Электрофорез в гелях, разделение

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

С лучшими результатами была использована распределительная хроматография в системе фенол—бутанол—вода [417], хроматография на бумаге 387], колоночный электрофорез [4181, разделение на полисахарид-геле сефадексе [403] и хроматография на порошке целлюлозы [419]. Для идентификации флавиновых соединений использовалась хроматография на бумаге в различных системах растворителей [420]. [c.558]

Рекомендуется использовать электрофоретический прибор с охлаждением. По окончании электрофореза область разделения исследуемого образца в агарозном геле вырезают в виде узкой продольной полосы, содержащей белковые фракции (фиг. 33), и помещают ее на пластинку агарозного геля с иммунной сывороткой. [c.155]

В этой главе говорилось о том, что для разделения веществ биологического происхождения лучше всего использовать зонный электрофорез, гель-фильтрацию или ионный обмен на полимерах с низкой степенью поперечной сшивки. Подтвердите справедливость этого положения, оперируя примерами биохимических разделений, достигнутых при помощи этих трех методов. [c.491]

Этап 5. Разделение компонентов смеси по размеру с помощью электрофореза в пластине полиакриламидно-I о геля. Короткие фрагмент ы мигрируют быстрее длинных. По завершении электрофореза гель помещают на рентгеновскую пленку, на которой проявляются полосы, соответствующие распределению по длинам меченых фрагментов в каждой реакционной смеси. [c.45]

После электрофореза в агарозном геле, так же как после электрофореза в других гелях, разделенные компоненты обнаруживают путем окрашивания различными красителями или методами денситометрии в УФ-свете. Поскольку высушивание агаровых гелей не представляет трудности, в УФ-свете можно получать контактные отпечатки с высушенных пленок геля. [c.370]

Олигонуклеотиды можно разделять путем электрофореза в гелях, содержащих мочевину, при pH 3,5 [296, 1074, 1075]. В этих условиях на электрофоретическую подвижность влияет как длина цепи олигонуклеотида, так и его нуклеотидный состав. Сочетание этого метода с обычным электрофорезом улучшает разделение полинуклеотидов со сравнительно небольшими молекулярными массами. [c.379]

После проведения электрофореза гель окрашивают бромидом этидия (табл. 4), и для оценки полноты проведения фореза и регистрации картины разделения фрагментов относительно маркеров размера гель фотографируют в УФ-свете. [c.201]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

Электрофорез применяют для очистки различных фармацевтических препаратов. В Фармакопее СССР (изд. 10) предусмотрено установление степени чистоты по электрофоретической однородности ряда антибиотиков, витаминов и других веществ. Электрофорез (ионофорез) является одним из методов введения лечебных препаратов в организм человека. Широкое применение как аналитический и препаративный метод разделения и выделения различных лекарственных веществ и биологически активных соединений нашел электрофорез на бумаге, а также в агаровом или крахмальном геле. Эти методы применяют также при диагностике ряда заболеваний путем сравнения фракционного состава (по числу и интенсивности зон на электрофореграмме) нормальных и патологических биологических жидкостей. [c.408]

Согласно той же формуле (18.4) коэффициент диффузии обратно пропорционален вязкости растворителя. Поэтому особенно высокого качества разделения удается достигнуть, проводя электрофорез в гелях, вязкость которых чрезвычайно высока. Для разделения белков и нуклеиновых кислот наиболее широко используются полиакриламидные гели (см. 8.5). С помощью электрофореза в таких гелях удается в один прием разделить десятки компонентов. В качестве иллюстрации на рис. 91 приведен результат разделения смеси фрагментов нуклеиновой кислоты разной длины от 40 до 72 нуклеотидных звеньев. Электрофорезу подвергались фрагменты, меченые радиоактивным фосфором После завершения разде- [c.331]

Электрофорез [79]. Для разделения можно использовать различие в скоростях движения ионов в электрическом поле. Следует различать явление простого электрофореза и электрофореза на носителе. Явление свободного электрофореза известно давно, но в последние 20 лет этот метод вытесняется методами электрофореза, проводимого на агаровом геле, крахмале, стекляН [c.386]

При электрофорезе в поддерживающих средах наблюдается и электроосмос, влияющий на разделение белковых фракций, особенно если электрофорез проводить не на бумаге, а в агаровом или крахмальном геле. [c.191]

Различают свободный электрофорез и электрофорез в поддерживающих средах. При свободном электрофорезе изучаемую смесь белков помещают в буферный раствор, контактирующий с электродами. Установка для свободного электрофореза сложна она имеет фотооптическую систему для регистрации результатов разделения белковой смеси. Второй тип электрофореза предусматривает использование поддерживающих сред (специальной хроматографической бумаги, ацетатной целлюлозы, агарового или крахмального геля и т. п.), которые сначала пропитывают буферными растворами, а затем помещают на них исследуемую белковую смесь. Концы бумажных полос, агаровых или крахмальных блоков и т. п. контактируют обычно с буферным раствором, в который погружены электроды, соединенные с источником постоянного электрического тока (рис. 95 [c.218]

Диффузионные качества гелей, как об этом указывалось ранее (см. стр. 218), широко используются в лабораторной практике для электрофореза белков. Электрофорез в агаровом или крахмальном геле имеет определенные преимущества по сравнению с электрофорезом на бумаге, так как при этом выявляется большее количество и более четкое разделение белковых фракций как в нормальных, так и в патологических сыворотках крови. [c.240]

Применение гелей в электрофорезе основано на том, что биополимеры с точки зрения зарядов являются полианионами или поликатионами с одинаковыми поверхностями, поэтому разделение в постоянном электрическом поле без дополнительных вспомогательных средств становится невозможным. Поскольку эти биополимеры в самом деле резко различаются по своим размерам, добавка некоторого геля может сильнее влиять на подвижность полимера с большими размерами молекул. Это приводит впоследствии к разделению молекул по размерам, т.е. по растущим ММ. Основной областью применения гелевого электрофореза является разделение молекул ДНК, а также разделение белков, которые подвергаются денатурированию в растворе ДДСН. Кроме того, гели в классическом электрофорезе применяются обычно в качестве стабилизаторов, хотя и не дающих вклад в разделение. [c.96]

Повышенная разрешающая способность электрофореза в крахмальном геле позволяет делить смесь белков на еще большее число компонентов. Вместо 5 классических фракций сыворотки можно получить 8—10 фракций. Более того, с помощью элекрофореза в крахмальном геле можно выделить несколько разных компонентов из препарата, который по данным других методов разделения считался гомогенным. Примеры такого рода встречаются при анализе миеломных белков. При электрофорезе на бумаге, ацетат-цел-люлозной мембране или в агаровом геле миеломные белки, относящиеся к IgG- и IgA-типам, образуют гомогенные зоны. Однако иногда в сыворотке больного можно обнаружить неоднородные фракции миеломных белков, например в случае мультиклональной миеломы или миеломы с агрегирующим белком IgA. Микрогетерогенность таких миеломных белков хорошо выявляется при электрофорезе в крахмальном геле. Вместо картины гомогенности, которую они дают при других постановках электрофореза, при разделении в крахмальном геле можно видеть несколько четко разграниченных зон [17]. [c.13]

