Выделение белков и ферментов

Разрушительному действию подвергаются ДНК, липиды, нуклеиновые кислоты. Основой биологического механизма, выполняющего защитные функции, служит фермент супероксиддисмутаза. Изучение этого фермента началось еще в 1938 г., когда из крови вола был выделен белок сине-зеленого цвета, содержащий медь. Позже выяснилось, что он содержит также цинк и обладает ферментативной активностью ио отношению к реакции окисления супероксид-радикала. Предполагают, что реакция идет по схеме [c.190]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Аффинная хроматография высокоспецифичный и эффективный метод выделения специфических белков. Вследствие того что молекулы большинства белков легко разрушаются при использовании для их выделения и очистки многих традиционных методов, применяемых в органической химии, таких, как возгонка и экстрагирование различными растворителями, биохимики вынуждены были разработать для этой цели специальные методы. Нередко удается выделить какой-нибудь один белок, присутствующий в смеси, содержащей несколько тысяч других биомолекул, в концентрации 10 -10 М. Один из таких методов, известный под названием аффинной хроматографии, сыграл решающую роль при выделении и очистке ряда ферментов, иммуноглобулинов и рецепторных белков. В основе метода лежит тот [c.163]

Многие ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, содержат атомы железа. Примером могут служить цито-хромы, присутствующие в каждом живом организме. Они содержат гем-группы, связанные с белком иначе, чем в молекулах миоглобина и гемоглобина. Интересным является белок, содержащий негемовое железо (так называемый высокопотенциальный железосодержащий белок), выделенный из клеток нескольких видов пурпурных бактерий. Он может обратимо одноступенчато (путем потери одного электрона) окисляться ионом гексацианоферрат(П1) кислоты [Ре(СК)б] и другими окислителями и, вероятно, катализирует какие-то окислительные процессы, важные для физиологии бактерий. На рисунке, где приведена [c.443]

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). [c.26]

Молекулы белков очень сложны и обладают уникальными свойствами, поэтому нет универсальных методов выделения и очистки белков каждый белок требует индивидуального подхода и специальных методов. Подходящей процедурой будет та, которая позволяет получить максимальное количество белка в наиболее чистом виде и с сохранением природных свойств (как принято говорить - в нативном состоянии). При выделении ферментов очень важно сохранить их активность. [c.24]

В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука, граничащая с искусством В самом деле, если химическая реакция протекает с выходом 0,1 % и с сотней побочных продуктов, то вряд ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем более, очистки) целевого продукта Но именно такие задачи встают перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный белок В работе с биологическим материалом необходимы и важны знания предварительных характеристик по содержанию белка в различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же вида животного) От этого зависит выбор материала, его предварительная подготовка для включения в технологический процесс [c.54]

Рг), который определяется как отношение выделенного фермента к общему количеству белка, деленное на исходное отношение фермент—белок. При освобождении фермента с аффинного сорбента, не включающем стадию промывки, Р/ очень низок. Очевидно, что без стадий промывок очистка не эффективна, даже с благоприятно низкими величинами Кь и достаточно высокими величинами Кь, поскольку полученный фермент загрязняется белками. [c.28]

Выяснение механизмов, регулирующих биосинтез ферментов и их активность, стало возможным благодаря выделению мутантов с дефектами регуляции. Выделены мутанты нескольких типов, в том числе 1) не образующие функционально полноценного репрессорного белка или содержащие его в сильно повышенном количестве 2) с оператором конститутивного типа, который не способен связывать репрессорный белок 3) с аллостерической нечувствительностью, у которых определенный фермент не может распознавать эффектор. Мы опишем некоторые методы, с помощью которых выделяют таких мутантов. [c.497]

Недавно открыт новый белок — п р о к о л л а г е н (В. Н. Орехович). Как показывает название, он, по-видимому, является биологическим предшественником коллагена. Проколлаген (наряду с коллагеном) найден в коже и ряде других органов человека, кролика, птиц, рыб и др. Он был выделен в кристаллическом виде (рис. И). Изучение свойств проколлагена показало, что он отличается от коллагена своим аминокислотным составом, а также тем, что расщепляется всеми ферментами, гидролизующими белки. [c.53]

