Иммобилизованные ферменты активность

Для промышленных целей иммобилизуют ферменты в основном микробного происхождения ввиду их доступности, дешевизны (они в 100 раз дешевле, чем ферменты животного и растительного происхождения), независимости массового производства от сезона вегетации растений или сроков выращивания животных, короткого периода накопления бактериальной массы для вьщеления ферментов. Важно, что иммобилизация, как правило, сопровождается повышением в тысячи и десятки тысяч раз стабильности ферментов, что создает условия для их использования в качестве гетерогенных катализаторов. Кроме того, механическое изменение матрицы, на которой закреплен фермент, открывает возможность варьировать его активность и понять принцип работы природных механохимических систем. [c.141]

Фермент иммобилизуют путем ионного связывания на колонке с носителем (метод 3, рис. 12.28). После непрерывной автоматизированной работы в течение 30 дней при 50 °С активность фермента снижается до 40% для восстановления активности добавляют свежий фермент. В результате благодаря иммобилизации экономится 40% фермента. [c.93]

Благодаря высокой активности и специфичности Ф. к. находит применение в пром-сти. Широко примен. протеолитические ферменты, липазы, глюкозооксидаза, каталаза и др. Новые успехи в пром. применении Ф. к. связаны с получ. т. н. иммобилизов. ферментов, искусственно связанных с нерастворимыми в воде носителями и длительно сохраняющих (полностью или частично) каталитич. св-ва. Иммобилизов. ферменты фактически являются гетерог. биокатализаторами, к-рые м. б. использованы в колонках или проточных аппаратах, что позволяет перевести мн. хим. процессы на непрерывный режим. Получение иммобилизов. ферментов и их примен. для технол. целей входит в круг проблем, решаемых инженерной энзимологией. [c.617]

Все перечисленные выше методы являются физико-химическими. Однако в настоящее время для получения многих лекарств широкое применение нашли биотехнологии. Например, иммобилизованные ферменты позволяют быстро, специфично и без побочных продуктов (являющихся главным недостатком химического синтеза) осуществлять синтез биологически активных веществ (о том, как иммобилизуют ферменты, см. главу 2). Так, иммобилизованная пенициллинамидаза используется для промышленного получения 6-аминопенициллановой кислоты, являющейся исходным сырьем в производстве новых полусинтетических пени- / /имяов широкого спектра действия (см. ниже). Производство гормональных препаратов — кортизола и преднизолона осуществляется в колонках, заполненных гранулами нерастворимого носителя с иммобилизованными ферментами. [c.504]

Уменьшение каталитической активности фермента за счет стерических факторов проявляется особенно часто в случае высокомолекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализаторов, действующих на белки, нуклеиновые кислоты и другие природные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой. Стерические ограничения иногда удается уменьшить или даже полностью устранить путем деградации носителей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кислотами и т. п.) или специальными ферментами (декстраназой, цел-люлазой и др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затронула первичную структуру и не нарушила пространственную организацию ферментов, пришитых к носителю. [c.108]

Хотя из уравнения реакции и не следует, для инициации реакции необходимо лишь небольшое количество АТР (меньше чем 1/1000 по массе), поскольку реакция поддерживается образующимся АТР. Три фермента иммобилизованы на сшитом полиакриламидном геле путем взаимодействия их первичных аминогрупп с активными эфирами на поверхностн полимера. [c.138]

Вообще говоря, возможны четыре типа факторов, определяющих каталитическую активность фермента. Во-первых, необходим химический аппарат в активном центре, способный деформировать или поляризовать химические связи субстрата, что делает последний более реакционноспособным, во-вторых,— связывающий центр, иммобилизующий субстрат в правильном положении к другим реакционным группам, участвующим в химическом превращении, в-третьих,— правильная и точная ориентация субстрата, благодаря которой каждая стадия реакции проходит с минимальным колебательным или вращательным движением вокруг связей субстрата, и, наконец, в-четвертых, способ фиксирования субстрата должен способствовать понижению энергии активации ферментсубстратного комплекса в переходном состоянии. Соответствующее распределение зарядов в активном центре и геометрия активного центра входят в число факторов, определяющих снижение суммарной энтропии переходного состояния. Все эти факторы в той или иной степени влияют на структуру активного центра фермента, и их нельзя рассматривать изолированно, вне связи друг с другом. В совокупности они увеличивают скорость ферментативной реакции и позволяют ферменту выступать в роли мощного катализатора [77]. [c.209]

Для удобства применения холинэстеразы иммобилизуют в по.шмер-ные пленки или гели. При этом существенно увеличивается устойчивость фермента к влиянию внешних факторов. Так, при иммобилизагщи холинэстеразы в желатиновый гель срок ее хранения составляет 2-3 года, а при непрерьганой работе активность препарата падает на 20% лишь через 10 дней. Наряд) с повьпиением стабильности иммобилизация хо.пинэстераз обеспечивает многократное использование препарата. Заметим, что при определении необратимых ингибиторов, например фосфорорганических пестицидов, повторное использование фермента в каждом случае требует специальных исследований В качестве реактиваторов применяют гидро-ксиламин, оксимы и др [c.290]

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Ферменты адсорбировались на поверхности кремнезема, и было обнаружено сохранение их активности. Но тот факт, что митохондрии (частицы, представляющие собой образования, выделяемые из живых клеток, и состоящие из сложных ферментных систем) можно подобным же образом иммобилизовать на кремнеземе, дает возможность раскрыть целые новые области исследований в биохимии [652а]. Другие содержащие мембраны частицы, или органеллы, могут аналогичным образом фиксироваться на кремнеземе, например в виде хлоропластов и микро-сом печени. Поверхность кремнезема должна быть прежде всего превращена в органофильную посредством ее обработки с нанесением алкилсилильных групп. Затем подобные биологические образования могут прилипать к поверхности, давая монослойное покрытие при температуре около 27°С, но они способны десорбироваться при 5°С. Природа такого эффекта непонятна, но можно сделать предположение, что поскольку водородные связи становятся более прочными при 5°С, то вода тем или иным образом вытесняет эти частицы с поверхности, которые должны удерживаться на ней гидрофобными связями. Подобные гидрофобные связи имеют место, и они используются для закрепления ферментов на кремнеземной поверхности [6526]. [c.831]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Влияние на ферментативную активность гидрофобности носителя исследовано Иохансоном и Мосбахом [26]. На матрицах с различной степенью гидрофобности (полученных с использованием сополимера акриламид—метилметакрилат) была иммобилизована алкогольдегидрогеназа. Кт(каж) для н-бутанола в качестве субстрата смещались в сторону более низких значений пропорционально возрастанию гидрофобного характера препаратов сополимера, с которым фермент был связан. [c.431]

Для иммобилизации ферментов применяют растворы полиэлектролитов, способные к фазовому разделению при определенных условиях. Запатентован способ иммобилизации большой группы ферментов (более 10) путем смешения растворов хитозана и фермента с последующим осаждением комплекса щелочью либо ионами SOl с полным сохранением ферментативной активности белка (пат. 4167447 США). Аналогичным способом с использованием хитозана была иммобилизована уреаза (пат. 80—74794, 1980 Япония). Из кислого раствора фермента и хитозана отливали пластинки, которые после высушивания выдерживали в боратном буфере. Полученная пластинка имела удельную активность 0,08 ед/см . С помощью водорастворимого карбоди-имида на хитозане иммобилизовали глюкозоизомеразу [102]. Таким образом, процесс иммобилизации не вызывает инактивации фермента, более того, такая обработка снижала степень инактивации фермента ионами металлов. [c.127]

Книга посвящена методам иммобилизации ффментов, т. е, закреплению их на матрицах — полимерах, что позволяет стабилизировать и усиливать активность ферментов. Иммобилизо-шанные ферменты находят все более широкое применение кав в научных исследованиях, так, и в промышленной биотехноло [c.343]

В последние годы активно развиваются методы иммобилизации, позволяющие ковалентно пришивать молекулу кофактора в районе активного центра фермента или совместно иммобилизовать молекулы кофактора и фермента на одном носителе в непосредственной близости друг от друга. С помощью таких методических приемов становится возможным подавить такой инактивационный механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермента. [c.127]

Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются вследствие окисления кислородом воздуха высокореакционноспособных функциональных групп их активного центра и в первую очередь SH-rpynn. Такую инактивацию также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммобилизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью высаливать кислород. В результате фермент экранирован от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению к окислению становится существенно выше, чем у неиммоби-лизованного. [c.127]

Основные вопросы, связанные с иммобилизацией белков. При рассмотрении вопросов, связанных с иммобилизацией белков, в первую очередь необходимо отметить, что при иммобилизации белок частично денатурируется, то есть, по наиболее общему определению, изменяет в какой-то степени свои первоначальные (нативные) характеристики. Эти изменения происходят как под воздействием физико-химических условий синтеза (температура, состав и концентрация модифицирующего раствора), так и в результате ковалентной межмолекулярной сшивки. Поэтому условия синтеза гетероповерхностного сорбента, предназначенного для анализа биологических проб с прямым вводом, следует подбирать таким образом, чтобы, с одной стороны, не происходило значительных изменений нативной глобулярной структуры белка для создания максимально однородного внешнего покрытия частиц, а с другой — чтобы уже иммобилизованный белок был лишен детерминантных групп (активных центров) для устранения возможных биоспеци-фических взаимодействий с содержащимися в пробе белками. Хотя для иммобилизации используются преимущественно инертные белки (например, сывороточный альбумин), их инертность весьма относительна. Но, по крайней мере, такое допущение принимается по сравнению со специализированными белками. Примерно в половине работ, посвященных созданию селективных электродов и сорбентов при иммобилизации ферментов, последние иммобилизуются совместно с альбуминами или коллагеном, либо на их матрицы. [c.544]

В идеале поверхность иммунореактивной индикаторной полоски должна быть однородной, не склонной к неспецифическим взаимодействиям и пригодной для контролируемой иммобилизации различных веществ с помощью удобных методов. В качестве матрицы для ковалентной иммобилизации реагентов мы выбрали листы хроматографической целлюлозы, так как они обладают подходящими химическими и физическими характеристиками. Целлюлоза гидрофильна, достаточно однородна, ей несвойственно неспецифическое связывание. Кроме того, она доступна в виде листов разной толщины и плотности. На целлюлозе с помощью целого ряда хорошо отработанных методов (Lilly, 1976) можно иммобилизовать большие количества ферментов и антител. Это позволяет получать индикаторные полоски, обладающие высокой стабильностью и иммунологической активностью. [c.132]

РОН-синтетазу из везикулярных желез иммобилизовали на DEAE-сефадексе. В результате обработки иммобилизованного фермента раствором 2,6-10- М индометацина в течение часа актив-ность фермента падала до 23% после отфильтровывания и промывки иммболизованного фермента буферным раствором его активность увеличивалась и составляла 70% от исходной. [c.8]

Согласно другой процедуре, реагенты частично иммобилизуются для этого их вносят в раствор, полимеризующийся затем с образованием геля (например, геля агара, который помещают на поверхность электрофоретического геля) или ими пропиты-.вают фильтровальную бумагу. В этих случаях можно локализовать сложную цепь реакций, инициируемых определяемым фер- ментом, так как даже тогда, когда видимый продукт растворим, он не может быстро диффундировать наружу. Процессы, ана- логичные тем, которые протекают при измерении ферментативной активности сопряженными методами (см. разд. 8.3), тоже можно использовать для локализации ферментов так, образование или окисление NAD(P)H можно наблюдать в ближнем ультрафиолете (сине-зеленая флуоресценция). Для качественного обнаружения ферментов в геле часто применяют такие химические методы, которые обычно не используются для определения ферментативной активности в растворе. Например, освобождение фосфата под действием различных фосфатаз может быть замечено по появлению осадка фосфата кальция [192]. Если же этот осадок не очень отчетливо виден, то после отмывания избытка реагентов его можно превратить в фосфат евин- [c.328]

Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор АМР с газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата. Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного АМР-электрода, описанного в работе [35]. Используемый в этом сенсоре выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы. Чувствительность и срок службы сенсора АМР можно значительно улучшить при помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности биокатализатора на поверхности датчика. [c.43]

Аналитические характеристики пируватных сенсоров на основе ткани кукурузного зерна и выделенного фермента приведены в табл. 3.6. Использование кукурузного зерна в качестве биокатализатора улучшает такие параметры сенсора, как наклон и диапазон линейности градуировочной кривой, а также предел обнаружения. С другой стороны, ферментная система имес меньшее время отклика. Для уменьшения времени отклика тканевого электрода была предпринята попытка фракционировать зерна, с тем чтобы иммобилизовать только их активные компоненты. К сожалению, эта попытка оказалась неудачной, поскольку фермент равномерно распределен по большей части зерна. [c.49]

Наряду с цельными фрагментами тканей млекопитающих в биосенсорах можно эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике. Митохондрии содержат два изофермЬнта глутаминазы [15], активность которых и используют в глутаминовом биосенсоре. [c.53]

Глюкозооксидазу (в чистом виде или в смеси с каталазой) иммобилизуют на платине, пористом графите или золоте. Такая система дает непосредственный потенциометрический сигнал в растворах глюкозы при pH 7,4. Методика приготовления может быть, например, следующей. В буферном растворе фосфата натрия (pH 7,4) смешивают каталазу, лиофилизованную глюкозооксидазу из А. тдег, бычий сывороточный альбумин и глутаровый альдегид. Смесь выливают в формочку, в которой находится диск из платиновой фольги толщиной 0,05 мм. Толщину поперечно-сшптой фермент-альбуминовой матрицы можно менять с помощью прокладок на дне формы, например от 0,05 до 0,32 см. При комнатной температуре сшивка белков глутаровым альдегидом длится 2 ч. Перед проверкой ферментативной активности или потенциометрическими измерениями сшитый глутаровым альдегидом слой отмывают буферным раствором в течение 1-2 дней, чтобы удалить слабосвязанный фермент [11]. [c.134]

Термоанализ можно применять также и для эпизодического или непрерывного наблюдения за окружающей средой [7] как своего рода антитоксический контроль. При необходимости детектирования определенного токсического соединения в ферментной колонке термистора можно иммобилизовать определенное количество фермента, который ингибируется данным соединением. Тяжелые металлы, например Hg(lI), можно обнаружить уже при содержании до 0,2-10 % по их ингибирующему действию на иммобилизованную уреазу [7]. Концентрацию тяжелых металлов в пробе определяют сравнением температурного отклика на импульсный ввод субстрата (с избытком мочевины) до и после введения пробы. Затем специальной промывкой полностью восстанавливают активность уреазы, что позволяет проводить повторные анализы на той же ферментной колонке. В некоторых случаях можно применять ферменты, которые действуют непосредственно на определяемое вещество. Так, цианид определяют с пределом обнаружения 10 М, используя фермент родаминазу. Возможно даже прямое определение пестицидов и ингибиторов ацетитхолинэстеразы [c.470]

Эта система непрерывно совершенствуется. Так, найдено, что эффективными носителями могут служить Сефароза, активированная цианогенбромидом [11], и найлон-6 [43]. В данной системе иммобилизовано около 25 различных ферментов, причем практически без потери активности как самого фермента, так и испускающих свет компонентов. Используя проточную систему, можно определять NAD(P)H на уровне 6 фмоль. [c.492]

Хлюкоамилаза распространена повсеместно она открыта Е. Л. Розенфельд (1959) в тканях животных, где ярко представлена, как, впрочем, и в плесневых грибах. Из ряда источников глюкоамилаза выделена в гомогенном состоянии. Ее молекулярная масса в большинстве случаев близка к 100000 (у-амилаза из почек человека—97 ООО, из печени быка — 107 ООО, из печени крысы —114 ООО, из гриба аспергилла—всего 62 ООО). Для глюкоамилазы из печени быка доказана мультимерная структура молекулы 4 субъединицы по 26000 каждая. Обнаружено 2 вида глюкоамилаз—кислая (оптимум pH 4,8—5,0, локализована в лизосомах, для гликогена—5,45 10 М) и иейтральнан (оптимум pH6,0—6,5, локализована в микросомальной фракции клетки и в гиалоплазме, для гликогена—16,25 -10 М). Отсутствие кислой глюкоамилазы у человека связано с тяжелым наследственным заболеванием—гликогенозом оно состоит в накоплении гликогена в клетках печени, мышц и других органов. Глюкоамилаза иммобилизована и в этом виде применяется в промышленном масштабе для гидролиза крахмала до глюкозы созданная у нас установка позволяет вести процесс в течение 3 месяцев без заметной потери активности фермента. [c.329]

РОН-синтетазу из везикулярных желез иммобилизовали на ДЭАЭ-сефадексе. В результате обработки иммобилизованного фермента раствором 2,6-10" М индометацина в течение часа активность фермента падала до 23%, после отфильтровывания иммобилизованного фермента и промывки его буферным раствором активность фермента увеличивалась и составляла 80% от исходной. Из этих данных следует, что взаимодействие РОН-синтетазы с индометацином имеет обратимый характер. [c.200]

Компартментация метаболитов мембранной системой "экономит" растворитель в клетке (Хочачка, Сомеро, 1977). Из-за содержания в клетке большого количества различных молекул емкость внутриклеточной водной среды ограничена, поэтому многие ферменты в клетке находятся не в свободном состоянии, а иммобилизованы на мембранах. Со своим субстратом контактирует только активный центр фермента. В результате возрастает надежность функционирования муль-тиферментных комплексов. Встроенные в определенной последовательности в мембраны они участвуют в цепях последовательных превращений метаболитов. Примером могут служить электронтранспортные цепи в мембранах хлоропластов и митохондрий. [c.22]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология