фермент-ингибиторного комплекса избытком субстрата. Взаимодействие с конкурентным ингибитором не приводит к денатурации или инактивации фермента, поэтому при замене ингибитора на субстрат скорость ферментативной реакции не снижается (рис. 6.10). [c.76]

При пониженных температурах, когда скорость инактивации незначительна, скорость реакции, катализируемой ферментом, возрастает с повышением температуры вследствие изменений в величинах констант скоростей и констант равновесия, входящих в кинетическое уравнение. Если считать, что уравнение (20) типично для многих реакций с участием одного субстрата — в том числе и для молекулярных реакций, протекающих по схеме И, при замене на /гз[Т],—то оказывается, что могут изменяться К, Ка, Кь, Ка, Кь, имеющие вид констант равновесия, а также константа скорости кз. В принципе на основании кинетических данных можно определить [3, 66] путь, по которому каждая из этих констант изменяется с температурой, и в идеальном случае разложить [c.136]

При низкой температуре ферментативные реакции идут медленно. По мере повышения температуры скорость ферментативных реакций обычно повышается. По достижении некоторого оптимума повышение температуры уже ведет к падению активности фермента и вследствие этого к понижению скорости ферментативных реакций. Так, уже при температуре раствора в 50—60° часто происходит температурная инактивация ферментов. Для огромного большинства ферментов температурный оптимум лежит в пределах 37—50°. [c.54]

При изучении кинетики ферментативных реакций, протекающих до высоких степеней превращения субстрата, необходимо учитывать возможную инактивацию фермента в ходе реакции. В ряде случаев было найдено, что связывание субстрата с ферментом ускоряет инактивацию последнего в некоторых случаях субстрат не оказывает влияние на инактивацию фермента. Однако чаще всего связывание субстрата предохраняет фермент от инактивации, т. е. ферментсубстрат-ный комплекс инактивируется медленнее, чем свободный фермент. [c.254]

Из полученного выражения следует,что количество непрореагировавшего субстрата [Slgen в системе после прекращения реакции (вследствие полной инактивации фермента, при 1Е 1(, = 0) равно [c.255]

Из полученного выражения следует, что количество непрореагиро-вавшего субстрата в системе после прекращеиия реакции (вследствие полной инактивации фермента, при [Е ]о=0) равно [c.170]

Наиболее часто используется реактор периодического действия с перемешиванием, в который помещают субстрат и раствор целлюлазного препарата, а процесс гидролиза ведется в течение определенного времени с одной и той же исходной порцией субстрата и фермента. При такой конструкции реакторов возникает проблема отделения продуктов реакции от ферментов, а также отделения непрогидролизованного остатка сырья. Кроме того, скорость реакции значительно уменьшается со временем из-за ингибирования продуктами — глюкозой и целлобиозой — и инактивации ферментов при перемешивании. Для отвода продуктов из зоны реакции предложено использовать ультрафильтрацию и добавлять в реактор по мере гидролиза свежие порции субстрата [2, 3]. При этом ферменты задерживаются ультрафильтрационной мембраной и остаются в реакторе, что позволяет продлить срок их действия. Ультрафильтрационные мембраны бывают встро-еьшого типа (т.е. находятся в зоне реактора, где осуществляется гидролиз), а также могут быть выполнены в виде выносного модуля (рис. 7.1). Использование реакторов мембранного типа целесообразно осуществлять в режиме с подпиткой сырья. [c.187]

При изучении влияния как pH, так и температуры на скорость ферментативного превращения, необходимо следить, чтобы изменение, рИ или повышение температуры не выходило за допустимые пределы, индивидуальные для каждого фермента, так как это может привести к необратимой потере им каталитической активности (инактивации фермента). В этом случае в ходе ферментативногх) превращения может происходить падение скорости реакции, вызванное уменьшением полной концентрации сохранпвши.ч активность молекул, т.е. величины [E]f. Если кинетические измерения проводятся с целью получения кинетических параметров, следует ограничиваться измерениями начальной скорости превращения, т.е. проводить эксперименты в течение непродолжительного времени, за которое вкладом инактивации фермента можно пренебречь. Если же речь идет об использовании фермента как катализатора для получения некоторого продукта превращения или для удаления какого-либо нежелательного компонента из реакционной смеси, то следует подбирать оптимальную температуру, при которой положительный эффект, связанный с увеличением скорости реакции в результате повышения температуры, еще перевешивает эффект замедления от прстепенно нарастающей во времени потери фермента в результате инактивации. [c.215]

Определить константу скорости инактивации фермента вызываемой субстратом (см. схему 8.23), если фермент инактиви руется практически полностью при прохождении реакции превра щения субстрата на 20%. Начальная концентрация фермента рав на 2-10- М, начальная концентрация субстрата равна 0,8 М [c.176]

В первом случае возможны два варианта а) из реакционной среды периодически отбирают пробы, в которых (в строго фиксированные интервалы времени) реакция останавливается путем быстрой инактивации фермента б) готовят серию параллельных проб, останавливэя реакцию в них через различные интервалы времени. [c.208]

Суспензию сефарозы с иммобилизованной дегидрогеназой промывают 10-кратным объемом раствора мочевины, смешивают с 4-кратным объемом раствора мочевины той же концентрации и инкубируют суспензию при перемешивании. За ходом инактивации следят, измеряя активность фермента на носителе. Через каждые 10 мин из инкуба-ционной смеси отбирают аликвоты препарата дегидрогеназы и без отмывания геля от мочевины вносят их в стандартную систему для определения активности. Реакцию начинают добавлением субстрата через 10 с после внесения суспензии сефарозы. Исследуют влияние концентрации мочевины на процесс инактивации фермента. Оптимальной концентрацией мочевины является такая, которая позволяет провести денатурацию 3 из 4 субъединиц дегидрогеназы и перевести эти субъединицы в раствор. Подбирая концентрацию мочевины, следует получить такую зависимость инактивации фермента от времени, на которой будет выраженное плато на уровне 25% от исходной активности. При определении белка и активности на разных стадиях денатурации можно показать, что в начале плато в связанном с матрицей состояний находится димер дегидрогеназы, сохраняющий 50% от исходной удельной активности. При сохранении в процессе инкубации активности такого димера происходит постепенное отщепление неактивной субъ- [c.302]

Определение константы скорости инактивации фермента ротено-ном. Выделяют препарат Кейлина—Хартри, Кювету рН-метра (объ-<емом 4,5 мл) заполняют средой измерения активности (п. 2) и добавляют НАДН до конечной концентрации в кювете, равной 1 мМ. В кювету погружают отмытый рН-электрод, через 2—3 мин вносят 50 мкл суспензии Кейлина—Хартри ( — 25 мг/мл) и регистрируют изменение pH в ходе НАДН-оксидазной реакции. По ходу реакции в кювету вносят ротенон (0,1 мкМ) и наблюдают ингибирование ферментативной активности, связанное с образованием каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон. Внося ингибитор в различных концентрациях (0,025 0,05 0,075 0,1 0, 5 мкМ), определяют зависимость скорости инактивации от концентрации ротенона и рассчитывают величину константы второго порядка скорости инактивации фермента ингибитором. [c.441]

У адаптированных водорозлей восстановление б.юкировано, и реакция с восстановителем-заменителем (например. На) делается возможной при характерном преобразовании ферментной системы (активация гидрогеназы и инактивация фермента, выделяющего кислород). [c.175]

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обратимое или необратимое ингибирование. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, включая лекарственные препараты, специфически связывающие ту или иную функциональную группу в молекуле фермента, выключая ее из химической реакции. Так, йодацетат I H,—СООН, его амид и этиловый эфир, пара-хлормеркурибензоат lHg—С Н,—СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента [c.147]

Известно, что многие ферменты содержат в активном центре 8Н-груп-пы, абсолютно необходимые для каталитической реакции. При их окислении ферменты теряют свою активность. Предполагают, что одной из главных функций глутатиона является сохранение этих ферментов в активной восстановленной форме. Окисленный глутатион может восстанавливаться под действием глутатионредуктазы, используя НАДФН. Кроме того, глутатион может оказывать ингибирующее действие на некоторые белки. В частности, известная реакция инактивации инсулина под действием глутатионинсулинтрансгидрогеназы, в которой 8Н-глутатион является донором водородных атомов, разрывающих дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями молекулы инсулина. Установлена также коферментная функция глутатиона, в частности для глиоксилазы I. Ранее обсуждалось участие глутатиона в транспорте аминокислот через клеточную мембрану. [c.453]

Для анализа в две пробирки диаметром 18 и длиной 180 мм наливают по 10 мл субстрата и ставят их в ультратермостат или водяную баню с постоянной температурой 30 0,2° С на 5—10 мин (чтобы растворы приняли необходимую температуру). Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую (контрольную) 5 мл дистиллированной воды, во вторую (опытную) — 5 мл рабочего раствора фермента. Смеси быстро перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин, отмечая время по секундомеру. По истечении этого времени из пробирок отбирают по 0,5 мл раствора и переносят их в конические колбочки с предварительно налитыми туда 50 мл рабочего раствора йода и 0,1 н. раствора соляной кислоты. Жидкости взбалтывают, при этом одновременно происходит инактивация фермента и йодокрахмальная реакция. Растворы приобретают следующую окраску контрольный — сннюю, опытный — фиолетово-бурую различной интенсивности в зависимости от степени гидролиза крахмала. [c.299]

Каждал из ферментативных реакций, протекающая со скоростью характеризуется значением максимальной скорости У (г), константой Михаэлиса Kм i) и константой ингибирования К,(г). Для реакций образования целлобиозы из аморфной или кристаллической целлюлозы учитывается инактивация ферментов, где к,п — константа инактивации. [c.174]

Как известно, активность первых двух ферментов, приведенных в таблице, определяется наличием в них тио.товой группы. Гузман Баррон предположил, что инактивация как этих, так и других ферментов, содержащих в своем составе тиоловые группы, вызвана окислением цистеиновых остатков по типу, который уже рассматривался выще. Весьма вероятно, что реакция окисления цистеиновых остатков играет главную роль при лучевой инактивации ферментов. Для ферментов, содержащих тиоловые группы, ионный выход всегда близок к единице (табл. 18) он значительно выще, чем для других ферментов, но меньше, чем следовало бы ожидать при окислении тиоловых групп по схеме Гузмана Баррона [53] (стр. 222, 223), и значительно меньше ионных выходов, полученных для цистеина. [c.240]

В течение ряда последних лер мы проводили исследования по изучению роли свободных радикалов в процессах, моделирующих биологическое действие радиации. Изучали радиационный распад ДНК, инактивацию ферментов, реакцию свободных радикалов облученных белков, радиолитическое окисление ляпидов и действие фенольных соедийенщ ИЗ модельные реакции фенолог [22—26], [c.318]

Из косвенных методов чаще других используется метод, основанный на изучении рН-зависимости некоторых параметров реакции, таких, например, как максимальная скорость или константа Михаэлиса. Изменение этих параметров в зависимости от pH часто напоминает по своему характеру титрование одной ионизируемой группы (см. гл. VI). Можно поэтому определить соответствующее значение pi a этой группы и попытаться идентифицировать ее путем сравнения полученного значения рЛТ с известным значением p7i для боковых цепей различных аминокислот. Все это сопряжено с известными трудностями. В результате взаимодействия с соседними группами в белке, а также с субстратом или буфером величина pZ для ионизируемой группы в белке может заметно отличаться от соответствующей величины для той же группы, присутствующей в свободном виде в растворе. Кроме того, величины pifa для различных титруемых групп белков в значительной степени перекрываются. Например, группа с pif 10 может быть либо аминогруппой, либо фенольной гидроксильной группой, либо сульфгидрильной группой. В некоторых случаях определение величины A/i ионизации помогает приписать данное значение рЛТ той или иной группе, однако нередко однозначное отнесение полученного значения рЖ к определенной функциональной группе оказывается все же невозможным. Известно также, что рН-зависимость может отражать титрование нескольких остатков, а не какой-либо одной индивидуальной группы. Наконец, крутые перегибы кривых, описывающих зависимость скорости реакции от pH, могут вызываться ие только титрованием, но также и другими факторами, например изменением стадии, лимитирующей скорость реакции. К счастью, все эти ослол<иения возникают не всегда. Часто заключения, сделанные на основании рН-зависимости, удается подкрепить другими методами. Исходя из данных по зависимости максимальной скорости реакции от pH, следует, например, считать, что у всех ферментов, перечисленных в табл. 29, в каталитическом акте участвует остаток гистидина. Для химотрипсина это заключение подтвернодается тем, что соответствующий хлоркетон, являющийся аналогом субстрата химотрипсина, избирательно реагирует с одним остатком гистидина и вызывает таким путем инактивацию фермента. На основании [c.199]