НОГО нами для бактерий оксигеназа разрывает индольное ядро Ь-триптофана с образованием М-формилкинуренина. Это первый фермент в процессе распада триптофана у млекопитающих и у бактерий (фиг. 25). Количество этого фермента в печени крыс можно повысить, добавляя им в пищу Ь-триптофан. Выделенный белок не проявляет ферментативной активности по отношению к Ь-триптофану, если в реакционную смесь не добавить какой-нибудь восстановитель, например аскорбиновую кислоту. Этот процесс, как было показано, состоит из двух стадий. Во-первых, неактивный фермент (апофер-мент) должен соединиться со своей простети-ческой группой, гематином, образуя голофермент. Для этой реакции необходим триптофан (или его аналог), так же как и источник гема-тина, такой, как метгемоглобин. Во-вторых, голофермент образуется в окисленной форме и должен быть восстановлен, чтобы осуществлять окисление триптофана. Для этого процесса восстановления необходим триптофан в небольших концентрациях [c.76]

Если бы в биологической системе образовался белок неправильной конформации, он был бы в большей степени подвержен протеолизу, чем белок, имеющий правильную структуру. Продукты его разложения (которые также подверглись бы гидролизу) сыграли бы роль строительного материала при синтезе биологически активных белков. В процессе получения белка производится выделение и очистка активного материала и удаление неактивного, как это, например, имеет место при выделении фермента. Не удаляется ли при этом вместе с белком, инактивированным в процессе выделения, тот самый неактивный белок, о котором мы только что говорили Подобные спекуляции не лишены интереса. Не исключено, что возможность выделения активных белков с помощью довольно жесткой процедуры определяется тем, что хотя последний и теряет свою активность, однако она восстанавливается при помещении его в более мягкие условия, поскольку первичная структура обеспечивает возвращение к активной конформации. [c.281]

Известно, что с повышением степени очистки фермента или иного белка его устойчивость обычно падает. Так как белки могут стабилизироваться другими белками (часто балластными или примесями ), поскольку их стабилизируют продукты реакции, коферменты, продукты распада белков или даже нейтральные соли, то при производстве ферментного препарата следует учитывать возникающие при их удалении опасности. Излишняя степень очистки почти всегда нежелательна. В каждом отдельном случае необходимо ясно представлять себе, в какой мере белок должен быть освобожден от примесей, не снизит ли это резко его устойчивости как при выделении, так и при хранении и использовании фермента в производстве. Кстати, высокая очистка обычно и сильно удорожает выпускаемый препарат. Несмотря на все эти замечания, еще раз подчеркиваем, что будущим в ферментной промышленности, как и в большинстве других областей использования ферментов, является, по-видимому, применение их чистых препаратов. При решении возникающих задач, следовательно, надо учитывать различные стороны вопроса. Можно иметь в виду, что часто применяемые наполнители [c.168]

Такая модификация ограничивает действие трипсина расщеплением по остаткам аргинина, что приводит к большим фрагментам, чем те, которые образуются после действия фермента на не-модифицированный белок. Малеильную группировку можно удалить при pH 2—3 при комнатной температуре для того, чтобы выделенные в результате первого расщепления фрагменты можно было гидролизовать на более мелкие с помощью того же фермента. Такая процедура помогает при определении порядка связи пептидов в исходном белке. Альтернативно, е-аминогруппу лизиновых остатков можно модифицировать S-этилтрифторацетатом, что приводит к Л -трифторацетильным производным схема (28) . После расщепления по остаткам аргинина Л -трифторацетильную группу можно удалить обработкой водным пиперидином при 0°С. [c.275]

По-видимому, самым убедительным способом доказательства механизма двухтактного замещения является выделение замещенной формы фермента из реакционной смеси в условиях, соответствующих протеканию ферментативной реакции, однако в отсутствие второго субстрата. Если удается это осуществить и показать, что выделенный белок содержит группировку субстрата, подлежащую переносу, но не остаточную группировку донорного субстрата, доказательство Может считаться достаточно строгим. Если, помимо того, можно показать, что выделенное промежуточное производное фермента достаточно быстро реагирует с соответствующим вторым субстратом, образуя второй продукт, и, возможно, с первым продуктом, образуя исходный субстрат, доказательство может считаться полным. Все это настолько ясно, что не требует дальнейших разъяснений. Этот метод, однако, применим, далеко не всегда, так как не всегда удается найти заместитель, который давал бы с ферментом продукт, достаточно стабильный для целей выделения. Тем не менее в литературе описано несколько примеров промежуточных производных ферментов, отвечающих всем этим критериям ацил-а-химо-. трипсин [12], серусодержащая роданеза [13, 14] и КоА-трансфераза [15, 16]. [c.127]

Из разрушенного смесью фенол — вода нуклеопротеина TMV Анде-рер [55] смог иыде.лить белок TMV (из фенольного раствора). Выделенный белок снова соединялся с нуклеиновой кислотой TMV с образованием кристаллического нуклеопротеина TMV. Это показывает, что белок не денатурируется в жидком феноле необратимо. Кикхефен [56] недавно показал, что различные ферменты — рибонуклеаза, химотрипсин, трипсин, лизоцим и др.— после растворения в жидком феиоле можно количественно выделить сходным способом без потери ими ферментативной активности. Некоторые ферменты даже выдерживают нагревание в фенольном растворе до 80—100°. [c.331]

Противоречивые данные получены также при исследовании избирательности связывания белков с различными фосфолипидами. Так, селективность взаимодействия фосфолипидов, несущих определенные полярные группы, была выявлена для родопсина, На+, К -АТФазы из 8диа1из a antus, цитохром-с-оксидазы, Са +-АТФазы. Вместе с тем многочисленные эксперименты по реактивации выделенных мембранных ферментов путем добавления экзогенных липидов и детергентов показали, что в большинстве случаев не существует специфических белок-липидных взаимодействий, обеспечивающих ферментативную активность разные типы липидов могут одинаково влиять на функционирование мембраносвязанных белков. Несмотря на то, что взаимодействие липидов с интегральными белками носит в основном гидрофобный характер, электростатические силы связывания заряженной гидрофильной части белковой молекулы и полярных групп окружающих липидов могут существенно влиять на характер липидного микроокружения белка. Кроме того, для активирующего действия липидов по отношению к некоторым мембранным ферментам важны такие факторы, как степень подвижности ацильных цепей и способность липидов образовывать мицеллы. По-видимому, сродство разных липидных молекул к белкам мембраны определяется не спецификой белков, а спецификой липидных молекул. [c.60]

Долгое время считали, что белковые вещества существуют только в аморфном состоянии. Однако в 1906 г. наш соотечественник А. Д. Розенфельд впервые закристаллизовал оксидазу, выделенную из редьки, а в 1926 г. американский ученый Д. Самнер получил другой кристаллический белок—фермент уреазу (от лат. urea—мочевина). Затем в течение последующих лет были получены в кристаллическом состоянии десятки белков. [c.33]

Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и живот ных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помош ью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение веш ества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию ( молекулярное просеивание ), новые методы электрофореза и др. [c.17]

Флавиновый фермент имеет нормальный потенциал —0,06 в (гпггересно, что белок, входящий в состав фермента, снижает потенциал активной небелковой части фермента от —0,208 до —0,06 в). Этот фермент мол<ет восстанавливать редокс-системы только с более высокими потенциалами, в частности цитохромы, а окислять системы с более низкими потенциалами (н приведенной схеме — коде-гидразу). Это обстоятельство объясняет, почему в данной схеме перенос электронов и протонов происходит сверху вниз в с.дучае обратного процесса должно было бы протекать восстановление систем с более низким потенциалом, что противоречит изложенной теории. Кроме того, строгая последовательность ферментов в цепи окисления исключает резкую разницу между потенциалами двух взаимодействующих систем, а это обусловливает постепенное выделение энергии окисления. Указанные особенности биологического окисления позволяют организму более полно регулировать получение и использование энергии. [c.55]

Роль рибофлавина в биологическом окислении была установлена в результате большого интереса биохимиков к процессам дыхания клетки. В 20-х годах Варбург обнаружил, что кислород реагирует с каким-то железосодержащим катализатором дыхания. Позже было показано, что краситель метиленовый синий часто может замещать кислород в качестве окислителя. Окисление в эритроцитах глюкозо-6-фосфата метиленовым синим требовало присутствия как фермента , так и кофермента , позднее идентифицированного как NADP+. Было установлено, что выделенный из дрожжей желтый белок обладает примечательным свойством обесцвечиваться под действием восстановительной системы, содержащей глюкозо-6-фосфат, белок и кофермент из эритроцитов. [c.253]

Свободная энергия регулирует точность. При образовании одной пептидной связи расщепляются четыре связи аденозинтрифосфата (АТР) и гуанозинтрифосфата (GTP) [22] с выделением свободной энергии, 25 ккал на моль аминокислоты [23]. Лишь часть этой энергии расходуется на образование пептидной связи в эндергони-ческой реакции, стандартная свободная энергия которой в воде составляет 5 ккал/моль [24]. Остальное затрачивается на трансляцию информационной РНК к полипептиду и на максимально точное проведение трансляции. Гидролитическому распаду пептидных связей препятствует высокий барьер энергии активации, который, однако, легко преодолевают многочисленные ферменты,, расщепляющие белок (протеазы). [c.26]

Механизм по схеме (22) расширен на схеме (23) [45]. Известно, что основание Шиффа (22) легко восстанавливается гид-ридными донорами. Подходящим агентом, который можно использовать в водном растворе, является борогидрид натрия. Поэтому можно было надеяться зафиксировать интермедиат (22), восстанавливая его в стабильный вторичный амин при проведении реакции в присутствии NaBH4. Эксперимент проводили с использованием С-меченного ацетоацетата, и фермент инактивировался, как и предполагалось для случая, если ЫНг-группа активного центра превращается во вторичный амин (ЫаВН4 не инактивирует фермент в отсутствие субстрата). Неактивный белок, выделенный из реакционной смеси, содержит, как и предполагалось, один эквивалент С на молекулу. Затем белок был подвергнут деградации обычными методами и изучен его аминокислотный состав (эти методы обсуждаются в части 23). Аминокислотный анализ показал в сравнении с нативным ферментом исчезновение одного остатка лизина и появление новой аминокислоты. Последняя была иден- [c.480]

В постсинаптической мембране мионевральпого соединения установлена высокая концентрация ацетилхолинэстерааы (АХЭ) — фермента, катализирующего гидролиз АХ. Показано, что рецепторным веществом является специальный гидрофобный белок. Этот белок был выделен из мембран нервных окончаний. Он имеет большое сродство к АХ и к другим холинэргическим веществам. Де Робертис предложил модель постсинаптической мембраны (рис. 11.22). В мембрану включены дискретные рецепторные [c.382]

Со времени выделения Дж Б Самнером в 1926 г уреазы в кристаллическом виде несомненно признавалось, что все ферменты — это простые или сложные белки В 1981—1982 гг Т Р Чех с сотрудниками открыл каталитическую активность у рибонуклеиновой кислоты Этим опровергается универсальность принципа "фермент — это белок", а кроме того привносятся новые концепции в ранние этапы эволюции живой материи Некоторые исследователи (Дж Дарнелл-младший) считают, что первым веществом наследственности была РНК, а не ДНК, поскольку ей присуща [c.61]

Белок, осажденный высаливанием, можно отделить от белков, оставшихся в растворе, центрифугированием или фильтрованием и вновь растворить, добавив воду или буферный раствор. Этим методом можно концентрировать растворы (после осаждения раст1ворить белок в меньшем объеме растворителя). Метод высаливания белков широко используется в научно-исследовательских лабораториях при выделении и очистке различных белков (ферменты, гормоны и др.) и в производственных условиях для получения белковых препаратов (лечебные сыворотки, кристалличеекиёОелки и др.). [c.24]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

В настоящее время общепринято, что ферменты являются белками. Финский биохимик А. И. Виртанен выдвинул обратное положение, что белки представляют собой ферменты. Если это второе положение нужно рассматривать как преувеличение, то первое справедливо без исключений, хотя, правда, каталитической активностью могут обладать и фрагменты белковой молекулы. Первое доказательство белковой природы ферментов было получено в 1926 г., когда фермент уреазу выделили в виде чистого кристаллического препарата и установили, что этот фермент является белком глобулином. Эти результаты американского ученого Самнера противоречили взглядам выдающегося немецкого химика Рихарда Вилльштеттера. Вилльштеттеру в некотором отношении не повезло, так как он работал с ферментом пероксидазой, обладающей чрезвычайно высокой каталитической активностью. В процессе очистки были получены активные препараты пероксидазы, не содержащие заметных количеств азота, а в ряде случаев в них не удавалось обнаружить ни углерода, ни азота. После выделения кристаллической уреазы Вилльштеттер считал, что полученный белок был лишь неспецифическим носителем лабильной и каталитически [c.9]

Фермент рибонуклеаза из поджелудочной н<елезы быка — хорошо охарактеризованный белок, полная структура которого теперь уже известна (см. стр. 94)— расщепляет нолинуклеотидную цепь аналогичным способом. Этот фермент представляет собой эндонуклеазу, т. е. он атакует внутри-нуклеотидные связи. При этом для действия его необходимо, чтобы фосфатная группа, участвующая в образовании чувствительной к расщеплению Р — 0-связи, была присоединена в положении 3 пиримидинового нуклеозида. Первая стадия расщепления, т. е. образование циклических фосфатов из полинуклеотидов, по-видимому, обратима. Того же типа расщепление (по положению Ь) вызывают фосфодиэстеразы, выделенные из различных источников растительного происхождения (например, из растений гороха, табака или райграса). Все эти фосфодиэстеразы относительно неспецифичны в том смысле, что для их действия безразлична природа оснований, входящих в состав чувствительных нуклеотидов. Известен, однако, фермент, выделенный из Ba illus subtilis, который, по-видимому, обладает специфичностью, дополняющей специфичность панкреатического фермента (т. е. рибонуклеазы, выделенной из поджелудочной железы). Он катализирует по преимуществу гидролитическое отщепление остатков, соседних с З -пурино-выми остатками. Еще более высокой специфичностью обладают ферменты, выделенные из неочищенных препаратов такадиастазы. Один из них — рибонуклеаза Т1 — катализирует расщепление только тех межнуклеотидных связей, в образовании которых участвуют З -гуаниловые нуклеотиды, а второй — рибонуклеаза Т2 — расщепляет только связи, образованные с участием З -адениловых нуклеотидов. [c.129]

В других окислительных коферментах имеются иные, чем изоаллоксазиновая, восстанавливающиеся группы. Простейший опыт, свидетельствующий о том, что ФАД является специфическим коферментом глюко-зооксидазы, заключается в следующем если бы отщеплением кофермента от фермента можно было получить нативный неактивный белок, то возвращение активности при добавлении к этому белку ФАД говорило бы о специфичности этого кофермента. Но стандартный метод непригоден в данном случае, так как белковая часть глюкозооксидазы денатурируется нри всех операциях, в которых отщепляется кофермент. Установлено, что ФАД является простетической группой другого фермента — оксидазы /)-аминокислот, в которой неактивный белок может быть выделен в нативном состоянии. При кипячении с водой белковая часть глюкозооксидазы денатурируется и освобождается кофермент. Добавление полученного раствора к раствору нативного белка оксидазы Д-аминокислот приводит к восстановлению активности этого фермента, что является доказательством того, что ФАД — простетическая группа для обоих ферментов. [c.710]

Фермент каталаза содерн ится в животных тканях, наиболее богаты им печень и эритроциты. Кристаллическая каталаза, выделенная из печени, представляет собой содержащий железо белок с молекулярным весом около 250 ООО, она является одним из наиболее активных биологических катализаторов одна молекула этого фермента разлагает при О за одну лшнуту свыте [c.246]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология