Аминокислоты, интенсивность окраски

В маленькой пробирке растворяют несколько кристаллов или одну каплю вещества в 1 мл воды или хлороформа. Встряхивая, добавляют 1 каплю 1%-ного водного раствора РеС .,. В присутствии 4 -нольного гидроксила тотчас же появляется интенсивная окраска. Енолы в этих условиях дают лишь слабое окрашивание. О реакции с аминокислотами см. разд. 14, ж. [c.113]

Количественное определение аминокислот путем измерения интенсивности окраски пятен на хроматограмме денситометром. После определения концентрации аминокислоты визуальным методом проводят ее определение путем измерения интенсивности окраски пятен, полученных при хроматографировании растворов известных концентраций и растворов, концентрации которых неизвестны, с помощью денситометра (стр. 99). Из хроматограммы вырезают полоску с пятнами определенной аминокислоты и проводят измерение интенсивности ее окраски по всей длине. С помощью планиметра определяют площадь пиков для известных и неизвестных концентраций выбранной аминокислоты и строят калибровочный график, по которому определяют неизвестную концентрацию иС следуемой аминокислоты. [c.117]

Бумагу из каждого вырезанного пятна измельчают ножницами отдельно над кусками чистой бумаги на части размером не более 3 мм каждая. Измельченную бумагу от каждого пятна количественно переносят в отдельную пробирку. В каждую добавляют точно пипеткой по 10 мл насыщенного раствора сульфата меди в 75%-ном этаноле. Пробирки ставят в штативе в темное место на 1 ч, время от времени перемешивая их содержимое. Образуется красное внутрикомплексное соединение, которое экстрагируется этанолом из волокон бумаги. Интенсивность окраски раствора пропорциональна содержанию аминокислоты в пятне. [c.529]

На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя синефиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) пропорциональна количеству аминокислоты [c.41]

Этот метод представляет особую ценность для тех пептидов, которые не дают хорошей окраски с нингидрином. Интенсивность окраски приблизительно пропорциональна числу пептидных связей, хотя иногда чувствительность может быть довольно далека от ожидаемой. Пептиды, в состав которых входят главным образом плохо обнаруживаемые этим методом аминокислоты, часто также не удается обнаружить. [c.395]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

При энергичном воздействии едких щелочей белки подвергаются глубоким изменениям. Помимо частичного гидролиза по пептидным связям, наблюдается отщепление части аминогрупп в виде аммиака. При наличии в молекуле белка цистина или цистеина из этих аминокислот постепенно отщепляется также сера в виде сероводорода, переходящего в щелочной среде в сульфид его образование обнаруживается действием солей свинца по интенсивной окраске...не-растворимого в щелочах сернистого свинца [c.359]

Метод визуального сравнения. На полученных хроматограммах проводят визуальное сравнение пятен анализируемого и стандартных растворов по размеру и интенсивности окраски, на основании чего делают вывод о концентрации определенной аминокислоты. При наличии планиметра определяют концентрацию аминокислоты в анализируемом растворе, измеряя площади пятен. Для этого строят калибровочную кривую зависимости на- [c.149]

При использовании денситометрического метода интенсивность окраски вещества в зоне измеряется непосредственно на хроматограмме. Впервые этот метод был использован для измерения концентрации аминокислот, разделенных на группы с помощью электрофореза, а позже — в хроматографии на бумаге для определения аминокислот, сахаров и стероидов. [c.79]

Белки также дают эту реакцию. При добавлении к раствору белка нингидрина и нагревании его до кипения получается синее окрашивание. Растворы белка дают, однако, менее интенсивную окраску, чем растворы аминокислот в той же концентрации. [c.279]

Нингидриновая реакция. Реакция эта была нами описана уже выше в главе, посвященной аминокислотам. Белки также дают эту реакцию. При добавлении к раствору белка нингидрина и нагревании его до кипения получается синее окрашивание. Растворы белка дают, однако, менее интенсивную окраску, чем растворы аминокислот в той же концентрации. [c.282]

КИСЛОТНЫХ анализаторов. Эти аппараты автоматически разделяют аминокислоты на ионообменной колонке, собирают их, добавляют нингидрин и нагревают смесь для развития окраски, после чего измеряют интенсивность окраски и регистрируют ее в виде графика. На фиг. 11 приведена типичная запись результатов автоматического хроматографического анализа смеси аминокислот. Положение пика, отвечающего канедой из аминокислот на хроматограмме, строго фиксировано, причем измерение площади пика позволяет определить содержание соответствующей аминокислоты. Точность такого анализа (занимающего несколько часов) составляет обычно 2%. [c.58]

Интенсивность окраски мятки уменьшается после ее обезжиривания. Специфическая интенсивность окраски хлопковой мезги и жмыха объясняется нерастворимыми в органических растворителях продуктами взаимодействия госсипола с белковыми веществами и аминокислотами. [c.238]

Способностью восстанавливать реактив Фолина в синее соединение обладает не только свободный тирозин, но и белок. Можно было бы ожидать, что интенсивность окраски, возникающей при взаимодействии реактива Фолина с белком, пропорциональна содержанию в белке тирозина и цис-теина. В действительности, оказалось, что если белок обработать предварительно солями меди, то даваемая им с реактивом Фолина окраска намного превышает ту, которую могли бы дать только названные аминокислоты. Считают, что в составе белковой молекулы, образовавшей медный комплекс, с реактивом Фолина взаимодействуют также и другие аминокислоты, а поэтому интенсивность возникающего окрашивания в известной мере пропорциональна содержанию белка. Лоури и сотрудники использовали этот принцип для количественного определения белка. [c.45]

Следующая часть этого раздела посвящена оценке результатов. В процессе анализа аминокислот оценивается интенсивность окраски (обычно при 570 нм) продуктов реакции аминокислот с нингидрином. В начале элюирования самописец регистрирует только нулевую линию, которая может сдвигаться при изменении состава подвижной фазы. Если проводится количественный анализ, такие сдвиги следует учитывать. Интегратор обрабатывает сигнал детектора очень быстро (40— 2000 имп/с), в результате чего регистрируется прохождение даже одиночного компонента. В интеграторе можно предусмотреть автоматическую коррекцию нулевой линии, и он начнет интегрирование, только когда нулевая линия существенно изменится за несколько секунд. Некоторые управляющие элементы, которые ранее являлись частью анализатора, теперь функционально включены в интегратор. Чтобы результаты расчета были правильными, важно принять во внимание форму пиков. [c.75]

Более точным является метод, основанный на применении градуировочного графика S —Ig , где S — площадь пятна, с — концентрация. В указанных координатах график линеен. Используется также измерение интенсивности окраски пятна, которая пропорциональна концентрации. Методами распределительной жидкостной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, смеси красителей и т. д. [c.350]

Интенсивность окраски пропорциональна содержанию аминокислот. [c.36]

Для количественного анализа проводят определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски нли раз иерам пятен хроматограмм, а также путем элюирования аминокислот из отдельных пятен и последующего определения нх классическими количественными методами анализа. [c.299]

Реакция Лоури. Это одна из наиболее чувствительных реакций (Ш белки. 1и дают циклические аминокислоты. Реагируя с реактивом Фолина, они образуют комплексы, окрашенные в синий цвет. Интенсивность окраски зависит от концентрации белков, поэтому реакции Лоури может бы1ъ использована и для количественного определения. [c.9]

Новый метод анализа аминокислот быстро развивался. Появилась возможность с его помощью приступить к решению ряда сложных, казавшихся неразрешимыми проблем, и прежде всего проблёмы определения первичной структуры белков. Вскоре стало очевидным, что анализ аминокислот в его первоначальном варианте слишком трудоемок и недостаточно эффективен. Ввиду этого был поставлен ряд исследований по механизации трудоемких операций и совершенствованию организации эксперимента. Основной вклад в решение этих задач вновь внесла группа исследователей под руководством Мура и Стайна [4]. Благодаря проведению реакции аминокислот с нингидрином в проточном капиллярном реакторе и измерению интенсивности окраски на регистрирующем проточном фотометре трудоемкая обработка фракции была преобразована в непрерывный процесс. Таким образом, на основе аналитического метода был создан новый прибор — аминокислотный анализатор. Выпуск и дальнейшее усовершенствование этого прибора были предприняты промышленными фирмами. Последующие усилия были направлены на повышение эффективности и чувствительности анализа. Первое время причиной низкой эффективности прибора служила длительность элюирования. Основой для дальнейшей оптимизации процесса послужила теоретическая работа Гамильтона [5], в которой было показано, что повышения эффективности можно достигнуть путем увеличения скорости подачи элюента и уменьшения размеров зерен ионита. В результате многочисленных модификаций ионитов (а эта работа все еще продолжается) удалось более чем в 10 раз сократить время элюирования без снижения разрешения. Сокращение продолжительности анализа [c.306]

При колориметрическом определении аминокислот во фракциях из хроматографических колонок в качестве стандартов используют. хроматографически чистые образцы отдельных аминокислот, дающих с нингидриновым реагентом окраску, близкую по интенсивности к теоретической. Такими аминокислотами являются лейцин, изолейцин и аланин. При последующих расчетах интенсивность окраски различных аминокислот выражают в так называемых лейциновых единицах. Эти данные используют для вычисления истинного содержания той или иной аминокислоты в образце. [c.342]

Результаты хроматографического разделения аминокислот регистрируются на диаграммной ленте в виде профиля элюирования, где на оси абсцисс откладываются объем элюата, на оси ординат — количество вещества в отдельных фракциях. Симметричные пики соответствуют отдельным аминокислотам базовая линия — фракциям, не содержащим нингидринположительных компонентов. При расчете содержания вещества в отдельных фракциях из полученных величин вычитают среднее значение высоты базовой линии, соответствующее данному пику. Среднюю высоту базовой линии определяют, соединяя прямой значения фона до и после пика и отсчитывая величину, соответствующую полуширине пика. Среднюю высоту базовой линии умножают на число фракций, соответствующих данному пику, и вычитают из суммарного содержания вещества в зоне таким путем получают количество вещества в данном пике в пересчете на лейцин. Чтобы определить истинное содержание данной аминокислоты, эту величину умножают на фактор, который носит название лейцинового эквивалента и представляет собой отношение интенсивностей окраски данной аминокислоты и лейцина в стандартных условиях. Данные, соответствующие отдельным аминокислотам, приведены в табл. 32.9. [c.352]

В обычном варианте метода благодаря низкому фону пептиды удобно детектировать в виде ТНФ-производных. При автоматическом анализе аминокислоты и пептиды определяют в виде комплекса Мейзенхаймера, обладающего более интенсивной окраской [9, 10]. [c.394]

Растворяют 1 каплю вещества ъ Ъ мл спирта и добавляют 1—2 капли 1%-ного водного раствора хлорного железа. Положительной реакцией служит появление окрашивания (от кроваво-красного до василькового у алифатических енолов, от синего до фиолетового у фенолов, от красного до красно-фиолетового у гидроксамовых кислот и открасногодо красновато-коричневого у нитроловых кислот). В отличие от алифатических енолов фенолы дают эту цветную реакцию только в присутствии воды. У алифатических енолов, напротив, в водных растворах интенсивность окраски уменьшается (см. также стр. 459). Оксимы, а-оксикислоты и а-аминокислоты также часто дают окрашивание с хлорным железом. Однако в этих случаях окрашивание наблюдается только после добавления больших количеств соли железа и имеет значительно меньшую интенсивность. Для уверенности следует, как и в случае других цветных реакций, провести контрольный (глухой) опыт. [c.577]

За последний год предложен целый ряд методов количественного определения аминокислот, обнаруженных после разделения на бумаге. Существует метод [16] сравнения интенсивности окраски и размера обнаруженных пятен со шкалой стандартных пятен, полученных от хроматографии определенного количества стандартной аминокислоты на этой же полосе бумаги. Однако эти определег1ия дают только приблизительный результат. [c.404]

Интенсивность окраски зависит от количества серусодер-жащих аминокислот в белке и от концентрации белка в растворе. [c.20]

Интенсивность окраски дикетогидриндилидендикетогидрин-диамина пропорциональна содержанию аминокислот. [c.173]

Интенсивность окраски реакционной смеси, получающейся при добавлении нингидринового реагента к эффлюенту, измеряется проточным колориметром в условиях постоянной скорости потока жидкости. Возникающее изменение напряжения на фотоэлементе регистрируется самописцем. Обычно выходное напряжение колориметра на самописец составляет О—5 мВ. При максимальном развитии окраски (наивысшая оптическая плотность, ОП) напряжение равно нулю, а при отсутствии, за исключением фона реагентов (фоновая линия), напряжение составляет 5 мВ. Для точной записи результатов хроматографического анализа самописец должен а) точно реагировать только на сигнал фотоэлемента калориметра б) допускать длительную работу с минимальным дрейфом из-за тепловых и электрических помех в) иметь постоянную скорость лентопротяжного механизма для обеспечения точной идентификации пиков по времени. Если запись на самописце производится на диаграммной бумаге с линейной шкалой, то для расчета пиков аминокислот или пептидов необходим шаблон с нанесенной сеткой ОП. Если самописец снабжен диаграммной бумагой со шкалой в единицах ОП или логарифмической шкалой, величина поглощения находится непосредственно. Другими вспомогательными элементами, которые связаны с записью анализа и считаются составными частями системы регистрации, являются устройства, осуществляющие расширение шкалы, логарифмирование сигнала, интегрирование пика, а также цифропечать и связь с ЭВМ. Расширение шкалы представляет собой метод, по которому вся шкала самописца может быть легко заменена с О—5,0 мВ на 4,0—5,0 или 4,5— [c.32]

Р-Нафтохинон-4-сульфокислота, применявшаяся Фолиным [98, 99] для анализа аминокислот в моче и крови, обладает умеренной реакционной способностью [100]. При реакции с аминогруппой желтая окраска, свойственная реагенту, очищенному по методу Фолина [98], переходит в желтовато-коричневую. В ходе реакции происходит арилирование аминогруппы с отщеплением сульфогруппы реагента. Определение проводят в несколько стадий [100] вначале инкубируют без доступа света реакционную смесь, включающую раствор белка, бикарбонатный буфер (pH 8,8), диоксан и раствор НХС в 50%-ном метаноле, а затем добавляют уксусную кислоту и диоксан. Далее определяют разницу в величине поглощения при 480 нм рабочего и контрольного раствора, не содержащего белка Аб48о = 3800 М см Ч При инкубации контрольный раствор приобретает интенсивную окраску, однако он почти полностью обесцвечивается при последующем подкислении уксусной кислотой. Окраска, свойственная производным по аминогруппе, не исчезает при подкислении. Присутствие диоксана до и после подкисления предотвращает осаждение модифицированного белка. В табл. 3 сопоставлены результаты модификации аминогрупп ряда белков с помощью НХС и некоторых других реагентов. [c.360]

Аммиачная соль енольной формы этого соединения окрашена в интенсивный красно-фиолетовый или пурпурно-синий цвет. Оказалось, что в определенных пределах интенсивность окраски пропорциональна количеству аммиака, участвующему в реакции, и, следовательно, исходному количеству аминокислоты. Эта реакция широко используется для качественного и количественного определения аминокислот, особенно методом хроматографии на бумаге, и очень чувствительная позволяет устанавливать содержание тысячных долей миллиграмма аминокислот. Нингидрин может быть заменен изатином, имеющим близкое строение [c.191]

Реакция с нингидрином. При взаимодействии с нингидри-ном аминокислоты разрушаются с выделением аммиака, углекислоты и образованием альдегидов. Два остатка нингидрина, связанных друг с другом азотом аммиака, освободившегося при распаде аминокислоты, образуют сложное соединение, обладающее сине-фиолетовой окраской. Интенсивность окраски пропорциональна количеству имеющейся в растворе аминокислоты. Реакция эта очень чувствительна и широко используется в настоящее время для количественного определения аминокислот хроматографическим методом (с этим методом учащемуся предстоит знакомиться в курсе биологической химии). [c.242]

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Весьма существенна зависимость интенсивности окраски раствора от времени проведения реакции, т. е. от времени нагревания. Графически эта зависимость представляет собой кривую с максимумом, характерную для консекутивной реакции, указывающую на то, что в данном случае одновременно протекают, по крайней мере, две реакции образование окрашенного соединения (ди-кетогидриндилидендикетогидринамина) и разрушение его с образованием неокрашенных продуктов. Интересно, что увеличение концентрации нингидрина в реакционной смеси, способствуя более полному протеканию первой реакции, в то же время ускоряет вторую, т. е. избыток нингидрина разрушает образующееся окрашенное соединение. Вследствие этого чувствительность реакции аминокислот с нингидрином в водном растворе сравнительно невелика. Таким способом можно определять аминокислоты в количествах 25—80 мкг и более в пробе (в пересчете на аминный азоту. Окраска раствора неустойчива и развивается довольно неравномерно. Более равномерное развитие окраски наблюдается при связывании образующегося в результате реакции аминокислот с нингидрином соединения в комплекс с ионами некоторых тяжелых металлов, например с ионами двувалентного кадмия. [c.64]

Количественное определение аминокислот. После получения хроматограмм количественно определять отдельные аминокислоты можно двумя методами при помощи нингидриновой реакции с метилцеллосольвом (мономе-тиловый эфир этиленгликоля) и по интенсивности окраски медных производных аминокислот с нингидрином. [c.42]