На третьем этапе проводится электрофорез всех четырех проб в полиакриламидном геле. Для того чтобы условия разделения были идентичными во всех четырех пробах, пробы наносят на один гель и разделяют на четырех параллельных дорожках этого геля. Разделение, как уже говорилось в 7.1, проходит по длине, и положение каждого фрагмента, детектируемое радиоавтографически, дает его длину, а тем самым и положение соответствующего мономера в исходной цепи. Таким образом, на одной дорожке, если речь идет о ДНК-фрагменте, определяется положение всех остатков тимидина, на другой — всех остатков дезокси-цитидина, на третьей — всех остатков дезоксигуанозина и на четвертой — всех остатков дезоксиаденозина. В сумме это дает положение в исходном полинуклеотиде всех мономеров, а это и означает, что определяется его первичная структура. Эта структура в один прием считывается с геля, причем при достаточной длине дорожки геля одновременно может быть определено расположение сотен мономерных звеньев. Идеализированная схема такого разделения и определяемая последовательность приведены на рис. 77. [c.278]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Для электрофореза можно использовать один буферный раствор определенного состава ( непрерывный буфер) либо систему из двух буферных растворов ( ступенчатый буфер). В последнем случае собственно разделению образца на компоненты предшествует стадия его концентрирования в виде узкой стартовой зоны на границе раздела буферов (ступенчатый электрофорез). Если разделение проводится в трубках с полиакриламидным гелем, образующиеся зоны имеют форму дисков. В условиях изотахофореза [50] мигрирующие вещества образуют соприкасающиеся друг с другом зоны, которые расположены между лидирующим и замыкающим электролитом. Чтобы эти зоны не соприкасались, в исходную смесь добавляют вещества- разделители (spa ers), которые по своей электрофоретической подвижности занимают промежуточное положение между двумя наиболее близкими по этому параметру компонентами смеси. Таким образом, изотахофорез в опре- [c.28]

Несмотря на то что применение электрофореза для разделения высокомолекулярных комплексов имеет ряд ограничений как в теоретическом аспекте, так и в отношении возмоишости точного предсказания получаемых в этом случае результатов, суш,ествует несколько электрофоретических методов, очень удобных для разделения вирусов. Классический метод электрофореза с подвижной границей в значительной степени вытеснен зонным электрофорезом. Часто применяют электрофорез на фильтровальной бумаге, смоченной подходяш,им буфером. Однако электрофорез в крахмальном или ацетатно-целлюлозном гелях имеет преимущества перед электрофорезом на бумаге. В настоящее время предпочтение часто отдают электрофорезу в полиакриламидном геле, однако этот метод применим, вероятно, только для мелких вирусов (см. гл. IV, разд. В). [c.43]

Для приготовления образца смешивают в маленькой пробирке 3 мкл красителя (0,05%-ного раствора бромтимолового синего), 1 каплю глицерина, 5 мкл р-меркап-тоэтанола и 50 мкл раствора А (см. ниже). Затем добавляют 10—50 мкл раствора белка, смесь перемешивают и наносят на поверхность геля. Раствор А, разбавленный в соотношении 1 1, осторожно наслаивают на образец до самого верха пробирки. Электродные сосуды заполняют буфером раствора А, разбавленным в два раза. Используют трубки размерами 10 смХб мм [80]. Электрофорез проводят при постоянном токе, причем сила тока составляет 8 мА на 1 трубку. Разделение продолжается в течение 4 ч. После электрофореза гели из- [c.273]

Бирд и Джексон [121] несколько модифицировали описанный метод и предложили использовать в качестве подложки не стеклянные пластинки, а рентгеновскую пленку, что позволило избежать образования трещин в геле. Разделение они проводили в камере для бумажного электрофореза, а гель накрывали листом целлулоида, слегка смазанного минеральным маслом. [c.61]

Одной 1ИЗ наиболее сложных проблем, возникающих при проведении препаративного электрофореза, является извлечение из геля разделенных компонентов. Для этой цели можно использовать несколько способов агаровый гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию, обработке агаразой [1437]. Однако эта проблема до сих пор еще не решена, так как помимо самого агара в выделенные фракции могут попадать и содержащиеся в геле примеси. Наилучшие результаты были получены при использовашга для элюирования фракций электрофоретического процесса [451]. Местоположение разделенных зон выявляли при помощи реплики на фильтровальной бумаге. Выделение отдельной фракции осуществляли следующим образом. [c.66]

Методические преимущества электрофореза в полиакриламидном геле навели исследователей на мысль о создании таких его вариантов, которые позволили бы определять молекулярную массу макромолекул и в первую очередь белков, В разд. 1.11.1 пoдpoбiю обсуждался вопрос о том, что при электрофорезе в полиакриламидном геле разделение макромолекул зависит как от их размеров, так и от заряда. Отсюда следует, что для определения молекулярной массы необходимо исключить влияние заряда. Для этой цели разработано множество методов, которые можно разделить на две группы. В методах первой группы для определения молекулярной массы используют коэффициент задержки Д. Зависимость между Кт и молекулярной массой изучена еще недостаточно хорошо, и для ее выражения был предложен целый ряд уравнений [б 12, 1106, 1289, 1296]. Хедрик и Смит [538] построили графики зависимости коэффициентов задержки, определяемых по кривым Фергюсона, от молекулярной массы белков и обнаружили между ними линейную зависимость (рис. 75). Поскольку коэффициент задержки является функцией размера, а не массы молекулы [5, 1186, 1366], некоторые белки ведут себя аномально при электрофорезе, если отличаются от большинства других белков по форме молекулы или парциальному удельному объему. Так, например, полимеры ферритина и альбумина дают соответственно более низкие и более высокие значения Кг, чем можно было бы ожидать, исходя из их молекулярных масс [92, 538]. [c.217]

Другой способ осуществления реакции между белками и ДСН после первого этапа электрофореза предложили Метц и Богорад [865, 866]. Они применили процедуру (см. подробное описание в разделе, посвященном электрофорезу рибосомных белков), в которой буфер, используемый при электрофорезе в первом направлении, играет роль концентрирующего буфера в неоднородной буферной системе, применяемой во втором направлении. Сразу же после первого этапа электрофореза гель заплавляют в пластину геля и начинают электрофорез в направлении, перпендикулярном первому, В верхний электродный буфер добавляют ДСН, который под действием электрического поля входит в гель и образует комплексы с белками, разделенными при электрофорезе в первом направлении. [c.231]

Стефан и Фрам [12S5] описали метод перекрестного иммуноэлектрофореза на пластинках размером 5X5 см. При электрофорезе в первом направлении в круглые лунки, вырезанные в-геле, вносят три параллельных образца. После электрофореза гель разрезают и полоску с электрофореграммой одной из крайних проб оставляют на пластинке, а две другие полоски переносят во влажную камеру и сохраняют в качестве резерва. На освободившуюся поверхность пластинки наливают золь агарозы, содержащий антитела, и проводят электрофорез во втором направлении, перпендикулярном первому. Авторы использовали стандартную кам еру для имм-уноэлектрофореза. Вееке [1385] описал аналогичный вариант данного м)етода. Электрофорез в первом направлении проводят на пластинках размером 10Х Х10 см. На каждой пластинке делают по восемь канавок (IX Х(3 мм) для образцов. После первого разделения полоски (1X5 ем) переносят на пластикки размеров 5X5 см для элект- [c.258]

Для локализации эндодезоксирибонуклеазной активности Грдина и др., [471] разработали чувствительный метод, позволяющий определять 5 пг панкреатической ДНКазы I. В качестве субстрата в полиакриламидный гель включали 7 мкг/мл ковалентно замкнутой двухцепочечной ДНК или открытой кольцевой ДНК. Электрофоретическое разделение проводили при pH 8,9. После электрофореза гели инкубировали в охлажденном 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,0), содержащем 0,005 М Mg b. Затем [c.294]

Наиболее часто для определения фенотипа трансферрина используют электрофорез в крахмальном геле. Разделение проводят в боратном буфере Смитиса [1199] или в неоднородной трис-цитратной системе Паулика [1028]. Для установления фенотипа трансферринов животных применяют и другие буферные системы, в частности систему Аштона и Брейдена [65]. Спунер и Бакстер [1221] использовали буфер трис-какодиловая кислота (pH 7,45). Кроме того, с этой целью проводят электрофорез в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере при pH 8,8 [960] или при pH 9,3 [1275]. Наличие в сыворотке человека того или иного вариантного трансферрина обнаруживают также с помощью электрофореза в агаровом геле [630], а для подтверждения полученных результатов осуществляют во втором направлении иммуноэлектрофорез [424]. Однако в этом случае картина оказывается менее четкой, чем при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле. В последнее время стали применять другой подход вначале сыворотку подвергают изоэлектрофокусированию в геле из специальной марки агарозы (лишенной электроэндосмоса), а затем проводят электрофорез в геле, содержащем антитела [492, 631]. [c.346]

Рис. 121. Влияние объема пробы на разделение РНК при электрофорезе в экспоненциальном градиенте концентрации полиакриламидного геля (2—6%) Г876]. На гели А к Б наносили 50 мкл пробы, а на гели В и Г—800 мкл. Через 9 ч (Л и 5) и 18 ч (А и Г) после начала электрофореза гели сканировали в УФ-свете I — поглощение при 260 нм II — поглощение при 260 ни контрольных (ненагруженных) гелей.

Нуклеиновые кислоты также разделяют в капиллярах объемом 1 — 10 мкл [915, 1223, 1444]. Таким путем можно анализировать 1—5 мг ткани, содержащей 0,1 мкг нуклеиновых кислот. Наилучшие результаты были получены при использовании очень крутых градиентов концентрации полиакриламидного геля, на нижнем конце которого достигалась концентрация 30— 50%. Добавление пиронина Y (конечная концентрация 0,02%) к слою буфера, покрывающего образец, позволяет визуально следить за разделением нуклеиновых кислот во время электрофореза. В микрометоде, так же как при электрофорезе в обычном масштабе, разделение улучшается, если в буфер добавляют ЭДТА. Следует, однако, отметить, что в присутствии ЭДТА пиронин не окрашивает нуклеиновые кислоты. После завершения электрофореза гели выдавливают непосредственно в красящий раствор через отрезок полиэтиленового шланга, при- [c.388]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Расщепление этого фрагмента на более мелкие с помощью эндонуклеаз рестрикации и мечение образовавшихся концов (с помощью полинуклеотидкиназы и РуАТФ или при застройке липких концов большим фрагментом ДНК-полимеразы I, сохранившим полимеразную, но не экзонуклеазную активность — см. гл. 6 — в присутствии нуклеозидтрифосфатов, один из которых мечен Р в а-положении). На этом этапе обычно получаются фрагменты, меченные с обоих концов, поэтому каждый меченый фрагмент выделяют из геля и либо подвергают электрофорезу для разделения цепей, либо гидролизуют еще одной рестриктазой для получения субфрагментов, несущих Р только с одного конца. [c.285]

Другой крайностью является использование миниатюрного ультра-тонкого (50 мкм) геля, заливаемого между предметными стеклами для микроскопа, размерами 25 х 75 мм [Stein et al., 1998], Электрофоретической камерой для такого геля служил обычный прибор для горизонтального агарозного электрофореза, время разделения в котором составляло около 6-7 мин. Несмотря на столь малые размеры геля авторам цитируемой работы при использовании в качестве метки радионуклида 35 удалось прочитать с рентгеновской пленки после 16-часовой экспозиции более 150 нуклеотидов. [c.171]

Наряду с разделением белков по величине электрофоретической подвижности ири использовании указанных носителей имеет значение молекулярно-ситовой эффект геля и размеры молекул Оелка ири прохождении их через ячеистую структуру геля. Так, если при электрофорезе иа бумаге белки сыворотки разделяются на 4—5 четких зон, то в полиакриламидном геле выявляется 13—16 полос, соответствующих отдельным белкам (рис. 98). [c.219]

Зависимость суммарного заряда на полипептиде или белке от изменения pH среды можно использовать для разделения этих молекул с помощью электрофореза. Если смесь полипептидов в водном буферном растворе с известным значением pH подвергнуть воздействии сильного электрического поля, то молекулы с общим положительным или отрицательным зарядом будут перемен аться в противоположных направлениях, в то время как молекулы с нулевым зарядом при выбранном pH останутся ненодвижными. Сложную смесь белков можно раз-де. шть на компоненты, осуществляя электрофорез па бумаге, пропитанной буфером, или в гель-нроводящей пленке. Подвижность состав[1ых частей смеси или паправлспие их перемещения П[)и э. ектрофорезе зависят от значения pH, при котором проводится процесс. [c.300]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология